编码美洲螯龙虾肽聚糖识别蛋白（PGRP）cDNA的电子克隆及其生物信息学分析

利用电子克隆方法,获得编码美洲螯龙虾（Homarus americanus）肽聚糖识别蛋白（peptidoglycan recognition protein , PGRP）的cDNA序列及相应的氨基酸序列;采用生物信息学方法对其进行基本理化性质、亲疏水性、信号肽、二级结构、细胞定位、三级结构等的分析。结果获得一段长920 bp的编码美洲螯龙虾PGRP的cDNA序列,包含一个长834 bp的开放阅读框,编码277个氨基酸;编码蛋白是含有信号肽的分泌蛋白,含有1个C端PGRP结构域,表明是一种PGRP;分析结果显示该蛋白与黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）短型PGRP-SC2和PGRP-SD比较相似。     

鲤外周血白细胞蛋白酶体激活因子PA28β全长cDNA的克隆、鉴定及其差异表达分析

采用基因文库筛选方法克隆了鲤鱼外周血白细胞蛋白酶体激活因子PA28βcDNA，对其序列进行了分析，同时利用半定量反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）方法检测了不同外界因子刺激下鲤鱼外周血白细胞PA28β的表达情况。结果显示，用DD-RTPCR的方法获得差异显示片段A18，经地高辛标记作为探针对有丝分裂原刺激的鲤鱼外周血白细胞cDNA文库进行核酸杂交筛选，从0.8×104个重组噬菌体中，经过两轮筛选获得阳性克隆。序列分析表明，该阳性克隆长1175bp,含有一个大小为735bp编码244个氨基酸的完整开放阅读框，为编码鲤鱼蛋白酶体激活因子PA28β的全长cDNA。系统发生分析其与已报道的斑马鱼蛋白酶体激活因子PA28β亲缘关系最近，基因序列的同源性达95﹪。分离培养鲤鱼外周血白细胞，在不同条件下经PHA和ConA刺激后，利用Trizol提取总RNA，根据得到的PA28β全长cDNA序列和鲤鱼β-actin序列设计引物，利用RT-PCR方法对鲤鱼外周血白细胞PA28β进行差异表达分析，结果表明：经有丝分裂原刺激后前期（4h）白细胞中PA28β的表达量明显增大，但随着时间推移(12h、24h)表达增加量有所降低，并不随时间的延长而持续增加。在刺激的和正常的白细胞中PA28β表达趋势都成抛物线图，不同的是经刺激的比正常的PA28β的表达量提前达到峰值。本文属国内外首次报道鲤蛋白酶体激活因子PA28β的全长cDNA序列，鲤鱼PA28β的cDNA序列GenBank注册号为EU255233，并对其进行差异表达分析，这些结果可为PA28β在鱼类免疫应答中的作用研究提供参考和依据。     

草鱼生长激素cDNA基因的克隆及序列分析

通过反转录PCR技术，从草鱼脑垂体的总RNA中获得一特异cDNA片段，经克隆后测序，结果表明，该片段长633bp，与报道的草鱼生长激素基因相比，有10个碱基的差异，而推导的蛋白质仅1个氨基酸残基的差异，推测为草鱼生长激素cDNA基因。     

团头鲂促甲状腺激素β亚基基因的克隆及序列分析

利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增法（RACE）克隆团头鲂（Megalobrama amblycephala）脑下垂体中促甲状腺激素β亚基（TSHβ）基因，并对其基因结构和系统进化进行分析。该基因cDNA序列全长614bp；5’端非翻译区100bp；3’端非翻译区61bp；开放阅读框架（ORF）453bp，共编码150个氨基酸。其编码的氨基酸序列与鳙鱼（Aristichthys nobili5）、鲤鱼（Cyprinus carpio）、金鱼（Carassius auratus）、斑马鱼（Daniorerio）、鲑鱼（Salmo salar）、虹鳟（Oncorhynchus mysiss）、欧洲鳗鲡（A．nnguilla）的相似性分别为：99．3％、92％、92％、82％、62．6％、62．6％和56％。核苷酸序列分析显示，团头鲂与鳙鱼相似性最高，为98．23％；与欧洲鳗鲡相似性最低，为48．7％。说明唧亚基在长期的进化中相当保守。在所比较的9种鱼类该基因ORF氨基酸序列中都含有定位相同的12个半胱氨酸残基，它们在成熟肽中形成6个二硫键，这对保证促甲状腺激素的空间结构，维持促甲状腺激素的生理功能起着重要的作用。该基因的成功克隆不仅为TSHβ的分子进化和相似性比较研究提供了新的资料，而且对进一步研究该基因的功能、表达具有重要的意义。     

鲶生长激素基因cDNA的克隆和原核表达

从脑垂体中提取总RNA,用RT-PCR扩增并克隆到鲶鱼的生长激素(GH)基因cDNA。分析其核苷酸序列和推测的氨基酸序列,结果显示:鲶鱼生长激素基因的开放阅读框(ORF)包括603个核苷酸;编码200个氨基酸;其中包括22个氨基酸的信号肽和178个氨基酸的成熟肽。把GH成熟肽的cDNA克隆入表达载体pET-28 a,用IPTG诱导重组蛋白的表达,其表达量超过细胞蛋白总量的50%,主要为不溶性的包含体。细菌裂解液沉淀溶于8 mol/L尿素后,用固定化金属配体亲和层析纯化,获得分子量为22.5 kD的单一蛋白带。     

胭脂鱼生长激素基因cDNA的克隆和原核表达

从脑垂体中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增并克隆到了胭脂鱼的生长激素(GH)基因cDNA。胭脂鱼生长激素基因的开放阅读框(ORF)均包括633个核苷酸,编码210个氨基酸,其中包括22个氨基酸的信号肽和188个氨基酸的成熟肽。把GH成熟肽的cDNA克隆入表达载体pET-28 a,用IPTG诱导重组蛋白的表达,其表达量超过细胞蛋白总量的50%,主要为不溶性的包含体。细菌裂解液沉淀溶于8M尿素后,用固定化金属配体亲和层析纯化,获得了相对分子质量为24kDa的单一蛋白带。     

草鱼生长激素单克隆抗体制备及其免疫学性质的研究↑（*）

应用我们自己纯化的草鱼生长激素（gcGH）作为抗原免疫6周龄BALB／c小鼠，经4次免疫后进行细胞融合。用常规ELISA法筛选阳性克隆，从167个被测克隆中筛选出7个阳性克隆，阳性率为4．1％。其中中等强度阳性克隆5个，强阳性克隆2个（1D2B9和3E8A5）。将强阳性克隆经过3次有限稀释     

转牛（羊）生长激素基因工程鲤鱼研究

生产出转牛和羊生长激素基因实验鲤鱼一万余尾，筛选出生长速度快，含有外源基因的转基因鲤鱼１４３尾，遗传实验证实外源基因可遗传给后代，经池塘生长实验证明于代仍具有生长速度快的特征，建立了把外源基直接注入鲤鱼受精卵及确定了外源基因导入鲤鱼受精卵的最佳时期等构建转基因鱼的一整套技术。     

大珠母贝（Pinctada maxima）金属硫蛋白cDNA克隆与序列特征分析

金属硫蛋白（Metallothionein,MT）是一类普遍存在于生物体内、分子量低、半胱氨酸含量丰富、能够与二价重金属离子结合的蛋白质。MT在清除自由基、解除重金属毒性、参与体内微量元素代谢、防止细胞癌变等方面具有重要作用。本研究通过构建大珠母贝外套膜全长cDNA文库,首次克隆得到大珠母贝金属硫蛋白（PmMT）全长cDNA序列。该序列全长599bp,5’UTR（Untranslated Region）为75bp,3’UTR为296bp,开放阅读框（Open Reading Frame,ORF）为228bp,编码75个氨基酸。编码的氨基酸中半胱氨酸含量丰富,达到29．3％;赖氨酸和甘氨酸含量也较高,均为9．3％;不含苯丙氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸等芳香族氨基酸;含有软体动物等无脊椎动物金属硫蛋白的特征序列。序列特征分析表明,该序列具备金属硫蛋白的典型特征,是金属硫蛋白家族成员。     

日本鳗鲡脂肪酸去饱和酶和延长酶基因的克隆与分析

利用RT—PCR和RACE方法克隆得到日本鳗鲡（Anguilla japonica）肝脏中控制高不饱和脂肪酸（highly unsaturated fatty acids,HUFA）合成的脂肪酸去饱和酶（fatty acid desaturase,FAD）和脂肪酸延长酶（fatty acid elongase,ELO）全长cDNA序列。结果表明,2456bp的FAD全长cDNA序列含长达1046bp的3’-UTR、75bp的5’-UTR和编码444个氨基酸的长1335bp的阅读框。编码的蛋白序列含有FAD全部的特征结构区,包括3个组氨酸簇、2个跨膜区和1个细胞色素h5结构域,与其他具有不同生活史鱼类的FAD氨基酸序列具有70．5％～77．5％的同源性;分析显示其在系统树中与溯河洄游鱼类的亲缘关系最近。克隆得到的ELO全长cDNA序列长1239bp,含有885bp的开放阅读框,编码294个氨基酸,该蛋白序列含有单一的氧化还原中心组氨酸簇、内质网停留信号和多个跨膜区等ELO特征结构,与其他鱼类ELO氨基酸具有87．1％～88．8％的同源性;其在系统树中与北非鲶鱼（Clarias gariepinus）和斑马鱼亲缘关系较近。日本鳗鲡FAD和ELOcDNA全序列的获得为今后进一步研究其体内高不饱和脂肪酸合成途径及阐明该途径在不同鱼类中的分子进化机理奠定基础。     

鲮生长激素基因cDNA的分子克隆和序列分析

根据生长激素(growth hormone,GH)基因的保守性序列设计1对引物,利用RT—PCR技术从鲮(Cirrhina molitorella)脑垂体组织中克隆出经生长激素成熟肽cDNA片段,将纯化的DNA片段克隆到pUCm—T载体上。克隆的鲮GH cDNA开放阅读框全长567bp,编码由188氨基酸残基组成的生长激素成熟肽。序列分析结果表明,鲮GH成熟肽氨基酸序列与另2种鲮—印鲮(Cirrhina mrigal)和南亚野鲮(Labeo rohita)的成熟肽氨基酸序列同源性分别为87％和83％,与鲤的成熟肽氨基酸序列同源性为96％,并对9个科的17种鱼进行了分子系统进化树分析,结果与根据传统的形态学和生化特征分类进化地位基本一致。本研究所克隆的基因序列和推测的蛋白质序列已登录入GeoBank、EMBL和DDBJ基因库,序列号分别为AF458105和从AAL151107．1。     

抑制消减杂交技术在鲤鱼抗寒研究中的应用

用抑制性消减杂交技术（SSH）研究与鲤鱼（Cyprinus carpio）抗寒性状相关的基因。通过对荷包红鲤抗寒品系（Cyprinus carpio wuyanensis Tchang）和柏氏鲤（Cyprinus pellegnini Tchang）杂交F2代进行降温诱导实验，获得不同温度下的实验材料。利用抑制消减杂交技术构建了一个低温下差异表达基因的消减cDNA文库，共含有2000个克降。对其叶1480个克隆进行斑点杂交筛选，共得到60个阳性克隆，选取其中29个克隆测序。通过序列分析比对，13个克隆与已知基因序列高度同源，同源性为85％-98％；另外的13个克隆为未知新基因序列。在13个同源性较高的克隆序列巾，有brevican基因、AMP—acid连接酶、CFL2基因、催产素基因、主要组织兼容复合体（MHC）Ⅱβ链、锌指蛋白、细胞色素氧化酶、EPD-1基因、透明质酸结合蛋白多糖类、核受体／类视色素信号调节器等，其中9个基因上调表达，另有4个则抑制表达。这些基因的获得可为研究鱼类抗寒性状以及从分子水平上阐明其机制提供重要依据。     

牙鲆肌肉生长抑素(MSTN)基因克隆

采用同源克隆及基因组步移的方法，分离克隆了牙鲆肌肉生长抑素（MSTN）基因。经过序列分析及cDNA验证，牙鲆MSTN基因具有3个外显子和2个内含子，编码377个氨基酸。5`侧翼区含有8个TATA框，一个CAAT框，6个E框；3`侧翼区含有加尾信号。通过同源分析，牙鲆MSTN C末端含有9个保守半胱氨酸残基和一个RVRR蛋白酶酶切位点；通过进化树分析，牙鲆MSTN与鱼类MSTN基因聚为一支。RT-PCR分析表明，牙鲆MSTN在胚胎发育中不表达或表达量较低，说明MSTN在牙鲆胚胎发育中并不起重要作用；其在各组织中的表达，随个体和环境的不同而有差异，暗示MSTN的表达受外界因素调控。     

鲤鱼（建鲤）营养与配合饲料（三）

鲤鱼（建鲤）营养与配合饲料（三）二、鲤鱼（建鲤）配合饲料（一）鲤鱼饲料的一般基础知识１．鲤鱼饲料的种类及其特点鲤鱼饲料种类较多，凡可利用作为畜禽饲料的都可用来做鲤鱼饲料。根据饲料来源可分为天然饲料和人工饲料。天然饲料是江河、湖泊、水库、池塘等一切水体...     

刺参vasa-1ike基因克隆及其在组织中的表达分析

vasa基因编码DEAD-box家族成员中一种ATP依赖的RNA解旋酶，在生殖系分化过程中发挥着重要的作用。本研究采用同源克隆和cDNA末端快速扩增技术（RACE），从刺参（Apostichopus japonicus）精巢中克隆得到vasa的全长cDNA序列。该cDNA序列全长2167bp，开放阅读框1593bp，编码530个氨基酸，具有DEAD-box家族蛋白的全部9个保守域。经同源比对和系统进化分析，确定其属于DEAD-box家族的VASA亚家族成员。利用半定量RT-PCR检测，vasa mRNA专一性的在刺参性腺中表达，据此，刺参vasa基因有望用于其生殖系起源和分化的研究。[中国水产科学，2008，15（3）：407-413]     

翘嘴鳜生长激素cDNA克隆及其真核表达载体的构建

根据GenBank上大眼鳜生长激素cDNA序列(收录号:AY155227)设计了1对特异性引物,应用RT-PCR技术从翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)脑垂体中克隆了生长激素基因(scGH)编码区序列并对其真核表达载体的构建进行了研究。结果显示:扩增片段全长615 bp,共编码204个氨基酸。该序列与GenBank上大眼鳜生长激素cDNA序列同源性为99.84%。将scGHcDNA序列定向插入pYES2/CT真核表达载体中,经过筛选、酶切和测序,证明重组子中确实插入了翘嘴鳜GH片段。     

鱼类基因分子生物学及转基因鱼研究进展↑（*）

真核基因分子克隆技术的建立，提供了从核苷酸水平了解鱼类基因结构的手段。鱼类基因的分子克隆始于八十年代初、中期对虹鳟（Ｓａｌｍｏｇａｉｒｄｎｅｒｉ）鱼精蛋白基因［５２］和美洲黄盖鲽（Ｐｓｅｎｄｏｐｌｅｕｒｏｎｅｃｔｅｓａｍｅｒｉｃａｎｕｓ）抗冻蛋白（ＡＦＰ）基因［２２］的分子克隆，随后扩展到其他极地鱼类ＡＦＰ基因，接着扩展到鱼类生长激素（ＧＨ）基因、催乳激素（ＰＲＬ）基因、生长催乳素（ｓｏｍａｔｏｌａｃｔｉｎＳＬ）基因等数十个基因。对这些控制鱼类重要生理机能的基因结构的认识，无论在理论上还是在渔业…     

鳜hepcidin cDNA的分子克隆及序列分析

Hepcidin是近年来发现的一类具有独特性质的抗菌肽，根据C-enBank中收录的鱼类抗菌肽hepcidin的cDNA序列设计一对简并引物，用RT-PCR方法从鳜（Sinipercachuatsi）肝脏组织中克隆到hepcidin的cDNA，并构建pMD18-T-hep-cidin载体进行序列测定和分析。结果表明，该cDNA长为381bp，其中第20-277位是该基因的开放阅读框（ORF），编码86个氨基酸，形成由信号肽（24个残基）、前肽（42个残基）和成熟肽（20个残基）3部分序列组成的前体肽，与已报道的其他鲈形目鱼类hepcidin相比较，核苷酸序列的同源性为72．2％-92．0％，所推导的成熟肽与包括人类在内的其他生物hepcidin成熟肽的同源性在50％-86．4％，都含有8个保守的cys残基，可形成4个链内二硫键。鳜hepcidin cDNA片段的获得为以后的重组表达奠定了实验基础，也为抗菌肽hepcidin家族找到了新的成员。     

鲤鱼（建鲤）营养与配合饲料（四）

鲤鱼（建鲤）营养与配合饲料（四）（二）鲤鱼（建鲤）配合饲料１．原料及其选择用作鲤鱼配合饲料的原料种类很多，几乎所有的畜禽饲料和水生饵料，都可以用来作配合饲料的原料。归纳起来可分为植物性饲料、动物性饲料、矿物质饲料和维生素饲料等。对原料的选择应因地制宜...     

齐口裂腹鱼生长激素基因全长cDNA克隆与序列分析

鱼类生长激素是一种单一肽链蛋白激素,主要作用是促进机体的生长.采用RT-PCR方法,首次从齐口裂腹鱼(Schizothorax prenanti)脑垂体总RNA中克隆出生长激素(gFowth hormone,GH)cDNA的开放阅读框ORF(open reading frame)序列,全长633bp.经DNA Star软件分析,该基因编码210个氨基酸,分子量为23.55 kD,等电点为5.46,含有1个疏水区和1个N-糖基化位点.空间结构含有4个α螺旋和4个β折叠,形成2个二硫键.序列比较发现,齐口裂腹鱼GH与草鱼、鲤的GH同源性分别为99.8%、99.4%;与黄鳝、花鲈和大黄鱼的GH同源性分别为57.4%、63.5%和64.2%.