人甲型流感病毒H3N2亚型中和表位串联基因原核表达载体的构建

目的构建人甲型流感病毒H3N2亚型中和表位串联基因原核表达载体,并在大肠杆菌中表达目的蛋白。方法合成人甲型流感病毒H3N2亚型中和表位的串联基因,克隆入pET-28a(+)载体中,构建重组表达载体pET-28a-H3,经酶切鉴定和DNA序列分析后,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并进行ELISA和Westernblot鉴定。结果重组载体pET-28a-H3酶切片段大小和DNA序列分析与预期结果一致。表达的目的蛋白相对分子质量约9400,与相应的多克隆抗体反应性良好。结论已成功构建人甲型流感病毒H3N2亚型中和表位串联基因原核表达载体pET-28a-H3,并表达了目的蛋白,为制备单克隆和多克隆抗体奠定了基础。     

表达甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶的重组腺病毒的构建及其免疫原性

目的构建表达甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)的重组腺病毒,并检测其免疫原性。方法从质粒pMD19T-simple-NA中扩增NA基因,克隆至穿梭质粒pShuttleCMV中,经同源重组获得重组腺病毒质粒,转染Ad-293细胞,包装出重组腺病毒Ad-NA,RT-PCR和免疫荧光法检测NA基因在Vero细胞中的转录和表达。CsCl密度梯度离心纯化重组腺病毒,免疫小鼠,ELISA法检测免疫小鼠血清中抗NA抗体滴度。结果重组腺病毒质粒经PacⅠ酶切鉴定表明带有目的基因的穿梭质粒已整合到腺病毒基因组中;NA基因在Vero细胞中成功转录和表达;重组腺病毒可刺激小鼠产生抗NA抗体,初免后4周,抗体水平达最高,为1∶100 000。结论成功构建了表达甲型H1N1流感病毒NA蛋白的重组腺病毒,其可刺激小鼠产生有效的免疫应答,为甲型H1N1流感病毒基因工程疫苗的研发奠定了基础。     

流感病毒球状头部结构域HA1的原核表达及纯化

目的 原核表达流感病毒（influenza virus,IV）球状头部结构域HA1基因,优化其诱导表达条件,并进行蛋白纯化,以期获得具有良好免疫原性的IV HA1蛋白。方法 将Influenza A virus[A/Saratov/CRIE-250/2017(H3N2)]、Influenza A virus[A/Hebei/F076/2018(mixed)]和Influenza A virus[A/USA/LAN＿(P5)＿HA/2018(H1N1)]进行截短,取63～286头状结构域氨基酸序列,按照大肠埃希菌常用密码子进行优化,合成基因命名为17Sa、Hebei和USA,并对基因17Sa进行点突变命名为基因17Sa变。将4个基因分别克隆至原核表达载体pET-28a（+）,构建重组质粒,将重组质粒转化至E. coli BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,优化蛋白表达条件,并利用His标签镍离子蛋白纯化柱纯化蛋白。结果 成功插入长度为762 bp的目的基因,重组质粒经双酶切（NheⅠ/XhoⅠ）鉴定构建正确。表达的重组蛋白USA相对分子质量约为26 000,17Sa、p17S...     

H5N1高致病性人禽流感DNA疫苗表达质粒的构建及其免疫原性

目的构建H5N1高致病性人禽流感DNA疫苗表达质粒,并观察其免疫原性。方法分析H5N1人禽流感病毒HA基因的进化关系,人工合成人禽流感病毒HA基因(包含多数H5N1人禽流感病毒共有序列),构建含细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA4)和HA融合基因的真核表达质粒pVAX-CLHA及HA基因的真核表达质粒pVAX-HA,经酶切及测序鉴定正确后,转染293-T细胞,经RT-PCR法检测转染细胞中HA基因mRNA的转录水平,间接免疫荧光法(IFA)检测其表达;分别以质粒pVAX-CLHA及pVAX-HA免疫BALB/c小鼠,测定血清HI抗体效价。结果重组DNA疫苗表达质粒pVAX-CLHA和pVAX-HA经酶切及测序证明构建正确,转染的293-T细胞可检测到目的基因的转录及蛋白的表达;3次免疫后均能诱导BALB/c小鼠产生HI抗体,pVAX-CLHA诱导的HI抗体高于pVAX-HA。结论已成功构建了含H5N1HA及CTLA4融合基因的DNA疫苗表达质粒,其对小鼠具有良好的免疫效果,为H5N1高致病性人禽流感DNA疫苗的开发奠定了基础。     

人内源性博尔纳样核蛋白-1的原核表达及纯化

目的原核表达人内源性博尔纳样核蛋白-1(endogenous Borna-like N element-1,EBLN-1),并进行纯化及鉴定。方法以人工合成的EBLN-1基因为模板,PCR扩增EBLN-1基因,克隆至载体pET-41a中,构建重组表达质粒pET-41aEBLN-1,转化大肠埃希菌BL21(DE3)和Rosetta中,分别于18℃和37℃下进行IPTG诱导表达。采用包涵体稀释复性法对表达蛋白进行复性,经His亲和层析纯化后,SDS-GAGE和Western blot法鉴定纯化产物。结果重组表达质粒pET-41a-EBLN-1经菌落PCR及测序鉴定构建正确。重组表达蛋白相对分子质量约48 000,以包涵体形式表达。在大肠埃希菌Rosetta中37℃诱导时表达量最高,占菌体总蛋白的30%以上,纯化后蛋白纯度可达90%,可与HRP标记的His探针特异性结合。结论成功表达并纯化了重组EBLN-1蛋白,为后续深入研究EBLN-1在人体中的生理作用及其与精神疾病的相关性奠定了基础。     

禽流感病毒NS1A蛋白诱导人肺癌细胞SPC-A1的凋亡

目的研究禽流感病毒NS1A蛋白对人肺癌细胞SPC-A1增殖的影响。方法将含有NS1A基因的重组质粒pVAX1-NS1A经脂质体介导转染人肺癌细胞SPC-A1,用MTT检测其对细胞增殖的抑制作用;Annexin VFITC-PI结合流式细胞仪检测细胞凋亡率;PI结合流式细胞仪检测细胞周期的变化;对转染细胞的表达产物进行Western blot分析。结果NS1A蛋白能抑制人肺癌细胞SPC-A1增殖且呈时间依赖性。随着作用时间延长,重组质粒转染组细胞凋亡率可达38.17%,细胞周期中G0/G1比例升高,G1期阻滞。Western blot分析显示,重组质粒转染组细胞在相对分子质量约30000处可见特异性反应条带,与NS1A蛋白产物大小相符。结论禽流感病毒NS1A蛋白能够抑制SPC-A1细胞增殖,并诱导SPC-A1细胞凋亡。     

重组EB病毒Zta蛋白的原核表达及纯化

目的原核表达重组EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)Zta蛋白,并进行纯化。方法 PCR扩增EBV B95-8株BZLF1n氨基端基因,分别插入pThioHisA和pcDNA3.1载体中,构建重组表达质粒pThioHisA-BZLF1n和pcDNA3.1-BZLF1n。用pcDNA3.1-BZLF1n质粒免疫ICR小鼠,制备抗血清。将质粒pThioHisA-BZLF1n转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,优化诱导表达条件。表达产物经亲和层析后,用肠激酶切割,再经离子交换层析,纯化产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果重组表达质粒经双酶切和测序证明构建正确。表达的重组蛋白相对分子质量约为32 000;IPTG终浓度为0.1 mmol/L,37℃诱导6 h,目的蛋白的表达量最高,占菌体总蛋白的30%以上;重组蛋白以包涵体和可溶性两种形式表达。纯化的重组蛋白相对分子质量约为18 000,纯度大于95%,可与制备的小鼠抗血清发生特异性反应。结论在大肠杆菌中高效表达了重组EBV Zta蛋白,纯化的重组蛋白纯度较高,特异性良好,为EBV相关疾病的早期诊断筛查奠定了基础。     

乙型脑炎病毒SA14-14-2株NS3基因的克隆及原核表达

目的克隆并表达乙型脑炎病毒SA14-14-2株NS3编码区的基因片段,为重组蛋白进一步的功能研究奠定基础。方法提取乙脑病毒SA14-14-2株总RNA,用RT-PCR法扩增NS3-1、NS3-2基因片段,克隆入原核表达载体pET15bTAT中,构建重组原核表达质粒,转化大肠杆菌Rosetta2,IPTG诱导表达。表达产物经Ni2+亲和层析柱纯化后,进行Western blot鉴定。结果重组原核表达质粒pET15bTAT-NS3-1和pET15bTAT-NS3-2经酶切证明构建正确。表达的重组蛋白相对分子质量约为27000和20000,主要以包涵体的形式表达。重组蛋白纯化后纯度可达80%以上,并可被小鼠抗乙型脑炎病毒SA14-14-2株血清识别。结论已成功克隆了乙型脑炎病毒SA14-14-2株NS3-1和NS3-2基因,并在大肠杆菌Rosetta2中获得表达。     

H1N1亚型流感病毒M1基因重组杆状病毒的构建及鉴定

目的构建H1N1亚型流感病毒M1基因重组杆状病毒,并进行鉴定。方法 PCR扩增H1N1亚型流感病毒(A/PR/8/34)全长M1基因,与pFastBacdua(lpFBD)载体连接,构建重组杆状病毒转移载体pFBD-M1,转化含有Bacimd和Helper质粒的DH10Bac感受态细胞,获得骨架质粒rBacmid-M1,将其转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBac-M1。采用噬斑形成法检测病毒滴度,PCR法检测M1基因的插入,间接免疫荧光、Western blot和ELISA法检测M1蛋白的表达。结果重组杆状病毒骨架质粒rBacmid-M1经PCR鉴定证实构建正确;第3代rBac-M1病毒滴度为3×108pfu/ml;感染rBac-M1的sf9细胞经PCR扩增可见3 300 bp的条带,间接免疫荧光检测可见特异性绿色荧光,Western blot检测可与鼠抗流感病毒(PR8)和鼠抗M1蛋白(PR8)多克隆抗体发生特异性反应,ELISA检测M1蛋白可与鼠抗流感病毒(PR8)多克隆抗体发生特异性反应,具有良好的反应原性。结论已成功构建了H1N1亚型流感病毒M1基因重组杆状病毒,为进一步研究流感病毒M1的功能及新型流感疫苗开发奠定了基础。     

乙型脑炎病毒SA14-14-2株NS1和E蛋白的原核表达及其免疫原性

目的原核表达乙型脑炎病毒(JEV)NS1和E蛋白,并初步探讨其免疫原性。方法采用RT-PCR法扩增JEVSA14-14-2株NS1和E蛋白基因片段,分别克隆入原核表达载体pET-30a(+)和pET-32a(+),构建重组表达质粒pET-30NS1和pET-32Et,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析目的蛋白的表达形式及表达水平。两种蛋白经亲和层析纯化后,Western blot鉴定其反应原性。通过小鼠主动和被动保护力试验及豚鼠病毒血症试验,检测两种蛋白的免疫原性。结果酶切及测序证明重组表达质粒构建正确;表达的重组NS1和E蛋白的相对分子质量分别约为40000和47000,均以包涵体形式表达;纯化的重组NS1和E蛋白的浓度分别为160.7和380μg/ml,均具有良好的反应原性;小鼠主动和被动保护力试验表明两种蛋白均有保护活性;豚鼠病毒血症试验显示,NS1蛋白免疫豚鼠后能明显抑制病毒血症的产生。结论已成功表达并纯化了JEVSA14-14-2株NS1和E蛋白,两种蛋白均有较好的免疫保护活性。     

HIV-1 Vif基因的克隆与原核表达

目的克隆HIV-1Vif基因编码区序列,并在原核细胞中表达。方法构建原核表达载体pMRI,将Vif基因序列克隆至该载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,菌体裂解后获得特异性表达蛋白,用组氨酸标签特异性亲和树脂分离纯化该蛋白,并经SDS-PAGE及Westernblot鉴定。结果表达质粒pMRI-Vif经双酶切,可见约600bp的Vif基因片段,测序结果证明质粒构建正确。在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达了可溶性Vif蛋白,纯化后经凝胶自动扫描分析,纯度达85%以上,蛋白浓度约为1g/L。纯化产物具有良好的抗原特异性。结论在大肠杆菌中高效表达了可溶性Vif蛋白。     

结核分枝杆菌TB10.4与呼吸道合胞病毒F1蛋白的融合表达

目的在大肠杆菌中融合表达结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)TB10.4蛋白与呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)F1蛋白。方法从MTB标准菌株H37Rv全基因组中扩增TB10.4(N/X)和TB10.4(N/B)基因,分别插入原核表达载体pET-28a和pET-30a中,构建重组表达质粒TB10.4(N/X)/pET-28a和TB10.4(N/B)/pET-30a;从F/18T/DH5α菌株中扩增F1(B/X)基因,与TB10.4(N/B)/pET-30a质粒连接,构建重组表达质粒TB10.4-F1/pET-30a;将质粒TB10.4(N/X)/pET-28a和TB10.4-F1/pET-30a分别转化感受态E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达;表达的重组蛋白进行Western blot鉴定。结果重组表达质粒TB10.4(N/X)/pET-28a和TB10.4-F1/pET-30a经双酶切及测序证明构建正确;表达的重组TB10.4和TB10.4-F1蛋白相对分子质量约为13 000和59 000,可与鼠抗His单抗特异性结合。结论成功在大肠杆菌中表达了重组融合蛋白TB10.4-F1,为进一步研究其免疫原性及保护性奠定了基础。     

结核分枝杆菌ATP依赖的丝氨酸蛋白酶蛋白水解亚基1基因的原核表达

目的构建结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)ATP依赖的丝氨酸蛋白酶蛋白水解亚基1(ATP-dependent Clp proteolytic subunit 1,ClpP1)基因重组原核表达质粒,并在大肠埃希菌中表达重组蛋白。方法从结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA中PCR扩增ClpP1基因,插入原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组表达质粒pET-32a(+)-ClpP1,转化大肠埃希菌B21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果重组表达质粒pET-32a(+)-ClpP1经双酶切和测序鉴定,证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约35 000,可与鼠抗His单克隆抗体特异性结合。结论成功构建了重组表达质粒pET-32a(+)-ClpP1,并在大肠埃希菌中表达了重组蛋白,为进一步研究ClpP1蛋白在MTB中的生物学特性奠定了基础。     

Vif-ΔN28和Cullin5-N138蛋白的表达及纯化

目的获得高纯度的Vif-ΔN28和Cullin5-N138蛋白。方法以Vif/VR1012质粒为模板,PCR扩增出Vif-ΔN28基因并插入pRSETB质粒。将构建的原核表达载体Vif-ΔN28/pRSETB以及已有的Cullin5-N138/pRSETB质粒分别转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,产物经Ni-NTA离子纯化柱纯化、复性。结果所表达的Vif-ΔN28和Cullin5-N138蛋白约占各自菌体总蛋白的20%,纯化后蛋白纯度均可达90%以上。结论已成功构建了Vif-ΔN28原核表达质粒,并在大肠杆菌中高效表达,获得了可溶性的纯化的Vif-ΔN28和Cullin5-N138蛋白。     

穿膜肽HIV-TAT与呼吸道合胞病毒G蛋白片段G1及CTL表位融合蛋白的表达及纯化

目的在大肠杆菌中表达含穿膜肽HIV-TAT与呼吸道合胞病毒(RSV)G蛋白片段G1及CTL表位的融合蛋白,并进行纯化。方法以质粒pET-G1F/M2为模板,扩增含TAT、RSVG蛋白片段G1和CTL表位F/M2的融合基因片段,与原核表达质粒pET-His连接,构建融合表达质粒pET-TAT-G1F/M2,转化E.coli BL21(DE3)plysS进行诱导表达,采用Ni2+螯合亲和层析法纯化经尿素变性的包涵体,梯度透析复性纯化的目的蛋白,并进行Westernblot鉴定。结果在E.coli中可高效表达重组蛋白TAT-G1F/M2,表达量占菌体总蛋白的30%以上,目的蛋白主要存在于包涵体中。经变性、纯化、复性可获得高纯度(>95%)特异性的TAT-G1F/M2蛋白。结论已在大肠杆菌中成功表达了融合蛋白TAT-G1F/M2,为进一步进行RSV体内体外免疫学研究奠定了基础。     

人类免疫缺陷病毒1型C亚型核心蛋白(Gag)在大肠杆菌中的表达

目的表达人免疫缺陷病毒1型C亚型核心蛋白Gag,为HIV感染的诊断和疫苗的研制奠定基础。方法通过PCR扩增获得HIV1gag基因片段,并将其克隆到原核表达载体pGEX5X1的tac启动子下游,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,以SDSPAGE和Westernblot分析验证其表达产物。结果表达产物是相对分子质量为82000的GST融合蛋白,且能与抗p24单克隆抗体发生特异性反应。结论重组Gag蛋白在大肠杆菌中得到了有效表达,且具有良好的抗原性,可进一步用于HIV感染及动物免疫等方面的研究。     

小鼠MUC1基因的克隆及其在大肠杆菌DH5α中的表达

目的构建表达小鼠MUC1基因的工程菌,并纯化重组小鼠MUC1融合蛋白。方法通过RT-PCR扩增小鼠MUC1基因片段,连入pMAL-p2原核表达载体,并转化大肠杆菌DH5,αIPTG诱导表达,经Western blot鉴定,Amylose Resin亲和层析纯化。结果获得了小鼠MUC1 708bp DNA片段,并构建了pMAL-mMUC1表达载体。表达产物相对分子质量约为67000,经Western blot鉴定,与兔抗MBP多克隆抗体产生特异性反应。纯化的融合蛋白在SDS-PAGE图谱上呈单一条带。结论成功构建了表达小鼠MUC1蛋白的工程菌。