血清中HBV cccDNA定量检测方法的建立及临床应用

目的 建立一种以TaqMan为探针检测乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA（cccDNA）的实时定量PCR检测方法。方法 根据rcDNA与cccDNA结构差异,在缺口两侧设计引物,应用TaqMan探针分析,对实时PCR产物进行克隆、测序以证实产物为目的片段;同时对89例符合病毒性乙型肝炎诊断标准的血清样本进行HBV cccDNA和HBV DNA含量检测,3例未感染乙肝病毒的血清作为阴性对照。结果 测序结果显示扩增产物为目的片段,检出下限为500 copies/mL;89例样本检测HBV cccDNA的阳性率为55.0%,HBeAg阳性患者阳性率为67.8%,HBeAb阳性患者阳性率为30.0%,HBeAg阳性的样本的平均HBV cccDNA水平高于HBeAb阳性的样本（P<0.05）,阴性对照组未检测出HBV cccDNA。应用ROC曲线图评价HBV cccDNA在抗病毒治疗中的价值,其价值为0.927。结论 以TaqMan为探针检测血清HBV cccDNA的实时PCR检测方法的建立,具有快速、敏感、特异性高等特点,应用该方法检测HBV cccDNA含量可作为判断临床抗病毒治疗效果的重要参考指标,指导临床用药。     

酶切联合巢式PCR法检测外周血单个核细胞中的HBV DNA与HBVcccDNA

目的:检测慢性HBV感染者外周血单个核细胞(PBMCs)中HBV的存在状态.方法:采用巢式PCR法检测慢性HBV感染者PBMCs中的HBV DNA;用Hirt法、绿豆核酸酶、设计跨越单链区和三链区巢式PCR引物,以尽可能去除rcDNA的影响,检测共价闭合环状DNA(eccDNA).结果:采用酶切联合巢式PCR法在慢性HBV感染者PBMCs中可扩增出cccDNA,同时未扩增出rcDNA;120例慢性HBV感染者PB-MCs中HBV DNA,cccDNA阳性检出率分别为62.5%,45.8%,HBV DNA阳性检出率明显高于cccDNA(P<0.01);其中HBeAg阳性组PBMCs中HBV DNA检出率(80.0%)和cccDNA阳性率(45.0%)均明显高于HBeAg阴性组(61.7%,30.0%,P<0.01).结论:酶切联合巢式PCR法检测cccDNA可有效避免roDNA对cccDNA扩增的干扰;结果表明乙肝病毒不仅可感染PBMCs,并可在其中复制;HBcAg阳性者PB-MCs中HBV DNA及cccDNA检出率高.     

环介导等温扩增(LAMP)试剂盒检测石蜡包埋肝组织中乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)

 目的  建立一种检测石蜡包埋的肝组织中乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)的新方法,并探讨其应用价值和临床意义。方法  提取30例慢性HBV感染患者的石蜡包埋肝组织中的DNA,采用质粒安全ATP依赖性DNA酶(plasmid-safe ATP-dependent DNase,PSAD)消化,去除非cccDNA后,加入引物及Bst DNA酶进行环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),将检测结果与临床实验室资料结合并进行分析,以判断其临床应用价值。结果  30例HBV感染患者中,有17例HBV cccDNA阳性,阳性检测率56.67%。其中肝癌5例、肝硬化4例、重型乙型肝炎5例、慢性乙型肝炎(轻-中度)3例。提示肝组织HBV cccDNA阳性可能与疾病进展密切相关,与血清HBV cccDNA阳性有一定的相关性,与乙型肝炎病毒血清免疫标志物以及肝功能状况无明显相关。结论  LAMP法能检测到石蜡包埋肝组织中的HBV cccDNA,结合临床实验室资料,对判断抗病毒药物疗效及研究乙型肝炎致病机制具有一定的意义。     

乙型肝炎病毒cccDNA检测方法的建立及初步应用

目的：建立和应用聚合酶链反应法（PCR）检测慢性乙型肝炎患者肝组织中乙型肝炎病毒（HBV）共价闭合环状DNA（cccDNA）。方法：应用选择性PCR的方法检测30例乙肝患者肝组织中cccDNA,同时验证此方法的特异性。结果：31例慢性乙型肝炎患者肝组织中,10例HBVcccDNA阳性,阳性率为32.3%。HBV cccDNA阳性组的ALT、HBVDNA、和HBeAg水平均明显高于阴性组（P〈0.01和P〈0.05）。结论：该方法操作简单,特异性好,可用于测定肝组织中HBV cccDNA,用于了解乙肝患者病情和传染性强弱以及评价抗乙肝病毒药物的疗效。     

体外培养细胞内乙肝病毒共价闭合环状DNA检测方法的建立

目的：建立一种体外培养细胞内乙肝病毒（hepatitis B virus,HBV）共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA,cccDNA）的检测方法。方法：Southern blot 检测HBV复制中间体,以确认HepAD38、HepG2.2.15和P+P-细胞是否支持HBV复制;用Hirt法分别提取细胞内的去蛋白DNA（protein-free DNA,PF DNA）,经加热变性处理,EcoRⅠ酶切,然后用Southern blot检测HBV cccDNA;用同样方法检测不同培养时间的HepAD38细胞内cccDNA,观察培养时间对cccDNA积累量的影响。结果：用Southern blot可在HepAD38、HepG2.2.15和P+P-细胞中检测到HBV复制中间体;Hirt法提取物经变性和酶切处理,可有效地将cccDNA与其他形式HBV DNA区分开;HepAD38、HepG2.2.15和P+P-细胞内均可检测到HBV cccDNA;HepAD38细胞在铺满后继续培养的时间较长时,其细胞内cccDNA的量较多。结论：成功建立了体外培养细胞内HBV cccDNA检测方法,该方法结合Hirt提取法和地高辛探针Southern blot方法,能可靠、准确地检测HBV cccDNA。     

肝组织HBV总DNA和cccDNA阴性参考值的探讨

目的探讨肝组织乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）总DNA（total DNA,tDNA）和共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA,cccDNA）的阴性参考值,为进一步研究实时定量PCR检测肝组织HBV tDNA和cccDNA的应用价值奠定基础。方法分别有88例HBsAg阳性/抗-HBc阳性、20例HBsAg阴性/抗-HBc阳性和19例HBsAg阴性/抗-HBc阴性慢性肝炎患者入选本研究。肝组织β-globin DNA、HBV tDNA和cccDNA采用实时荧光定量PCR检测,单个肝细胞HBV tDNA和cccDNA含量（copies/cell）=HBV tDNA实测值（copies）/β-globin DNA实测值（copies）和HBV cccDNA实测值（copies）/β-globin DNA实测值（copies）。肝组织HBVtDNA和cccDNA含量的计算单位定义为log_（10）copies/10~6cell。统计分析采用SPSS 13.0软件。结果肝组织HBVtDNA和cccDNA鉴别HBsAg阳性/抗-HBc阳性与HBsAg阴性/抗-HBc阴性慢性肝炎的ROC曲线下面积分别为0.909和0.891（P=0.000和0.000）,最佳截断值分别为5.772和4.883 log_（10） copies/10~6cells;鉴别HBsAg阳性/抗-HBc阳性与HBsAg阴性/抗-HBc阳性慢性肝炎的ROC曲线下面积分别为0.893和0.857（P=0.000和0.000.）,最佳截断值分别为5.559和4.630 log_（10） copies/10~6cells。就HBsAg阳性/抗-HBc阳性慢性肝炎而言,当肝组织HBV tDNA和cccDNA≥5.699和cccDNA≥4.699 log_（10） copies/10~6cells时,肝组织HBV tDNA与cccDNA含量之间均呈显著正相关（P=0.000和0.000）;当肝组织HBV tDNA〈5.699和cccDNA〈4.699 log_（10） copies/10~6cells时,肝组织HBV tDNA与cccDNA含量之间均无显著相关性（P=0.065和0.880）。结论肝组织HBV tDNA〈5.699和cccDNA〈4.699 log_（10） copies/10~6cells可能是合适的阴性参考值。     

慢性乙型肝炎肝组织中HBVcccDNA、HBVDNA和血清中HBVDNA的关系

目的 探讨慢性乙型肝炎肝组织中HBV cccDNA、HBV DNA和血清中HBV DNA的关系。方法 采用实时定量PCR技术检测慢性乙型肝炎肝组织中HBV cccDNA、HBV DNA和血清中HBV DNA含量,同时采用MEIA法检测HBVM指标。结果 60例慢性乙肝患者肝组织中53%检测到HBVcccDNA,平均值为5.98×103拷贝/mg,肝组织HBV-DNA定量平均值为3.66×104拷贝/mg;血清HBV-DNA定量为7.12×104拷贝/mL。肝组织HBVcccDNA定量与肝组织HBV-DNA定量呈高度相关性（P<0.01）;肝组织HBVcccDNA定量与血清HBV-DNA定量也正相关（P<0.05）。结论 由于肝组织HBVcccDNA定量与肝组织HBV-DNA定量呈高度相关性,因此可以在一定程度上可代替检测肝组织中HBVcccDNA来判断病毒复制情况。     

PCR-微流芯片法检测HBV感染者外周血HBV cccDNA和HBV DNA

目的：探讨HBV感染的肝病患者血中HBV cccDNA、HBV DNA的临床意义。方法：采用PCR-微流芯片法检测105例HBV感染者血清HBV DNA、HBVccc DNA、白细胞中HBV cccDNA（3例进行肝组织HBV cc-cDNA检测）,以6例非乙型肝炎患者作为对照。结果：6例非乙型肝炎患者HBVM、HBV DNA、HBV cccDNA均阴性;HBV感染者中41.9%（44/105）白细胞HBVccc DNA阳性,其中2例阳性PCR产物经基因测序得到验证;HBVDNA≥105copy/ml中HBV cccDNA阳性率57.4%（35/61）显著高于HBV DNA〈105copy/ml者20.5%（9/44,P〈0.01）;18.9%HB VDNA〈103copy/mlHBV感染者HBV cccDNA阳性;抗病毒治疗的慢性肝病患者HBV cccDNA阳性率显著低于未抗病毒治疗者（5/25 VS 34/65,P〈0.01）。结论：HBV感染的患者外周血中存在HBV cccDNA;HBV DNA高浓度者HBV cccDNA检出率高;外周血白细胞HBV cccDNA、血清HBVDNA联合检测更能准确判断抗病毒治疗效果及提高HBV复制检出率。     

外周血单个核细胞HBV的复制状态与干扰素-γ表达和分泌的关系

目的: 研究HBV侵犯外周血单个核细胞(PBMC)及对IFN-γ表达和分泌的影响.方法: 慢性HBV感染者60例,巢式PCR检测PBMC中HBV共价闭合环状DNA(cccDNA);ELISA法检测血清IFN-γ水平;实时定量RT-PCR方法检测PBMC中IFN-γmRNA的表达水平.结果: 48.3%(29/60)的患者PBMC中检测到cccDNA;血清IFN-γ水平低于对照组(P＜0.05);PBMC中IFN-γmRNA表达水平低于对照组(P＜0.01);PBMC中cccDNA阳性组IFN-γ表达和分泌水平低于cccDNA阴性组(P＜0.01).结论:HBV慢性感染者PBMC中IFN-γ表达和分泌水平降低.     

乙型肝炎患者血清中HBV cccDNA、HBV DNA、HbsAg与HbeAg定量关系的分析

目的:检测乙型肝炎患者血清中乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)、HBV DNA、乙型肝炎表面抗原(HbsAg)和乙型肝炎e抗原(HbeAg)分析其相互关系,探讨定量检测血清中HBV cccDNA的临床应用价值。方法:收集乙型肝炎患者120例,对照组为20例正常人群,采用实时荧光定量PCRJ检测HBV DNA、HBV cccDNA,采用微粒子分析法检测HbsAg和HbeAg。进行比较分析。结果:慢性乙型肝炎(CHB)轻中度组与CHB重度及重型组HBV cccDNA水平分布位置差异无统计学意义(P>0.05),定量值与HBV DNA、HbsAg和HbeAg呈正相关。结论:HBV cccDNA、HBV cccDNA、HBV DNA、HbsAg与HbeAg定量检测对掌握乙型肝炎患者病情轻重、病情进展,对乙型肝炎患者的治疗和预后都具有很重要的临床应用价值。     

慢性乙肝患者血清HBV cccDNA检测的临床意义

目的探讨慢性乙肝患者血清HBV cccDNA与现有血清学指标（AST、ALT、TBIL、HBeAg、HBV DNA）的相关性。方法选取解放军第309医院2009年5月-2012年5月就诊的慢性乙肝患者58例,采用Roche C6000电化学发光法检测HBeAg;日立Hi7600全自动生化分析仪检测ALT、AST、TBIL;采用实时荧光定量PCR检测血清HBV DNA、HBVcccDNA载量。结果血清HBV cccDNA与HBV DNA有很好的相关性（r=0.880,P=0.000）。HBeAg阳性组HBV cccDNA阳性的比例为67.6%,显著高于HBeAg阴性组的37.5%（χ2=5.170,P=0.023）。血清HBV cccDNA与肝组织炎症的严重程度呈正相关（χ2=4.819,P=0.028）。结论血清HBV cccDNA定量检测是评价HBV复制情况和肝细胞损伤程度较为可靠的指标。     

HBx基因缺失突变对HBV复制和转录的影响

目的构建HBx基因缺失突变质粒pUC-HBV1.0.X7,研究HBx缺失对HBV复制和转录的影响。方法以包含HBV全长基因组的野生型质粒pUC-HBV1.0为模板,用定点突变技术构建HBx基因缺失突变质粒pUC-HBV1.0.X7,并酶切和DNA测序鉴定。用SapⅠ单酶切这两种质粒,获得线性的野生型和HBx缺失突变型HBV基因组,经转染试剂PolyJetTMReagent介导分别瞬时转染到HepG2细胞中。在转染后各时间点Western blot检测HBx蛋白的表达,Southern blot和Real-time PCR同时检测细胞质DNA复制和细胞核cccDNA的合成,Real-time PCR分析定量HBV前基因组RNA(pgRNA)的转录。结果在野生组中可检测到HBx蛋白的表达,而在HBx突变组中HBx蛋白的表达低于Western blot的检测范围。两组中各时间点合成的cccDNA水平无统计学差异(P>0.05)。而在转染后96 hHBx突变组中细胞质DNA的复制和pgRNA的转录都分别比野生组减少50%～70%(P<0.05)。结论 HBx缺失虽然不影响细胞核HBV cccDNA的合成,但是它能下调细胞质HBV DNA的复制和pgRNA的转录。     

运用TaqMan探针实时荧光PCR技术检测AKAP10基因2073A/G单核苷酸多态性

目的 建立一套以TaqMan探针实时荧光PCR技术为基础的单核苷酸多态性(SNP)检测平台,并用于AKAP10基因2073A/G SNP的检测. 方法 设计一对TaqMan探针加入到PCR反应系统中,并设立阴阳对照,对AKAP10基因2073A/G SNP进行分型.同时验证部分样本PCR产物的直接测序结果 . 结果 运用TaqMan探针实时荧光PCR技术对AKAP10基因2073A/G SNP检测结果 准确,与PCR产物的直接测序结果 完全一致.AKAP10基因2073A/G多态性分布与性别年龄无关(P>0.05).非条件logistic回归分析提示,AKAP10基因2073A/G突变型(AG+GG)与野生型AA相比增加结直肠癌的发生风险(OR=1.52, 95% CI:1.07～2.15, P=0.019). 结论 通过合理设计TaqMan探针,设立阴阳性对照,应用TaqMan探针实时荧光PCR技术成功建立起一套SNP检测平台.AKAP10基因2073A/G多态性与结直肠癌发病存在显著相关性.     

Nested real-time quantitative polymerase chain reaction assay

Background  Successful treatment of hepatitis B can be achieved only if the template for hepatitis B virus (HBV) DNA replication, the covalently closed circular HBV DNA (cccDNA) can be completely cleared. To date, detecting cccDNA remains clinically challenging. The purpose of this study was to develop a nested real-time quantitative polymerase chain reaction (PCR) assay for detecting HBV cccDNA in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and bone marrow mononuclear cells (MMNCs).

Methods  Based on the structural differences between HBV cccDNA and HBV relaxed circular DNA (rcDNA), two pairs of primers were synthesized as well as a downstream TaqMan probe. Blood and bone marrow samples were collected from hepatitis B patients and healthy controls. To remove rcDNA, samples were incubated with mung bean nuclease and the resultant purified HBV cccDNA was then amplified by nested real-time fluorescence quantitative PCR. The cccDNA levels were calculated using a positive standard.

Results  The nested real-time fluorescence quantitative PCR method for HBV cccDNA was successful, with a linear range of 3.0×10² copies/ml to 3.9×l0⁸ copies/ml. Of the 25 PBMC samples and 7 MMNC samples obtained from chronic hepatitis B or liver cirrhosis patients, 3 MMNC samples and 9 PBMC samples were positive for HBV cccDNA, while all of the 21 PBMC samples from healthy controls were negative.

Conclusion  The nested real-time fluorescence quantitative PCR may be used as an important tool for detecting cccDNA in hepatitis B patients.

     

乙型肝炎患者外周血单个核细胞HBV cccDNA含量的检测及其临床意义

[目的]采用实时荧光定量PCR的方法检测乙型肝炎患者外周血单个核细胞中HBV cccDNA 的含量,并探讨其临床意义.[方法] 应用实时荧光PCR(RT-PCR)方法对随机选取的乙型肝炎患者100例和1例追踪治疗的乙肝患者的血清HBV DNA 含量和外周血单个核细胞中HBV cccDNA 的含量进行检测;对已确诊的慢性乙肝患者40例,肝硬化患者30例外周血单个核细胞中HBV cccDNA 的含量进行检测.[结果] 100例乙型肝炎患者中,HBV DNA含量<5×102 copies/mL有57例,HBV cccDNA 的含量均<5×102 copies/mL;HBV DNA含量>5×102 copies/mL 有43例,HBV cccDNA 的含量>5×102 copies/mL 有22例;HBV DNA含量>1×103 copies/mL的患者有17例,在这些患者中HBV cccDNA 的含量>5×102 copies/mL者为13例,两者之间比例经χ2检验,差异无显著性意义,P>0.05;肝硬化患者HBV cccDNA 阳性率(>5×102 copies/mL)为67.7%,远远高于慢性乙肝患者的42.5%和随机乙肝人群的22.0%.各组间患者比例经χ2检验,差异有显著性意义,P<0.05.[结论] 乙型肝炎患者进行外周血单个核细胞中HBV cccDNA的检测,对于抗病毒治疗效果的监测和预后判断都重要的临床意义.     

Effect of absence of HBx expression on HBV replication and transcription

目的 构建HBx基因缺失突变质粒pUC-HBV1.0.X7,研究HBx缺失对HBV复制和转录的影响.方法 以包含HBV全长基因组的野生型质粒pUC-HBV1.0为模板,用定点突变技术构建HBx基因缺失突变质粒pUC-HBV1.0.X7,并酶切和DNA测序鉴定.用Sap Ⅰ单酶切这两种质粒,获得线性的野生型和HBx缺失突变型HBV基因组,经转染试剂PolyJetTM Reagent介导分别瞬时转染到HepG2细胞中.在转染后各时间点Western blot检测HBx蛋白的表达,Southern blot 和Real-time PCR同时检测细胞质DNA复制和细胞核cccDNA的合成,Real-time PCR分析定量HBV前基因组RNA(pgRNA)的转录.结果 在野生组中可检测到HBx蛋白的表达,而在HBx突变组中HBx蛋白的表达低于Western blot的检测范围.两组中各时间点合成的cccDNA水平无统计学差异(P＞0.05).而在转染后96 hHBx突变组中细胞质DNA的复制和pgRNA的转录都分别比野生组减少50％～70％ (P＜0.05).结论 HBx缺失虽然不影响细胞核HBV cccDNA的合成,但是它能下调细胞质HBV DNA的复制和pgRNA的转录.     

新型MGB探针特异性检测变形链球菌

目的:设计一种新型TaqManMGB探针,利用实时荧光定量PCR检测变形链球菌,提高PCR法检测变形链球菌的特异性,减少检测的假阳性。方法:提取6种不同链球属细菌的DNA,分别进行巢式PCR和TaqManMGB实时荧光定量PCR,比较两种PCR方法检测变形链球菌的特异性。巢式PCR第1轮扩增的引物是细菌16S rRNA基因通用引物,第2轮扩增使用变形链球菌16S rRNA基因可变区序列的特异性引物。TaqManMGB实时荧光定量PCR的引物与第2轮巢式PCR特异性引物相同,设计的MGB探针序列与变形链球菌16S rRNA基因中特异性序列相匹配,不与其他细菌的基因序列匹配。将变形链球菌标准株的DNA样本从2.5 mg/L至0.16μg/L按5倍梯度稀释,制备出实时荧光定量PCR的标准曲线。结果:变形链球菌和格氏链球菌在巢式PCR中均扩增出282 bp的DNA片段,出现假阳性结果。TaqManMGB实时荧光定量PCR能定量检出变形链球菌标准株和临床株,不检出其他链球菌,比巢式PCR特异性更好。TaqManMGB实时荧光定量PCR对变形链球菌DNA的最低检出浓度为20μg/L。结论:本研究设计出一种针对变形链球菌的TaqManMGB探针,建立利用TaqManMGB实时荧光定量PCR特异性检测口腔中变形链球菌的方法。     

猴免疫缺陷病毒(SIV)实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立快速、敏感、特异的猴免疫缺陷病毒(SIV)TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,对SIV病毒核酸进行定量检测。方法 RT-PCR扩增SIVmac251保守gag基因序列796 bp片段,进行TA克隆,构建标准品质粒pMD-SIVgag。通过对SIV定量外标准品的定量分析,优化反应体系,检测TaqMan探针实时荧光定量PCR方法的灵敏度、特异性和重复性。结果所建立的SIV QPCR检测方法,质粒DNA模板在107～102拷贝之间表现较好线性和相关性,标准曲线所得斜率为-3.26,相关系数为0.999。检测灵敏度达到200拷贝,方法重复性测试,检测25份临床样品CV%均小于1%。结论建立的SIV QPCR检测方法特异性、敏感性高,稳定性好,可用于定量测定猴免疫缺陷病毒(SIV)核酸拷贝量。     

血清乙肝病毒cccDNA检测的临床分析

目的:探讨血清中乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)全序列的PCR检测与HBV复制及肝细胞损伤的临床相关性?方法:用长链PCR方法对乙型肝炎患者血清进行HBV cccDNA全序列直接扩增,同时检测血清中乙型肝炎病毒前S1(PreS1)抗原和丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性?结果:cccDNA和PreS1抗原在乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)阳性血清中检出率分别为43.94%(29/66)和83.33%(55/66),在HBeAg阴性血清中的检出率分别为13.33%(4/30)和30.00%(9/30);cccDNA阳性血清的PreS1抗原阳性率和ALT活性升高分别为90.91%(30/33)和93.94%(31/33),cccDNA阴性血清的PreS1抗原阳性率和ALT活性升高分别为53.97%(34/63)和41.27%(26/63)?结论:血清中cccDNA的检出与PreS1抗原?HBeAg的表达以及肝细胞损伤呈高度相关性?     

乙肝病毒感染肝星状细胞的体外研究

目的初步研究乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)能否体外感染人肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC),以期为阐明慢性乙肝的致病机制提供新的实验依据。方法体外培养人肝星状细胞株(LX-2),用不同浓度HBV感染者的血清进行感染,HBV DNA终浓度分别为104、105、106、107拷贝/mL,在感染24、48和72h收取细胞。荧光定量多聚酶链反应(polymerase chain reaction,FQ-PCR)方法测定细胞内的总HBV DNA和共价闭合环状DNA(cccDNA);Southern blotting及Northern blotting方法测定细胞内是否存在HBV复制中间体及mRNA。结果在HepG2.2.15细胞中,分别检测到2.58拷贝/细胞和0.86拷贝/细胞的HBV DNA和cccDNA。在少量LX-2细胞中,可以检测到HBVNA,均在0.05拷贝/细胞以下,在所有LX-2细胞中未检测到cccDNA;用Southern blotting和Northern blotting方法未检测到LX-2细胞中存在HBV复制中间体及mRNA;而在HepG2.2.15细胞中检测到阳性条带。结论在体外实验中,未发现HBV感染肝星状细胞的证据。