氯霉素免疫检测方法的建立

采用碳二亚胺法(EDC)和混合酸酐法,分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)偶联制备氯霉素免疫原[CAP-HS-BSA]和包被原(CAP-HS-OVA)。经紫外和变性电泳(SDS-PAGE)鉴定,免疫原与包被原均制备成功,偶联比分别为1:16和1:17。利用免疫原免疫两只新西兰大耳白兔,制备多克隆抗体,建立间接竞争ELISA检测氯霉素残留的方法。建立的ic-ELISA检测氯霉素方法的半数抑制浓度(IC50)为7.275ng/ml,通过对氯霉素琥珀酸钠和链霉素、青霉素及庆大霉素的交叉反应率的测定,结果显示抗体对氯霉素琥珀酸钠有较高的交叉反应率而对链霉素、青霉素和庆大霉素的交叉反应率均小于0.1%。     

两种司帕沙星完全抗原的合成鉴定及免疫效果研究

目的:用两种方法合成司帕沙星人工抗原,并制备相应的鼠源多克隆抗体。方法:用混合酸酐法和DCC法将半抗原SPFX与BSA偶联制备免疫原SPFX-BSA,通过DCC法制备人工包被原SPFX-OVA,采用紫外光扫描和聚丙烯酰胺凝胶电泳进行鉴定与分析。免疫小鼠后,采用间接ELISA法测定多抗血清效价,阻断ELISA,鉴定其抑制价和特异性。结果:UV和SDS-PAGE鉴定结果初步表明SPFX人工抗原成功合成;动物试验表明,4只小鼠多抗血清效价均在3.2×104以上,其中1号小鼠IC50值为163.87 ng/mL,与其他竞争物无明显交叉反应,抗体特异性良好。结论:两种偶联方法均能成功合成人工抗原,制备出鼠源抗SPFX多克隆抗体,其中混合酸酐法能明显提高完全抗原的合成和免疫效果。     

对硫磷快速ELISA检测方法的建立

由于对硫磷的残留问题及其危害,迫切需要建立一种快速有效的农药检测方法。将对硫磷苯环上的硝基还原为氨基,得到了具有氨基活性的半抗原化合物———氨基对硫磷,然后采用重氮法将氨基-对硫磷与牛血清白蛋白(BSA)或卵清白蛋白(OVA)相偶联,分别合成了免疫原和包被抗原:氨基对硫磷-BSA、氨基对硫磷-OVA。对合成的抗原进行紫外可见扫描,确证偶联成功。用合成的免疫抗原免疫实验用大白兔,制备对硫磷的多克隆抗血清,效价达到1∶1×106以上。对硫磷抗体除了与甲基对硫磷具有极其微弱的交叉反应以外,与甲胺磷和毒死蜱交叉反应低于0.1%,最低检测限2.0ngg,回收率为93.3%。该方法简便、快速、灵敏,适用性强。     

芴完全抗原和多克隆抗体制备与鉴定

以9-芴乙酸（fluorene-9-aceticacid,FLU）为原料,经活性酯法合成完全抗原FLU-牛血清白蛋白（bovineserum albumin,BSA）和FLU-卵清白蛋白（ovalbumin,OVA）,偶联产物通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及紫外扫描法鉴定。使用FLU-BSA足垫免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体,间接酶联免疫吸附实验（enzyme linkedimmunosorbent assay,ELISA）测得多克隆抗体效价为51 200,间接竞争ELISA方法测得芴多克隆抗体的特异性,与荧蒽的交叉反应率为12%,与其他14 种多环芳烃交叉反应不明显。     

鼠伤寒沙门氏菌特异性多克隆抗体的纯化方法

以福尔马林灭活的鼠伤寒沙门氏菌免疫雌性日本大耳兔,制备抗沙门氏菌的多克隆抗体。分别通过辛酸-硫酸铵沉淀法、磁珠偶联抗原吸附法纯化抗体,所制备的抗体效价为3.2×105,纯度较高,但交叉反应现象较严重。本实验以杂菌抗原反向吸附法纯化抗体,有效消除了抗体与杂菌的交叉反应,初步建立了一种高特异性多克隆抗体的纯化方法。     

抗赭曲霉毒素A多克隆抗体的制备

为了制备赭曲霉毒素A多克隆抗体,采用戊二醛法合成赭曲霉毒素A-BSA人工抗原,通过紫外扫描法鉴定半抗原与载体蛋白偶联效果.合成的人工抗原用弗氏佐剂乳化后免疫Balb/c小白鼠,4次免疫后眼球下缘采血,分离血清.试验结果表明,免疫后产生了抗赭曲霉毒素A-BSA的特异性多克隆抗体,抗体效价为1:8100,赭曲霉毒素A的最低...     

重金属铅多克隆抗体的制备及鉴定

目的：合成铅离子完全抗原,并对其进行鉴定;用合成的完全抗原免疫Balb/c 小鼠制备多克隆抗体,鉴定效价和特异性。方法：用双功能螯合剂p-SCN-Bn-DTPA 将Pb2+ 与载体蛋白BSA 和OVA 偶联在一起,合成免疫抗原(Pb-DTPA-BSA)和检测抗原(Pb-DTPA-OVA),并通过SDS-PAGE、紫外扫描、电感耦合等离子体(ICP) 检测抗原中Pb2+ 含量,以及通过免疫Balb/c 小鼠,采集血清进行间接ELISA 和竞争ELISA 检测。结果：两种合成的抗原相对于各自的载体蛋白均出现了蛋白条带滞后,紫外吸收峰偏移等现象;免疫的4 号和5 号Balb/c 小鼠的抗血清效价达1:400000;与OVA 无交叉反应,ELISA 检测IC50 值为1.5ng/mL,与Fe3+ 有近5% 的交叉反应,与其他重金属离子的交叉反应均小于1%。结论：铅离子多克隆抗体制备成功。     

沙丁胺醇多克隆抗体的制备与鉴定

为了对沙丁胺醇进行酶联免疫吸附法(ELISA)测定,通过四种方法制备沙丁胺醇衍生物,分别将其与牛血清蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)偶联,制备人工完全抗原,采用紫外分光光度法测定蛋白质浓度并计算偶联比,用所制备的四种免疫原免疫新西兰白兔获得抗沙丁胺醇(SAL)抗体,每一种抗体都用四种包被抗原进行配对筛选,据此得到最佳的抗体-包被抗原的组合,对筛选出的抗体用正辛酸-硫酸铵法进行纯化,采用间接ELISA法测定多克隆抗体(pAb)的效价并进行特异性鉴定。结果表明:成功偶联了完全抗原,四种免疫原的偶联比分别为9:1、6:1、6:1、12:1,得到最佳的抗体-包被抗原的组合,筛选出的抗体效价达到1:64000,此抗体对克伦特罗和特布他林的交叉反应率分别为144%和169%,对其他类似物几乎没有交叉反应。本研究为沙丁胺醇、克伦特罗和特布他林多残留酶联免疫检测法的建立奠定了基础。     

氯霉素人工抗原的合成及多克隆抗体的制备

采用重氮化法合成氯霉素人工抗原.通过紫外扫描、凝胶电泳、基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MAL-DI-TOFMS)鉴定人工抗原.用该人工抗原免疫兔子,获得多抗血清.采用酶联免疫法测定抗体效价,并对ELISA条件进行初步优化.选择与氯霉素结构相似的4种药物进行交叉反应,计算交叉反应率.结果表明免疫抗原偶联率为1:22,最佳包被抗原质量浓度为0.25μg/mL,抗体效价128 000.优化后,通过间接竞争ELISA法建立标准曲线,IC50为0.26μg/mL,4种药物与抗体的交叉反应率均小于0.1%,特异性显著.     

呋喃唑酮残留标示物人工抗原合成与抗体制备

以乙醇肼和碳酸二甲酯为原料,合成2种半抗原3-氨基-2-恶唑烷酮(AOZ)和3-(4-羧基苯亚甲基)-氨基-2-恶唑烷酮(CPAOZ),经戊二醛法和碳二亚胺法将半抗原与牛血清蛋白(BSA)偶联合成2种人工抗原AOZ-BSA和CPAOZ-BSA,产物经紫外光谱扫描分析鉴定。用2种人工抗原采取不同程序免疫新西兰大白兔,获得8组多克隆抗体。AOZ-BSA抗体效价1:0.8×104～1:3.2×104,对AOZ灵敏度低,IC50均大于100μg/ml。CPAOZ-BSA抗体效价1:1.6×105～1:6.4×105,对AOZ与苯甲醛衍生物N-苯亚甲基-3-氨基-2-恶唑烷酮(PAOZ)灵敏度高,IC500.91～11.56ng/ml,特异性好,仅与呋喃唑酮(交叉反应率6.15%)、3-(2-硝基苯亚甲基)-氨基-2-恶唑烷酮(NPAOZ,交叉反应率5.73%)有交叉反应,与衍生试剂苯甲醛和其他药物没有交叉反应(交叉反应率<0.01%)。本研究制备出AOZ特异性抗体,为我国开发AOZ酶联免疫试剂盒奠定基础。     

2,4-二氯苯氧乙酸人工抗原合成及鼠源多克隆抗血清的制备

采用碳化二亚胺法(EDC法)将2,4-D与牛血清白蛋白(BSA)及卵清蛋白(OVA)偶联,合成免疫原2,4-D-BSA和包被原2,4-D-OVA,采用紫外扫描(UV)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法进行鉴定;用2,4-D人工免疫抗原(2,4-D-BSA)免疫BALB/c纯系小鼠,采用间接ELISA测定多抗血清效价、阻断ELISA鉴定其抑制。结果表明:BSA与2,4-D偶联后,波峰出现右移,表明偶联成功;SDS-PAGE电泳中BSA的泳动速度大于2,4-D-BSA,表明2,4-D已与BSA成功偶联;6只小鼠血清效价均达到了1:1.28×104,且1号小鼠多抗血清敏感性最好,半数抑制IC50为72.48ng/mL,表明成功获得了高效价、特异性好、亲和力较高的鼠源抗2,4-D多克隆抗体血清,为2,4-D残留免疫学检测方法的建立奠定了良好的基础。     

金黄色葡萄球菌新型肠毒素I双抗夹心-酶联免疫检测方法的建立

目的：建立简便、灵敏检测金黄色葡萄球菌肠毒素I（staphylococcal enterotoxin I,SEI）的双抗夹心酶联免疫吸附方法（double-antibody sandwich-enzyme linked immunosorbent assay,DAS-ELISA）。方法：利用DAS-ELISA检测程序确定单克隆抗体、抗血清、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）标记的羊抗兔IgG（IgG/HRP）的最佳稀释度,再通过检测不同包被缓冲液、封闭时间、抗原包被时间、IgG/HRP作用时间以及四甲基联苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine,TMB）显色时间条件下的OD450 nm值对实验条件进行优化,最后用灵敏度、批内变异、批间变异和加标回收率指标对方法进行评价。结果：抗SEI单克隆抗体的最佳稀释质量浓度为2.89 mg/L,抗SEI兔血清稀释度1∶2 000,酶标二抗稀释度1∶6 000;1×磷酸缓冲盐溶液（pH 7.4）为最佳包被缓冲液;最佳封闭时间、抗原孵育时间、酶标二抗孵育时间和TMB显色时间分别为60、90、30 min和15 min。该方法的回归方程为y=0.040 9x＋0.042 9,R2=0.993 3;灵敏度为0.5 μg/L,精密度批内变异低于10%,批间变异低于15%,除巴氏杀菌牛乳外,对生理盐水、熟牦牛肉糜、大米饭和超高温瞬时灭菌牛乳回收率达90%以上。结论：本研究建立了一种快速检测SEI的双抗夹心方法。     

双酚A单克隆抗体的制备及酶联免疫分析方法的建立

采用活泼酯法将双酚A的结构类似物双酚酸与载体蛋白偶联制备人工抗原,用制备的人工抗原免疫BALB/c小鼠,采用聚乙二醇法进行细胞融合制备双酚A单克隆抗体,成功获得一株分泌抗双酚A单克隆抗体的细胞株3H1,经鉴定抗体属于IgG1亚型,轻链为κ,并建立了间接竞争酶联免疫分析法。线性范围为1～50 ng/mL,最低检测限为0.43 ng/mL,半数抑制浓度为6.56 ng/mL。回收率为82.83%～101.94%,变异系数为2.94%～12.95%。该方法具有较高的灵敏度和特异性,具有良好的应用前景。     

CdTe量子点免疫层析试纸条检测克伦特罗

以巯基乙酸作为稳定剂,利用水热反应制备了水溶性的高荧光CdTe量子点,量子产率为54.961%。研究了该量子点在1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺的作用下与抗克伦特罗抗体的共价连接。结果表明：该量子点与克伦特罗抗体连接后体系的荧光强度和吸光度均增强,且峰位均未发生明显移动,F/P值为4.20。将该偶联反应物CdTe-Anti CLE pAb作为荧光标记物,组装出一种用于检测克伦特罗的荧光免疫试纸条,最低检测限达0.5 μg/L,与酶联免疫吸附法进行对比,该试纸条能够实现对克伦特罗的快速检测。     

多效唑人工抗原的合成与鉴定

为合成新的、有效的多效唑人工抗原,采用琥珀酸酐法对多效唑小分子进行结构修饰,以获得含羧基的多效唑半抗原。将纯化后的半抗原分别与牛血清白蛋白和卵清蛋白经N-羟基琥珀酰亚胺活泼酯法偶联制备免疫原和包被原。采用质谱、红外光谱、核磁共振氢谱对多效唑半抗原的结构进行鉴定;采用紫外光谱及高性能基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱对偶联物的结构进行鉴定。结果显示成功合成出多效唑人工抗原,为其抗体的制备和免疫学方法的构建奠定了前期研究基础。     

双抗夹心ELISA检测转Bar基因抗除草剂大豆

为快捷有效地检测转Bar基因抗除草剂大豆,利用已制备的抗除草剂Bar基因编码蛋白,膦丝菌素乙酰转移酶（phosphinothricin acetyltransferase,PAT）单克隆抗体和多克隆抗体,建立PAT蛋白双抗夹心酶联免疫吸附检测方法,对转Bar基因抗除草剂大豆不同组织材料进行定量检测。结果显示,最佳检测条件为捕获抗体质量浓度0.125 μg/mL,包被酶标板,37 ℃孵育1 h后4 ℃静置过夜,检测样品37 ℃孵育1.5 h,检测抗体质量浓度6.25 μg/mL,37 ℃孵育1.5 h;PAT蛋白的最低检测限为0.04 ng/mL,大豆蛋白体系中为8 ng/mL;重复性变异系数小于3%。利用上述检测条件,对实验建立的转Bar基因抗除草剂大豆进行PAT蛋白定量检测,成功地在根、茎、花、叶、种子不同部位检测到该蛋白的表达。     

4种邻苯二甲酸酯塑化剂人工抗原的合成及免疫检测

以4-硝基邻苯二甲酸为原料,衍生合成4 种结构类似物,并分别通过重氮化法和活泼酯法与载体蛋白牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）和卵清白蛋白（ovalbumin,OVA）偶联制得人工抗原。利用紫外光谱扫描和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electroporesis,SDS-PAGE）检测鉴定人工抗原,并用4 种与BSA偶联的人工抗原作免疫原免疫新西兰大白兔。利用酶联免疫吸附实验（enzymelinkedimmunosorbent assay,ELISA）检测抗体灵敏度和特异性。经紫外光谱和SDS-PAGE证实人工抗原偶联成功,经免疫分析法检测抗体效价,4-氨基邻苯二甲酸二丁酯-BSA（dibutyl 4-aminophthalate-BSA,DBAP-BSA）抗体效价达到1∶64 000,4-戊二单酰邻苯二甲酸二丁酯-BSA（dibutyl 4-carboxylphthalte-BSA,DBCP-BSA）、4-氨基邻苯二甲酸二异丁酯-BSA（diisobutyl 4-aminophthalate-BSA,DiBAP-BSA）和4-氨基邻苯二甲酸二环己酯-BSA（dicyclohexyl 4-aminophthalate-BSA,DCHAP-BSA）抗体效价均达到1∶128 000。DBAP-BSA、DBCP-BSA、DiBAP-BSA和DCHAP-BSA分别对邻苯二甲酸二丁酯（dibutyl phthalate,DBP）、DBP、邻苯二甲酸二异丁酯（diisobutyl phthalate,DiBP）和邻苯二甲酸二环己酯（dicyclohexyl phthalate,DCHP）4 种抗体的IC50值为0.305、0.268、0.104、0.247 μg/mL。四者之间交叉反应率低,反应特异性较好。     

孔雀石绿人工抗原的合成及多克隆抗体的制备

通过研究孔雀石绿(MG)抗原的合成和多克隆抗体的制备,探索研究食品中孔雀石绿残留的检测方法。本实验先合成含有羧基的孔雀石绿半抗原(CMG),并用液-质联用法进行分析鉴定。半抗原经重氮化法处理后分别偶联两种载体蛋白BSA和OVA,并通过紫外分光光度法进行鉴定。与CMG标准品和两种载体蛋白的紫外吸收光谱相比,偶联物的吸收峰发生了明显的偏移,计算得免疫原的偶联比为10.6:1,说明偶联成功。通过免疫制备多克隆抗体,并通过间接ELISA法对CMG抗血清的效价进行检测,并进一步检测抗体的特异性,两只兔子的IC50值分别为8.1ng/mL和4.6ng/mL。