小粒野生稻STK类抗病基因同源序列的克隆与分析

根据丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶类(serine-threonine kinase,STK)抗病基因结构中保守结构域,设计引物,以小粒野生稻基因组DNA为模板,扩增获得10条STK类抗病基因同源序列.同源性分析表明其都具有STK保守结构域,与已克隆的STK类抗病基因有不同程度的相似性,为进一步克隆小粒野生稻中的STK类抗病基因提供依据.     

小粒野生稻优异基因的挖掘与利用研究进展

小粒野生稻拥有丰富的遗传多样性,含有大量的优异基因,是进行栽培稻遗传改良和基因组研究的宝贵资源。本文总结了国内外研究利用小粒野生稻种质取得的系列进展,主要包括:小粒野生稻优异性状的鉴定和遗传群体的构建,小粒野生稻有利基因的定位、克隆与育种利用,还对小粒野生稻优异基因利用的困难和应对策略进行了讨论。这些结果必将有利于进一步挖掘和利用小粒野生稻的有利基因。     

携带黄矮病抗性基因染色体DNA文库的构建

单条染色体的分离及其ＤＮＡ片段的克隆是将细胞学与现代分子生物学相结合的一项新技术。它对染色体结构和基因进化的研究、基因组物理图谱及分子标记连锁图构建等 ,特别是增加染色体某些区域的探针密度具有重要意义。２０世纪９０年代以来 ,有关植物染色体微分离及体外扩增的报道中 ,只有少数几篇是关于单条染色体的体外扩增及其克隆 ,其采用的为微细玻璃针法。在前人工作的基础上 ,我们探索了一套操作方便、容易掌握的激光微分离、微克隆技术体系。本文以中间偃麦草二体异附加系Ｚ２与普通小麦宛７１０７杂交（Ｚ２×宛７１０７）的Ｆ１ …     

小粒野生稻导入系对稻飞虱的抗性鉴定与分析

稻飞虱是水稻生产最严重的害虫之一。野生稻拥有丰富的抗虫基因资源,导入系是鉴定和利用野生稻有利基因的有效途径。本研究通过对371份小粒野生稻导入系进行抗褐飞虱和白背飞虱接虫鉴定,分别筛选出了11份抗、72份中抗褐飞虱的材料和7份抗、45份中抗白背飞虱的材料,其中有5份材料兼抗褐飞虱和白背飞虱,这是从小粒野生稻中鉴定出抗白背飞虱材料的首次报道。通过对2份抗性导入系材料与感虫亲本杂交构建的F1和F2群体的抗虫鉴定和分析表明:K41对褐飞虱和白背飞虱的抗性受2对显性抗虫基因通过互补作用所控制;P114对褐飞虱和白背飞虱的抗性都是由1对主效的隐性基因控制。这些结果必将有利于小粒野生稻抗稻飞虱的基因定位和育种利用。     

云南松基因组微卫星富集文库的构建

采用磁珠富集法构建云南松微卫星富集文库。云南松基因组DNA经RsaⅠ酶切,与特定接头连接,再用接头特异引物进行PCR扩增。连接扩增产物与用生物素标记的(AG)12、(AT)12、(CG)12、(GT)12、(ACG)12、(ACT)12和(CCA)8探针杂交,通过链霉亲和素偶联的磁珠捕捉含接头和微卫星序列的片段并扩增,将获得的片段连接到pMD-19T载体上,转化至大肠杆菌JM109感受态细胞中,成功构建了云南松微卫星富集文库。通过PCR检测从文库中筛选阳性克隆,在383富集阳性菌落中获得阳性克隆257个,经测序分析,在获得的159条序列中,有143条含有SSR,其中完美型占65.73%,非完美型占23.78%,混合型占10.49%。结果表明,磁珠富集法构建云南松基因组微卫星文库高效、可行的,文库的构建为微卫星位点的分离、遗传多样性的分析等奠定基础。     

小粒野生稻与栽培稻杂种及回交后代的特征分析

小粒野生稻（Oryza minuta）,是栽培稻遗传改良的宝贵资源,本研究通过杂交和回交结合胚拯救技术获得了小粒野生稻与栽培稻的种间杂种及回交后代,调查了杂种与各回交后代的交配率和染色体数目,并运用175对均匀分布的SSR标记对双亲和92份二倍体的BC3F1植株进行了分析.结果表明,杂种F1,BC1,BC2和BC3的交配率分别为5.58%,0.11%,0.37%和1.62%;杂种染色体数目为36（ABC）,回交后代的染色体数目为24～48;小粒野生稻与栽培稻间SSR标记的多态性概率为93.2%;在92份二倍体的BC3F1植株中,小粒野生稻渗入片段的数目、长度、总的大小及其所占全基因组的百分数分别为24.1,17.8,438.4cM和26.2%.同时还评价了杂种和回交后代的部分农艺性状和对水稻白叶枯病的抗性表现.这些材料可以用于鉴定来自于小粒野生稻的有利基因和产量相关性状的数量性状基因座（quantitative trait loci,QTL）,为栽培稻的遗传改良提供新的操作平台.     

蜘蛛基因组DNA Cosmid文库构建和拖丝蛋白基因的克隆

The genomic DNA Cosmid library was constructed from Nephila clavipes spider muscle using SuperCos 1 Cosmid as a vector.The title of library was >5×10 4 cfu/μg ligated DNA.On the basis of published sequence from a partial cDNA sequence of the 3′end of the dragline silk gene, we designed and synthesized 3 oligonucleotides.Oligonucleotides were labeled with non radioactive digoxigenin dUTP and detected with chemilluminescent substrate.56 positive recombinants were screen from the Cosmid library using DIG Oligo 2 as a probe.DNA dot hybridization using DIG Oligo 1 and DIG Oligo 3 as the probes, respectively, 3 positive signals were identified from 56 colonies.They were appeared the same pattern when DNA from the colones digested by restriction enzymes.The spider dragline silk gene was confirmed again by Southern blot hybridization.     

RecA蛋白介导的三链核酸结构形成及其序列提取

人工合成的单链DNA分子经PCR扩增形成双链DNA分子。将RecA蛋白与生物素标记的寡聚核酸探针序列在ATPγS存在的情况下共同哺育,使RecA蛋白包裹寡聚核酸探针,然后加入含同源序列的上述双链DNA分子经适当环境哺育形成了稳定的局部三链核酸结构。通过加入链亲和素包裹的磁珠吸附生物素化的探针,这样同源双链DNA分子与寡聚核酸探针形成的局部三链核酸结构也被吸附在磁珠上。使用磁分离装置提取这一结构,逐步降低盐离子浓度以洗脱双链DNA分子。将洗脱液中残留的蛋白质去除,经PCR扩增可获得目的DNA序列。同时使用同源探针和非同源探针在其它序列中提取目的DNA序列,结果显示目的DNA序列只被同源探针提取。实验结果显示了这一三链核酸结构形成的序列特异性,并且其稳定性随盐离子浓度降低而下降。提示在这一结构中同源的寡聚核酸单链与双链DNA分子形成了氢键结合,同时提示使用文中描述的方法可以提取特异的序列,用以克隆相应的基因。     

中国地鼠基因组微卫星富集文库的构建与分析

目的筛选中国地鼠微卫星位点,为中国地鼠种质资源的分类、进化等遗传研究奠定基础。方法中国地鼠基因组DNA经超声打碎,用2%琼脂糖凝胶电泳回收500～1000 bp的DNA片段,与SNX连接头连接,连接产物与生物素标记的14种微卫星探针变性及退火,再通过链亲和素偶联磁珠亲和捕捉,经吸附、洗涤及洗脱,然后以洗脱产物为模板,通过PCR扩增,与pGEM-T载体连接,转化大肠杆菌DH10B,构建中国地鼠微卫星DNA富集文库。结果测序结果发现,微卫星DNA序列的阳性克隆占70.3%。结论中国地鼠微卫星文库的建立和微卫星的筛选将为下一步进行中国地鼠遗传连锁图谱的构建、分子进化和系统发育研究提供大量的微卫星标记。     

藏酋猴微卫星富集文库的构建及微卫星分子标记的筛选

通过磁珠富集法构建了藏酋猴AC重复和AAAG重复的微卫星富集文库,分离微卫星序列并对其进行分析。将藏酋猴基因组DNA经Sau3AI酶切后纯化回收,连接特定接头。用生物素标记的探针与酶切片段杂交,捕获300～1000bp片段,随后将获得的片段连接到pMD-19T载体上,转化至JM109中,成功构建藏酋猴微卫星富集文库。(AC)n富集文库和(AAAG)n富集文库的阳性克隆率分别为50%和10%左右。根据测序得到的48个微卫星序列成功设计了24对引物,最终筛选出6个微卫星标记,这些标记将为藏酋猴的遗传多样性研究、圈养种群结构的分析和遗传图谱的构建等奠定一定的基础。     

Cloning and characterization of repetitive DNA sequences from genomes of Oryza minuta and Oryza australiensis

The value of genome-specific repetitive DNA sequences for use as molecular markers in studying genome differentiation was investigated. Five repetitive DNA sequences from wild species of rice were cloned. Four of the clones, pOm1, pOm4, pOmA536, and pOmPB10, were isolated from Oryza minuta accession 101141 (BBCC genomes), and one clone, pOa237, was isolated from Oryza australiensis accession 100882 (EE genome). Southern blot hybridization to different rice genomes showed strong hybridization of all five clones to O. minuta genomic DNA and no cross hybridization to genomic DNA from Oryza sativa (AA genome). The pOm1 and pOmA536 sequences showed cross hybridization only to all of the wild rice species containing the C genome. However, the pOm4, pOmPB10, and pOa237 sequences showed cross hybridization to O. australiensis genomic DNA in addition to showing hybridization to the O. minuta genomic DNA.     

Characterization of interspecific hybrids and backcross progenies from a cross between Oryza minuta and Oryza sativa

Oryza minuta, a tetraploid wild relative of cultivated rice, is an important source for the genetic improvement. Interspecific hybrids were obtained from the cross of O. sativa L. (IR24) and O. minuta (Acc. No. 101133) with 5.58% crossability, which ranged from 0.11% to 1.62% in the backcross generations. The chromosome numbers of the backcross progenies were 24 to 48. Seven yield-related traits of the parents, hybrid F₁, and backcross progenies were evaluated. Simple sequence repeat markers analysis showed that the polymorphism ratio of SSR bands between IR24 and Acc. No. 101133 was 93.2%. The average donor segment number, length, donor genome size, and percentage of donor genome of 92 BC₃F₁ plants (2n=24) were 24.1, 17.8 cM, 438.4 cM and 26.2%, respectively. They were complex variation and uneven among the chromosomes. These introgression lines could be used to identify the favorable genes of O. minuta and provide a new platform for the genetic improvement of cultivated rice.     

白叶枯病菌胁迫下云南普通野生稻SSH文库的构建及抗病相关基因分析

以云南普通野生稻为材料,利用抑制差减杂交技术（SSH）,构建了白叶枯病菌胁迫的云南普通野生稻特异表达基因的差减文库.通过对文库所有阳性单克隆进行测序,聚类分析后共获得494条高质量的表达序列标签（EST）.经过BlastN分析,有417条与已知功能的序列有较高同源性;经BlastX分析,有104条EST与未知功能蛋白或假定蛋白有较高相似性,49条EST未能找到同源匹配,341条EST与已知功能蛋白有较高同源性.初步分析发现,这些基因主要涉及能量代谢、蛋白质代谢、核酸代谢、防御与抗逆应答反应、信号转导、光合作用及膜运输等代谢过程.使用半定量RT-PCR研究了7个可能与白叶枯病抗性相关的EST序列在云南普通野生稻对照和白叶枯病菌处理的叶片中的表达情况,并获得这些基因的表达谱.结果发现,克隆编号为OR7,OR68和OR826的EST受白叶枯病菌胁迫诱导上调表达,其中OR826 EST在蛋白数据库中无同源序列,可能是一类新的白叶枯病抗性基因,而组成型表达的OR143 EST在对照和接菌处理的叶片中均能检测到其mRNA的表达,但其表达量在白叶枯病菌胁迫48 h后逐渐增强,推测这些基因直接参与了云南普通野生稻抗病防御反应.本研究为从云南普通野生稻中发掘和克隆新的白叶枯病抗性基因提供了理论依据,为进一步研究云南普通野生稻抗白叶枯病的分子机制奠定了基础.     

痢疾杆菌酸抗性系统相关基因缺失突变体的构建

依赖于谷氨酸脱羧酶的酸抗性系统对痢疾杆菌在宿主细胞内的生存和繁殖至关重要,hdeA、hdeB、yhiE和yhiF是其中几个重要的酸抗性基因。借助Red系统的重组功能,PCR扩增两翼与目的基因上下游同源的抗性基因片段,电击转化痢疾杆菌2457T,对筛选到的阳性转化子再导入编码FLP位点特异性重组酶的质粒pCP20以去除抗性基因。结果成功的敲除了hdeA、hdeB、yhiE和yhiF等4个酸抗性系统相关基因,为深入研究痢疾杆菌酸抗性基因的调控网络奠定了基础.