一种筛选人γ干扰素McAb方法

本文报道一种以间接ELISA 法为基础的人γ干扰素McAb筛选法。通过比较固相载体的吸附能力,选出了吸附rHuIFN-γ能力较强的载体。为选择合适包被剂量,测定了rHuIFN-γ包被浓度与检测灵敏度的关系。通过分析酶标抗体稀释液对反应结果的影响,发现不含 BSA的稀释液更有利于抗原抗体特异性反应。为确定间接 ELISA法检测范围,测定了rHuIFN-γ抗体的剂量反应曲线。通过增加第二酶标抗体,大大提高检测的灵敏度。大量的检测研究证明本方法较中和法合理,根据是:①可能筛选到多种γ干扰素McAb;②快速(由2天缩短至4 小时);③敏感(约高20倍);④稳定(测定内误差和测定间误差较小)。     

应用单克隆抗体测定纤维连结蛋白ELISA方法的建立

本文介绍用McAb作为包被和检测抗体进行双抗体夹心ELISA来测定人血浆纤维连结蛋白。通过实验找出最佳条件,即两种McAb混合使用,在McAb和酶结合物稀释液内加入4％PEG及使用TMBI底物的最适浓度等,该法敏感性可达80ng/ml,可作为临床常规方法使用。     

荧光法研究免疫试验抗体包被过程

目的:以荧光法作为定量和示踪手段,研究免疫试验中抗体在固相载体上包被的行为及意义。方法:以异硫氰酸荧光素(FITC)标记后的抗体包被固相载体,构建化学发光免疫分析(CLIA)体系。通过荧光光度计精确测定包被前后包被液中游离抗体的浓度,定量抗体的包被量,并研究其包被量对免疫反应的影响。结果:抗体包被量与CLIA发光值非线性相关;间接法较直接吸附法包被更有利于保持抗体活性;热处理后化学发光系统发光值降低与包被抗体脱落有关。结论:荧光法为构建有效CLIA体系提供了一种研究方法。     

用酶标Ig交叉反应性单抗作间接ELISA检测肾综合征出血热(HFRS)病毒抗体

<正> 自Tkachenko等和Gavrilovskaya等应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测了HFRS病毒抗体以来,ELISA在HFRS的诊断与血清流行病学调查上的应用得到不断的发展。1986年,柴瑞珍等建立了ELISA抗IgM固相法检测人血清中的IgM抗体,但若用于不同种属血清的检测则需选用不同的固相包被抗体。本文在制备了Ig交叉反应性单抗(McAb)的基础上,制备了可用于人、猪、兔血清IgG检测的酶标McAb,建立了检测人、猪、兔血清中HFRS病毒抗体的ELISA间接法。     

建立固相Capture-ELISA技术诊断糖尿病人HCMV活动性感染

目的建立检测HCMV抗原特异性IgM的抗体捕捉酶联免疫吸附试验（IgM antibody capture enzyme-linked immunosorbent assay,Capture-ELISA）,并分析糖尿病患者HCMV活动性感染状态。方法利用抗人IgM（μ链特异性）抗体包被固相载体,作为＂捕捉抗体＂吸附待检血清中的IgM,经过洗涤除去血清中IgG及其它成分,再加入特异性抗原与＂捕捉＂到的相应IgM抗体结合,然后加入酶标抗体和底物显色进行测定。同时,应用建立的酶联免疫捕获法诊断糖尿病患者HCMV近期感染状态,并与常用的间接酶联免疫吸附试验（In-ELISA）及RT-PCR进行比较。结果 Capture-ELISA的特异性及敏感性均高于间接法,且不受RF因子的影响。结论 Capture-ELISA操作简单、快速,且具有较高的特异性和灵敏度,是检测IgM抗体理想的方法之一。     

定量检测破伤风类毒素酶联免疫吸附法的建立及初步应用

目的：建立定量检测破伤风类毒素（TT）抗原的双抗体夹心ELISA法,并探索其初步应用。方法：以TT抗毒素为包被抗体,大鼠抗TT多抗为检测抗体,采用相应酶标抗体检测TT抗原含量,建立双抗体夹心ELISA法,并进行方法学验证。结果：TT含量在0～0.062 5 Lf/ml范围内线性关系良好（r>0.99）。该方法与白喉类毒素、百日咳类毒素、百日咳丝状血凝素及百日咳黏附素无明显交叉反应,重复性好,特异性较强,精密度及准确度验证均符合常规质控要求。该法准确检测范围为0.000 625～0.040 000 Lf/ml,定量限度为0.000 625 Lf/ml。采用该方法对TT抗原进行吸附率检测,分别采用该法和絮状单位测定法测定6批TT的絮状含量,2种检测方法高度相关（r=0.94）。结论：建立的定量检测TT的双抗体夹心ELISA法为破伤风疫苗生产过程中TT质量控制提供了有效技术手段。     

检测人博卡病毒抗体间接酶联免疫吸附法的建立及临床应用

目的 建立间接酶联免疫吸附法(ELISA)检测人博卡病毒(HBoV)抗体,探讨其临床应用的可行性.方法 以重组表达的HBoV融合蛋白VP2作为包被抗原,建立检测HBoV抗体的间接ELISA,优化该检测方法的最佳条件,观察其精密度、敏感度和特异性,并与荧光定量PCR方法对比检测40份临床样本,同时采用免疫印迹法(Western blot)确认其符合率.结果 所建立的间接ELISA最佳抗原包被浓度为2 mg/L,酶标二抗工作浓度为1∶5000,血清标本最佳稀释度为1∶200.该方法平均批内变异系数为6.87%,平均批间变异系数为4.67%.40份临床样本间接ELISA检测结果与荧光定量PCR及免疫印迹结果一致,符合率100%.结论 利用VP2融合蛋白作为抗原,建立的检测血清HBoV抗体间接ELISA方法特异性强、重复性好,可用于HBoV抗体的定量和定性检测.     

检测人博卡病毒抗体间接酶联免疫吸附法的建立及临床应用

目的 建立间接酶联免疫吸附法(ELISA)检测人博卡病毒(HBoV)抗体,探讨其临床应用的可行性.方法 以重组表达的HBoV融合蛋白VP2作为包被抗原,建立检测HBoV抗体的间接ELISA,优化该检测方法的最佳条件,观察其精密度、敏感度和特异性,并与荧光定量PCR方法对比检测40份临床样本,同时采用免疫印迹法(Western blot)确认其符合率.结果 所建立的间接ELISA最佳抗原包被浓度为2 mg/L,酶标二抗工作浓度为1∶5000,血清标本最佳稀释度为1∶200.该方法平均批内变异系数为6.87%,平均批间变异系数为4.67%.40份临床样本间接ELISA检测结果与荧光定量PCR及免疫印迹结果一致,符合率100%.结论 利用VP2融合蛋白作为抗原,建立的检测血清HBoV抗体间接ELISA方法特异性强、重复性好,可用于HBoV抗体的定量和定性检测.     

三种酶标板的灵敏性和孔间重复性的比较

<正> 酶联免疫吸附测定法(ELISA)要求高质量的载体,本文用双抗体夹心法和间接法包被可溶性蛋白和细胞抗原,对上海地区生产的三种酶标板——聚氯乙烯软板(卫生部上海生物制品研究所生产)、聚苯乙烯活动板(上海塑料制品研究所和上海医学化验所合作研制)和硬板(上海塑料三厂生产),比较了它们的灵敏性和孔间重复性。现将结果报告如下,供实验室工作者选用酶标板时参考。     

免疫酶斑点试验检测AFP的初步报告

本文以硝酸纤维素膜(Nitrocellulose paper,NCP)作载体首次建立了检测AFP的免疫酶斑点试验(Immnue Enzyme Dot Assay,IEDA),其原理与ELISA夹心法基本相同。我们首先以AFP标准品作试验,进行方法学探索,选出最佳包被抗体浓度为100μg/ml,酶抗体稀释度为1:2000,同时发现包被过程中的封闭处理能减少非特异性反应,叠氮钠终止反应能确保显色结果稳定。试验证明,此方法特异性强,重复性好,灵敏度达1.25μg/ml。本法检测17例患者血清,其AFP含量与RIA结果相吻合。     

人类巨细胞病毒IgG抗体ELISA检测试剂的研制

目的建立并评价人类巨细胞病毒PP65 Ig G抗体间接ELISA检测试剂。方法原核表达并纯化重组HCMV PP65332~561蛋白,包被酶标板,优化试剂检测条件,试制HCMV-Ig G间接ELISA试剂,分析试剂的精密度,并通过对100份样本的检测,与市售进口HCMV-Ig G间接ELISA试剂比较,分析了自制试剂的特异性、敏感性和符合率。结果试制的ELISA试剂批内和批间变异度均小于10%,与其他疱疹病毒感染血清均无交叉反应;与进口试剂的总符合率达到95%。结论该方法具有良好的特异性、敏感性,稳定性和可重复性,为HCMV病毒感染的流行病学调查提供了新的备选方法。     

小鼠抗KLH多克隆抗体的制备及TDAR实验间接ELISA定量检测方法的建立北大核心CSCD

目的:通过制备小鼠抗KLH多克隆抗体,优化反应条件建立KLH特异性抗体ELISA定量分析方法,以期提供一种特异性好、灵敏度高及误差低的TDAR实验检测方法。方法:利用盐析沉淀和亲和层析纯化技术分离和纯化小鼠抗KLH特异性多克隆IgG抗体;以纯化后的抗体作为标准品,建立TDAR实验间接ELISA定量检测方法,并对该方法进行线性范围、特异性、变异系数(CV)及检测限验证。结果:以KLH包被浓度为80μg/ml,山羊抗小鼠IgG/HRP酶标二抗的稀释倍率为1∶20000条件进行间接ELISA定量分析的方法学验证,检测线性范围为390.63~25000 ng/ml,R^(2)=0.9848,线性良好;批内和批间CV均<10%;检测限为194.83 ng/ml。结论:通过制备抗KLH多克隆抗体,并优化实验反应条件来建立间接ELISA定量分析方法,其线性范围、特异性及批内、批间CV均满足实验要求,是一种高灵敏度的TDAR实验检测方法。     

一种测定乙型肝炎表面抗原的快速酶联免疫吸附剂试验

本文报告一种测定 HBsAg 的快速ELISA,对蛋白吸附至聚苯乙烯载体及抗原抗体反应的动力学作了观察。选择亚适当反应时间,从抗体包被载体开始直至反应终末,全程仅需20分钟,具有特异、重复性好和高灵敏度的优点。     

Pfs25蛋白单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA的建立

目的:制备恶性疟原虫子孢子囊表面膜蛋白Pfs25的单克隆抗体( mAb),建立检测Pfs25蛋白的双抗体夹心ELISA方法.方法:纯化毕赤酵母表达的重组Pfs25蛋白,并免疫BALB/c小鼠,采用骨髓瘤细胞Sp2/0与免疫BALB/c鼠脾细胞杂交的细胞融合技术,通过间接ELISA检测获得分泌抗Pfs25抗体的阳性杂交瘤细胞株,通过免疫F1鼠诱生腹水,纯化腹水,并进行mAb的各项生物学鉴定.辣根过氧化物酶(HRP)标记纯化后的抗体,以4B7为包被抗体,1B4为酶标抗体,建立了双抗体夹心ELISA法.结果:获得3株抗Pfs25的杂交瘤细胞株,其中2株有良好的稳定性和特异性.并建立了双抗体夹心ELISA检测法,检测有效范围在0.07～1 mg/mL,其检测灵敏度为41.6 ng/mL.结论:成功制备抗Pfs25蛋白的单克隆抗体,并建立了一种可用于Pfs25蛋白检测的双抗体夹心ELISA法,为Pfs25蛋白制备传播阻断型疟疾疫苗奠定了基础.     

表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)单链抗体亲和力检测的间接ELISA的建立及优化

目的建立检测表皮生长因子受体变体Ⅲ(EGFRvⅢ)单链抗体PD0721亲和力检测的ELISA,并且对实验条件进行优化。方法利用本课题组制备的单链抗体PD0721,建立检测PD0721单链抗体亲和力的间接ELISA,并采用棋盘滴定法对实验条件中的抗体抗原浓度、二抗浓度、包被条件等方面进行优化,对本方法的灵敏度及精密度进行考察。结果使用PBS稀释抗原至1.25 mg/L于4℃包被12 h,加入120 ng/mL PD0721单链抗体以及1∶8000的酶标抗体为最佳检测结果。优化后的结果,在PD0721单链抗体浓度为15 ng/mL~480 ng/mL范围内回归模型拟合效果良好,最低检测限为7.5 ng/mL。组内差异系数为0.11%~0.99%,组间差异系数为0.68%~3.15%。结论建立了能准确、稳定检测PD0721单链抗体亲和力的间接ELISA。     

建立夹心ELISA检测RANTES方法及在小肠移植中的应用

背景：RANTES 及其受体介导的细胞免疫是同种异体小肠移植急性排斥反应发生的重要组成部分,小肠移植后血清中RANTES 水平有可能作为早期检测急性排斥反应发生的较敏感的免疫指标。 目的：建立夹心ELISA检测RANTES的方法,并将其应用于大鼠小肠移植模型,探讨其作为检测早期急性排斥反应指标的可能性。 方法：以辣根过氧化物酶标记RANTES mAbs,通过竞争ELISA检测抗RANTES mAb 识别的表位,建立双夹心ELISA试剂盒并检测其敏感性,然后将其应用于大鼠小肠移植模型中RANTES的检测。 结果与结论：以anti-RNATES mAb No.2 (5 mg/L) 为包被抗体,HRP-anti-RNATES mAb No.4(1∶800)为酶标抗体建立了双抗体夹心ELISA法,其敏感性达到0.5 μg/L。异基因大鼠小肠移植模型术后血清RANTES明显增高。提示成功建立了特异性强、灵敏度良好的检测RANTES的双抗体夹心ELISA法,为早期诊断小肠移植排斥反应提供了一种新的方法。     

人N端前脑钠肽ELISA定量检测方法的建立及初步应用

建立一种检测人血清中N端前脑钠肽含量的双抗体夹心ELISA方法。采用配对人N端前脑钠肽抗体,通过对其包被条件与封闭条件、包被与酶标抗体工作浓度、反应模式、线性范围、批内批间精密性、回收率、干扰因子试验、临床标本检测等研究,建立人N端前脑钠肽ELISA定量检测方法并评价其性能。实验确定了最适包被抗体稀释用缓冲液为0.05mol/L pH9.6CB,温度及时间为4℃18h;最适封闭液为0.6%BSA,温度及时间为4℃18h;包被抗体最适浓度为4μg/ml,酶标抗体最佳浓度为1∶3000;最佳反应模式为37℃样本孵育30min,酶标二抗孵育30min,显色20min的两步法反应模式。性能评价显示建立的检测方法线性范围为50~500pg/ml,批内及批间精密度分别为2.3%和3.4%。高、中、低值回收率分别为101.2%、97.2%、93.7%。干扰因子试验结果显示黄疸、脂血及低浓度溶血对试验结果无较大影响,但标本随溶血程度的增加其影响程度也增大。共做了248份临床血清,200份用来评价试剂盒的临床使用性能,结果显示总体符合率为96.9%,说明可用于临床心衰患者的检测;同时与国外试剂盒对比检测48份临床血清,结果显示两者相关性较好,回归方程:Y=0.8017X+188.3,R2=0.9027。初步建立了一种检测人血清中N端前脑钠肽含量的ELISA方法,该方法具有较高的准确性和精密度。     

检测结核杆菌抗原的双抗体夹心间接ELISA法的建立及其应用

作者建立了一种检测结核分枝杆菌抗原的双抗体夹心间接ELISA的方法并介绍了其应用情况。用鼠源性抗结核杆菌单克隆抗体包被酶标反应板,依次加入经0.5％胰蛋白酶消化的肺结核病人痰液标本,人免抗结核杆菌超免疫血清和酶标羊抗兔IgG孵育后(每步均经孵育,洗涤),加底物显色。试验中采用结核杆菌Ho7RV株聚合OT免疫家兔制备的超免疫血清作为桥联抗体,既为试验的特异性奠定了基础,也避免了标记IgG的繁冗操作,减少了IgG的活性损失。     

TpN17重组抗原的表达及在梅毒血清学诊断中的初步应用

目的用基因工程技术表达梅毒螺旋体TpN17重组抗原,并建立操作简便、特异性好、敏感性高的梅毒血清抗体间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测。方法采用PCR技术扩增梅毒螺旋体TpN17基因,再进行T-A克隆及测序,然后亚克隆到原核表达载体中,以亲和层析法纯化重组蛋白。将重组蛋白包被于反应板,建立检测血清中梅毒抗体的ELISA间接检测法,利用该法与梅毒螺旋体血凝试验(TPHA)、甲苯胺红不加热血清试验(TRUST)同时检测血清样品,对其结果进行比较研究。结果TpN17重组蛋白在大肠杆菌BL21中得到稳定表达,并成功建立了检测血清中梅毒抗体的ELISA间接检测法及试剂。对135例梅毒可疑患者血清进行检测,ELISA、TPHA和TRUST的检出阳性率分别为82.96%、98.52%和71.11%,而TRUST测出的8例可疑样品及31例阴性样品中,TPHA结果全部阳性、而ELISA只有2例阴性。结论TpN17重组抗原ELISA试剂在特异性和敏感性上明显优于TRUST法。     

尖吻蝮蛇血凝酶抗体检测方法的建立及其应用

目的建立尖吻蝮蛇血凝酶(商品名苏灵,代号Saculin)多克隆抗体检测的间接ELISA法,并应用于其临床免疫学检测。方法免疫家兔获得多克隆抗体,Western blot鉴定其特异性,通过比较各种不同条件的检测结果来确立检测尖吻蝮蛇血凝酶多克隆抗体的间接ELISA法的最佳工作条件,并以此为参考检测临床血清。结果间接ELISA法测定兔抗血清效价高达1∶6 553 600,55例临床试验受试者(36例为Saculin实验组,19例为安慰剂组)给药3周后血清抗体检测结果均为阴性。结论本研究建立的抗尖吻蝮蛇血凝酶多克隆抗体间接ELISA法能够用于临床血清的判定。