多药耐药相关蛋白-3表达与肝癌耐药的相关性

目的 探讨多药耐药相关蛋白-3(MRP-3)的表达与肝癌耐药的相关性.方法 应用RT-PCR方法检测正常肝细胞L-02、肝癌细胞BEL及肝癌耐药细胞HepG2/ADM中MRP-3 mRNA的差异表达,再将MRP-3反义及正义寡核苷酸片段分别用脂质体转染进肝癌耐药细胞HepG2/ADM中,用MTT法、流式细胞仪及RT-PCR检测转染后细胞内阿霉素(ADM)的荧光强度、耐药指数及MRP-3 mRNA的表达情况.结果 肝癌耐药细胞HepG2/ADM中MRP-3 mRNA的表达明显高于正常肝细胞L-02和肝癌细胞BEL(P<0.05).MRP-3反义转染进耐药细胞后,可明显降低细胞内ADM的耐药指数,提高细胞内ADM浓度(P<0.05),细胞内MRP-3 mRNA的表达较未转染细胞下降了62.5%(P<0.05).结论 MRP-3的高表达可能是导致肝癌多药耐药的机制之一.     

人肝癌多药耐药细胞株的建立及超声波诱导凋亡的研究

目的 建立人肝癌细胞系HepG2多药耐药模型并探讨低频脉冲式超声对其凋亡的影响及其机制。 方法 以人肝癌细胞株HepG2为研究对象,用阿霉素(ADM)浓度梯度递增诱导法,建立人肝癌细胞多药耐药模型(简称HepG2/ADM)。将研究对象分为HepG2/ADM、HepG2/ADM ADM、HepG2/ADM 超声波、HepG2/ADM ADM 超声波4组,以频率为0.8 MHz,声强为0.5 w/cm2,时间10 min的脉冲式超声波作用于研究对象。荧光显微镜观察细胞变化;DNA片段化分析检测染色体断裂情况;流式细胞仪检测细胞凋亡率。 结果 HepG2/ADM细胞对多种化疗药耐药,对阿霉素的耐药倍数为26,其耐药性与P-糖蛋白(P-GP)、多药耐药相关蛋白(MRP)、肺耐药蛋白(LRP)及谷胱甘肽转移酶(GST)的过表达相关。实验组经超声波作用10 min后,HepG2/ADM细胞死亡具有细胞凋亡的形态学特征;HepG2/ADM ADM和HepG2/ADM 超声波组细胞凋亡率分别为3.47％和12.23％;HepG2/ADM ADM 超声波联合治疗能显著增加细胞凋亡率,为18.81％,与对照组比较差异有显著性,t值分别为1.46、2.67、5.36,P<0.01。结论 人肝癌多药耐药细胞株HepG2/ADM具有多药耐药特性;低频脉冲式超声可诱导人肝癌多药耐药细胞株HepG2/ADM凋亡,联合化疗药物治疗,可显著增加细胞凋亡比例。     

重组腺病毒载体携带多药耐药基因1反义RNA靶向逆转肝癌细胞多药耐药

目的 探讨携带多药耐药基因1(multidrug resistance gene 1,mdr1)反义RNA的重组腺病毒载体靶向逆转甲胎蛋白阳性(AFP+)的肝癌多药耐药细胞HepG2R的疗效及作用机制.方法 分别构建携带AFP启动子和mdr1基因反义核苷酸片段的重组腺病毒载体Adeno-asmdr及携带AFP启动子和增强绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒载体Adeno-EGFP,将Adeno-EGFP转染人正常肝细胞L02(AFP-),人官颈癌细胞HeLa(AFP-)及HepG2(AFP+)细胞,检测增强绿色荧光蛋白基因在各细胞的转录水平;将Adeno-asmdr转染HepG2R细胞,Western blot检测不同时间P-gp170的表达,末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记法检测HepG2R细胞凋亡,流式细胞术检测HepG2R细胞在不同药物作用下细胞周期、凋亡率.结果 增强绿色荧光蛋白基因在AFP阳性的HepG2细胞可得到显著转录,而在L02细胞和HeLa细胞,其转录减少,显示了该载体的良好转录活性以及靶向特异性.Adeno-asmdr转染HepG2R细胞后,HepG2R细胞P-gp170表达明显减弱,HepG2R细胞凋亡增加,HepG2R细胞对多种化疗药物的耐受能力明显下降,细胞出现显著的周期阻滞,大量细胞被阻滞于S期和G0/M期,凋亡细胞比例增加.结论 实验构建的Adneo-asmdr重组腺病毒载体可在AFP阳性HepG2R细胞内特异靶向性表达目的 基因,并可有效降低mdrl基因产物P-gp170的表达,从而达到对HepG2R细胞多药耐药的逆转作用.     

P38MAPK磷酸化对HepG2细胞耐药的影响及其意义

目的 探讨p38MAPK磷酸化对HepG2细胞耐药的影响及其意义.方法 采用浓度递增法,建立动态HepG2/顺铂(CDDP)耐药模型,Western blot检测磷酸化p38的表达;予以p38MAPK特异性抑制剂SB203580分别处理24、48、72 h后,流式细胞仪动态分析HepG2/CDDP耐药细胞周期、四甲基偶氮唑盐法检测顺铂对HepG2/CDDP耐药细胞的半数药物抑制浓度(IC50)、Western blot检测HepG2/CDDP耐药细胞凋亡分子Bcl-2、Bax及P-gp蛋白的表达.动态耐药模型磷酸化P38的检测行单因素方差分析; SB203580处理后计量资料行3×3析因设计方差分析,率的比较采用x2检验.结果 成功建立HepG2/CDDP耐药细胞株,其对CDDP的IG50值与对照HepG2细胞差异具有统计学意义(t=99.30,P<0.01);随着HepG2/CDDP耐药细胞株耐药表型的增强,P38MAPK活化水平逐渐增强(F=69.39,P<0.01).P38MAPK特异性抑制剂SB203580可逐渐降低HepG2/CDDP对顺铂的IC50值(F=2350,P<0.01)、G0/Gl期细胞比例(x2=520,P<0.01)、Bcl-2/Bax表达比值(F=83.8,P<0.01)及细胞膜药物转运相关蛋白P-gP的表达(F=107,P<0.01).结论 P38活化水平随着肝癌耐药细胞株耐药表型的增强而逐渐升高;抑制P38的活化可有效逆转肝癌HepG2/CDDP耐药细胞株的耐药性.     

三磷酸腺苷结合盒G2调控肝癌细胞多药耐药的作用

目的探讨三磷酸腺苷结合盒(ABC)G2在肝癌耐药细胞中的表达及其在肝癌细胞耐药中的作用。方法 MTT法检测阿霉素(ADM)作用肝癌SMMC-7721细胞24 h后半数生长抑制浓度(IC50)。利用药物浓度递增细胞培养方法建立肝癌耐药细胞,在SMMC-7721细胞培养液中加入ADM,逐渐提高ADM浓度,浓度从0.001μg/ml提高至0.100μg/ml,使细胞在0.100μg/ml ADM中稳定生长,命名为SMMC-7721/ADM细胞。倒置显微镜下观察SMMC-7721/ADM及其亲代SMMC-7721细胞形态。MTT法检测ADM作用肝癌耐药细胞SMMC-7721/ADM 24 h后的IC50,计算耐药指数。流式细胞术(FCM)检测SMMC-7721/ADM及其亲代SMMC-7721细胞凋亡、周期及细胞中ABCG2蛋白表达水平。结果 ADM对SMMC-7721细胞的IC50=(1.11±0.09)μg/ml。历时3个月时间成功使SMMC-7721/ADM细胞在含0.100μg/ml ADM的细胞培养液中稳定生长,细胞命名为SMMC-7721/ADM。倒置显微镜下观察,SMMC-7721/ADM细胞体积增大,细胞形态变得更不规则。SMMC-7721/ADM与SMMC-7721细胞相比细胞凋亡率无显著差异(P0.05),细胞G0/G1期显著降低(P0.05),细胞S及G2/M期无显著差异(P0.05)。SMMC-7721/ADM与SMMC-7721细胞相比,细胞中ABCG2蛋白表达水平显著增高(P0.05)。结论 ABCG2在肝癌多药耐药细胞中异常增高,高表达的ABCG2参与了肝癌多药耐药的形成。     

高温对SGC7901/ADM细胞多药耐药蛋白表达的影响和意义

目的:研究高温43℃对多药耐药基因表达产物P-gp、MRP、LRP在蛋白水平上的影响及其生物学意义,更深入地了解热效应逆转耐药的机制.方法:采用免疫细胞化学染色法、RT-PCR以及Western blot方法,检测在不同温度和不同药物作用下,人胃癌耐药细胞株SGC7901/ADM和对照的人胃癌敏感细胞SGC7901株中,与人胃癌多药耐药相关的分子MDR1、P-gp、MRP、LRP在蛋白水平上的表达差异.结果:采用免疫细胞化学染色法检测人胃癌耐药株SGC7901/ADM细胞,发现高温43℃60 min处理可使P-gp蛋白表达下调率(down-regulated rate,DRR)31.78%(P=0.016),而MRP表达DRR为20.22%(P=0.037),差异有统计学意义,LRP未表达.采用Western blot法在SGC7901细胞中未检测出P-gp蛋白表达,而SGC7901/ADM细胞中P-gp高表达;在ADM和CDDP处理组细胞中,高温43℃时P-gp的表达量较37℃时DRR分别为45.65%(P=0.007)、17.95%(P=0.021),差异有显著学意义;TAX处理组DRR为11.90%,差异无显著学意义(P=0.065).结论:高温43℃的短期处理对人胃癌SGC7901/ADM细胞中P-gp和MRP多药耐药蛋白的表达有一定的抑制作用,可能是逆转耐药的机制之一.     

携多药耐药基因1反义RNA重组腺病毒逆转肝癌多药耐药细胞的实验研究

目的探讨携带多药耐药基因1(multidrug resistance gene 1,MDR1)反义RNA重组腺病毒载体在裸鼠体内逆转肝癌多药耐药细胞HepG2/阿霉素(adriamycin,ADM)的疗效及作用机制。方法构建携带AFP和asmdr1的重组腺病毒载体Adeno-asmdr1,ADM分级诱导肝癌细胞HepG2为多药耐药细胞HepG2/ADM,建立HepG2/ADM裸鼠皮下移植瘤模型,Adeno asmdr1局部注射,观察移植瘤的体积、透射电镜检测移植瘤组织细胞凋亡、RT-PCR检测MDR1转录水平,评价Adeno-asmdr1的抗肿瘤活性。结果在Adeno-asmdr1 ADM组,移植瘤体积无增大,而PBS组、ADM组体积明显增大;RT-PCR检测移植瘤细胞1周和4周MDR1 mRNA水平, ADM组无明显变化,Adeno-amdr1 ADM组在4周时MDR1转录水平仅为单纯ADM组的20%,经ADM Adeno-asmdr1处理组,可见凋亡增加,ADM组和PBS处理组的裸鼠移植瘤组织中出现少量或没有凋亡。结论携带MDR1反义RNA重组腺病毒部分逆转HepG2/ADM的多药耐药,阻止肿瘤生长,下调MDR1转录水平,导致肿瘤细胞凋亡。     

Reversal of multi-drug resistance by pSUPER-shRNA-mdr1 in vivo and in vitro

AIM： To explore the possibility of reversing multi-drug resistance （MDR） to HepG2/mdr1 in vitro and in vivo with RNA interference （RNAi）. METHODS： HepG2/mdr1 was obtained by cloning the whole gene mdrl into HepG2 cells, shRNA targeting sequence was designed to be homologous to the P-gp encoding MDR1 mRNA consensus sequence, pSUPER- shRNA/mdrl was constructed using the enzyme- digested technique. HepG2/mdrl cells were transfected with vectors of pSUPER-shRNA/mdrl to measure their efficacy by real-time PCR for mdrl mRNA, flow cytometry （FCM） for P-gp expression, and Rhodamine efflux, MTT method for HepG2/mdrl function, respectively. In vivo, mice tumors were treated by injecting pSUPER-shRNA/mdrl in situ and into intra- abdominal cavity. Tumors were collected to create cell suspension and cryosections after chemothearpy with adiramycin and mytomycin. The cell suspension was incubated in RPMI-1640 supplemented with G418 to screen stable cells for appreciating the reversal of MDR. Cryosections were treated with immunohistochemistry technique to show the effectiveness of transfection and the expression of P-gp.RESULTS： pSUPER-shRNA/mdrl was successfully constructed, which was confirmed by sequencing. The MDR phenotype of HepG2/mdr1 was decreased significantly in vitro transfection. HepG2/mdr1 showing its MDR was reversed notably in P-gp expression （11.0% vs 98.2%, P 〈 0.01）. Real-time PCR showed that mRNA/mdrl was lower in test groups than in control groups （18.73± 1.33 vs 68.03±2.21, P 〈 0.001）. Compared with HepG2, the sensitivity of HepG2/ mdrl and HepG2/mdr1-dsRNA cells to ADM was decreased by 1.64 times and 15.6 times, respectively. The accumulation of DNR in positive groups was decreased evidently. In vivo, the p-gp expression in positive groups was significantly lower than that in control groups （65.1% vs 94.1%, P 〈 0.05）. The tumor suppressing rate in test groups was 57.8%. After chemotherapy, the growth rate in test groups was lower than that in control groups （700.14 ± 35.61 vs 1659.70 ± 152.54, P 〈 0.05）. Similar results were also observed under fluorescence microscope, and confirmed by Image-Pro Plus 4.5 analysis. CONCLUSION： pSUPER-shRNA/mdrl vector system allows simple, stable and durable nonviral knockdown of P-gp by RNAi in malignant cells and animals to restore their sensitivity to adriamycin.     

硒化壳聚糖对K562/ADM细胞生物学行为的影响

目的观察硒化壳聚糖对体外培养慢性粒细胞多药耐药白血病细胞株K562/阿霉素(ADM)细胞生物学行为的影响。方法硒化壳聚糖作用于体外培养的K562/ADM细胞12、24 h,应用流式细胞法检测细胞凋亡,软件拟合计算细胞周期;应用免疫印迹法检测P-糖蛋白(P-gp)的表达;应用RT-PCR法检测MDR-1 mRNA水平。结果硒化壳聚糖能够明显增强ADM对K562/ADM细胞的诱导凋亡作用,阻滞细胞周期于G1期(P<0.05,P<0.01),下调P-gp表达和MDR-1 mRNA水平(P<0.05,P<0.01),硒化壳聚糖浓度越高,作用效果越显著。结论硒化壳聚糖能够通过下调MDR-1基因和P-gp表达,阻滞细胞周期于G1期来诱导细胞凋亡,进而对体外培养的K562/ADM细胞耐药生物学行为产生逆转。     

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体对肝癌耐药细胞株阿霉素化疗敏感性的影响

目的 研究肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)联合阿霉素(ADM)处理肝癌耐药细胞株HePG2／ADM对化疗敏感性的影响。方法 通过培养液中ADM的浓度梯度增加法长期筛选培养，建立肝癌HepG2／ADM耐药细胞株，荧光定量PCR检测多药耐药(MDR)1的表达，TRAIL联合化疗药物ADM处理HePG2／ADM，MTT比色法检测细胞增殖，细胞凋亡采用流式细胞仪和TUNEL法检测观察HePG2／ADM对化疗药物的敏感性变化。结果 HepG2／ADM细胞是一个明确的多药耐药细胞模型，联合TRAIL(100ng／L) ADM(0．1mg／L)后，MTT显示HepG2／ADM细胞的增殖明显抑制，流式细胞术、TUNEL法检测TRAIL联合ADM处理HePG2／ADM细胞诱导的凋亡，与对照组相比，凋亡指数显著增加。结论 MDR1不参与TRAIL耐受。TRAIL可部分逆转HepG2／ADM对ADM的耐药，增加其对化疗药物的敏感性。联合TRAIL和亚毒剂量化疗药物可望克服肿瘤细胞中存在的化疗耐药和TRAIL耐受。     

溴隐亭逆转肝癌多药耐药的机制

目的探讨溴隐亭对肝癌多药耐药逆转的作用机制。方法体外实验分亲本细胞HepG2组（A组），耐药细胞HepG2／ADM组（B组）和B组加溴隐亭称为C组。分别检测各组细胞内荧光强度变化，细胞P-糖蛋白、蛋白激酶C—α蛋白表达情况，及5种肿瘤药物半数抑制浓度及耐药指数变化。分别将肝癌细胞HepG2和耐药细胞HepG2／ADM原位种植入裸鼠肝脏内，称A组鼠和B组鼠，另设B组种植鼠给予溴隐亭灌胃治疗称C组鼠。B超观察种植瘤的生长情况，肿瘤大小为1．0cm左右时经腹腔化疗，2周后处死裸鼠计算肿瘤的体积和质量抑制率，观察种植瘤组织多药耐药基因1不敷出mRNA表达情况，及治疗后肝癌细胞的凋亡指数。单独检测24只种植耐药细胞HepG2／ADM的裸鼠在服用溴隐亭前后分别注射的^99mTc—MIBI在肝脏肿瘤部位的潴留情况。结果体外实验结果显示在溴隐亭浓度为10μmol／L时罗丹明123在细胞内的潴留率均明显增加，且呈时间依赖性，对阿霉素的耐药逆转以溴隐亭浓度为10μmol／L时最显著，逆转率为82．6%。蛋白激酶C—α蛋白表达，C组与B组比较差异有统计学意义（q=5．37，P〈0．01），但两组P-糖蛋白表达差异无统计学意义（q=1．86，P〉0．05）。体内试验结果显示种植瘤的体积和质量抑制率比较，C组鼠明显高于B组鼠（q1=5．89，Q=4．92，P〈0．01），接近于A组鼠（功=2．47，q2=3．02，P〉0．05）。C组鼠与B组鼠多药耐药基因1mRNA表达差异无统计学意义（q=3．71，P〉0．05）。化疗后肿瘤细胞凋亡率比较，C组鼠明显高于B组鼠（q=3．72，P〈0．01）。口服溴隐亭后肝肿瘤组织对^99mTc-MIBI的潴留指数明显提高（t=3．58，P〈0．01）。结论溴隐亭通过抑制P-糖蛋白的功能可有效的逆转肝癌多药耐药性。     

Down-regulation of extracellular signal-regulated kinase 1/2 activity in P-glycoprotein-mediated multidrug resistant hepatocellular carcinoma cells

AIM： To study the expression and phosphorylation of extracellular signal-regulated kinase （ERK） i and ERK2 in multidrug resistant （MDR） hepatocellular carcinoma （HCC） cells.
METHODS： MDR HCC cell lines, HepG2/adriamycin （ADM） and SMMC7721/ADM, were developed by exposing parental cells to stepwise increasing concentrations of ADM. MTT assay was used to determine drug sensitivity. Flow cytometry was employed to analyze cell cycle distribution and measure cell P-glycoprotein （P-gp） and multidrug resistant protein 1 （MRP1） expression levels. ERK1 and ERK2 mRNA expression lev-ls were measured by quantitative real-time PCR （QRTPCR）. Expression and phosphorylation of ERK1 and ERK2 were analyzed by Western blot.
RESULTS： MTT assay showed that HepG2/ADM andSMMC7721/ADM were resistant not only to ADM, but also to multiple anticancer drugs. The P-gp expression was over 10-fold higher in HepG2/ADM cells than in HepG2 cells （8.92% ±0.22% vs 0.88% ± 0.05%, P 〈 0.001） and over 4-fold higher in SMMC7721/ADM cells than in SMMC7721 cells （7.37% ± 0.26% vs 1.74% ± 0.25%, P 〈 0.001）. However, the MRP1 expression was not significantly higher in HepG2/ADM and SMMC7721/ADM cells than in parental cells. In addition, the percentage of MDR HepG2/ADM and SMMC7721/ADM cells was significantly decreased in the G0/G1 phase and increased in the the S phase or G2/M phase. QRT-PCR analysis demonstrated that the ERK1 and ERK2 mRNA expression increased apparently in HepG2/ADM cells and decreased significantly in SMMC7721/ADM cells. Compared with the expression of parental cells, ERK1 and ERK2 protein expressions were markedly decreased in SMMC7721/ADM cells. However, ERK2 protein expression was markedly increased while ERK1 protein expression had no significant change in HepG2/ADM cells. Phosphorylation of ERK1 and ERK2 was markedly decreased in both HepG2/ADM and SMMC7721/ADM MDR cells.
CONCLUSION： ERK1 and ERK2 activities are downregulated in P-gp-mediated MDR HCC cells. ERK1 or ERK2 might be a potential drug target for circumventing MDR HCC cells,     

环氧合酶-2与P-糖蛋白在人肝癌细胞中的表达及其意义

目的 探讨环氧合酶(COX)-2在肝细胞癌发生、发展中的作用及其对P-糖蛋白(P-gp)表达的影响. 方法 收集2003年10月-2005年6月因肝癌切除术切取的肝癌组织标本,用RTPCR、免疫组织化学方法分别检测COX-2 mRNA和COX-2蛋白在肝癌组织和腹部手术取得的正常肝组织中的表达.同时检测多药耐药基因1 mRNA和P-gp在肝癌组织中的表达情况,并分析COX-2与P-gp在肝癌组织中表达的相关性.各样本率间比较采用x2检验、用精确概率法分析组间差异,样本间均数的比较用t检验,用Spearman' s等级相关公式分析COX-2和P-gp的相关性.结果 共收集肝癌组织52例,正常肝组织20例.正常肝组织中未见COX-2表达,COX-2表达在中、低分化肝癌组织的阳性率(94.1％)高于高分化肝癌组织(38.9％,x2= 6.80,P＜0.01);在HBsAg阳性的肝癌组织中的表达(91.7％)高于HBsAg阴性的肝癌组织(62.5％,x2= 4.70,P＜0.05);在合并肝硬化的肝癌组织中的表达(96.7％)高于无肝硬化的肝癌组织(63.6％,x2= 7.51,P＜0.01);P-gp在癌组织中的表达(86.6％)高于相应的癌旁组织(30.7％,x2= 64.42,P＜0.01).RT-PCR检测结果显示COX-2 mRNA在正常肝组织中无表达,而多药耐药基因l mRNA在肝癌组织和正常肝组织中均有表达.同时表达COX-2和多药耐药基因1为42例,两者呈正相关(r=0.563,P＜0.01).结论 本研究结果提示COX-2参与了以P-gp介导的肝癌的多药耐药机制.     

乙型肝炎病毒X蛋白对HepG2细胞羧末端结合蛋白反应蛋白表达的影响

目的 研究乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)对博莱霉素诱导HepG2细胞DNA双链断裂(DSB)损伤修复关键因子羧末端结合蛋白反应蛋白(CtIp)的影响.方法 建立稳定表达HBx的HepG2肝癌细胞株(HepG2-HBx)及空质粒对照细胞株(HepG2-vec).用博莱霉素诱导细胞DSB损伤后,用流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡情况,用实时定量PCR及Western blot检测CtIP的mRNA与蛋白表达水平,并用激光共聚焦显微镜观察CtIp蛋白在细胞内的定位情况.多组数据采用单因素方差分析和SNK-q检验;两组数据间比较用t检验.结果 经检测转染HBx基因的HepG2细胞(HepG2-HBx)能稳定表达HBx.博莱霉素处理后,HepG2-HBx细胞与HepG2-vec细胞的凋亡比例分别为16.90%±0.89%和15.30%±0.86%,差异无统计学意义(q=2.074,P＞0.05),但死亡细胞比例分别为8.71%±0.74%和4.90%±0.46%,差异有统计学意义(q=7.126,P＜0.01) ;同时两种细胞株都出现了细胞周期G2/M期阻滞,差异有统计学意义(F=11.401,P＜0.05).HBx使CtIP蛋白表达水平和mRNA表达水平均下调,HepG2-HBx细胞与HepG2-vec细胞CtIp蛋白的相对表达量分别为0.66±0.04、0.73±0.05,差异有统计学意义(t=2.314,P＜0.05); CtIP mRNA相对表达量分别为1.00±0.06、1.23±0.08,差异有统计学意义(t=2.732,P＜0.05).同时观察到CtIP蛋白主要在细胞胞核内表达.结论 HBx能干扰肿瘤抑制蛋白CtIp的表达,可能影响细胞DSB损伤的修复.     

Development and characterization of multidrug resistant human hepatocarcinoma cell line in nude mice

INTRODUCTION Tumor cell drug resistance represents a signif icant obstacle to successful chemotherapy. Cells which have acquired resistance to one anti-tumor drug usually show resistance to other anti-tumor drugs[1]. This cellular resistance is known as m…     

乙型肝炎病毒HBx蛋白抑制阿霉素诱导的HepG2细胞凋亡

目的探讨乙型肝炎病毒HBx蛋白对阿霉素诱导的肝癌细胞凋亡的影响。方法将adr亚型HBx基因片段定向插入绿色荧光蛋白（GFP）真核表达载体pEGFPCl，构建重组体pGFP—HBx。将pEGFPCl、pGFPHBx转染HepG2细胞，采用G418筛选抗性克隆、荧光显微镜观察及RT—PCR检测HBx基因表达情况以建立稳定表达细胞株HepG2／GFP、HepG2／GFPHBx。用阿霉素（2．5μg／m1）分别处理HepG2、HepG2／GFP、HepG2／GFPHBx细胞，处理后不同时间在显微镜下观察细胞形态变化，并用锥虫蓝染色计数死亡细胞；流式细胞仪检测阿霉素处理36h后细胞凋亡率。结果HepG2／GFP、HepG2／GFPHBx细胞传70代后，仍表达强的GFP；RTPCR检测显示在HepG2／GFP—HBx细胞有HBx基因转录表达。锥虫蓝染色检测表明阿霉素处理的HepG2、HepG2／GFP细胞发生了明显的时间依赖性细胞死亡，而在HepG2／GFPHBx和对照组细胞未见明显细胞死亡；流式细胞仪检测显示阿霉素处理36h后，HepG2／GFP—HBx细胞凋亡率为3．94％，明显低于HepG2（59．03％）、HepG2／GFP细胞（61．38％）（P〈0．01），而与未处理对照组细胞凋亡率（2．12％，2．78％，2．55％）差异无统计学意义（P〉0．05）。结论成功建立了稳定表达GFP、GFPHBx的HepG2细胞株；HBx能够抑制阿霉素诱导的HepG2细胞凋亡。