c-raf-1反义寡核苷酸对人卵巢癌细胞受照后Ki-67表达的影响

[目的]探讨癌基因c-raf-1的反义寡核苷酸埘人卵巢癌细胞受照后Ki-67表达的影响。[方法]设立c-raf-1正义寡核苷酸组和非处理组（仅加入等量的脂质伴)作对照，用RT-PCR检测卵巢癌细胞处理前后c-raf-1表达水平的变化，用免疫组化技术检测人卵巢癌细胞株SKOV3在脂质体-c-raf-1反义寡核苷酸作用前后受^60Coγ射线照射后细胞Ki-67的表达情况。[结果]c-raf-1反义寡核苷酸能抑制c-raf-1癌基因的表达，经脂质体介导的c-raf-1反义寡核苷酸作用的卵巢癌细胞经γ射线照射后其Ki-67表达较转染正义寡核苷酸组及单纯照射组明显下调，而转染c-raf-1正义寡核苷酸组和单纯照射组相比无明显差异。[结论]c-raf-1反义寡核苷酸通过抑制c-raf-1的表达降低人卵巢癌细胞株SKOV3受照射后的增殖能力。该作刚可能与c-raf-1反义寡核苷酸抑制了引起肿瘤细胞辐射抗拒的细胞信号传导途径有关。     

c-erbB-2与c-raf-1反义寡核苷酸转染对卵巢癌SKOV3细胞的作用

目的：探讨c—erbB-2与c—raf-1基因ASODN联合转染对人卵巢癌细胞增殖的抑制作用及其分子机制。方法：实验分为7组：对照组、c—erbB-2正义治疗组、c—raf-1正义治疗组、c—erbB-2反义治疗组、c—raf-1反义治疗组、全剂量联合治疗组和半剂量联合治疗组。脂质体转染后不同时间分别进行MTT试验、集落形成试验、荧光显微镜检测、蛋白质荧光强度测定与免疫组织化学检查，以观察不同条件处理后各组细胞的增殖、凋亡、蛋白质表达有无差别。结果：与对照组比较，全剂量联合治疗组和半剂量联合治疗组，转染72h的光密度值分别为0．151（P〈0．005）和0．073（P〈0．005），增殖抑制率分别达到了88．7％和94．5％，克隆形成率分别为19．4％（P〈0．01）和12.8％（P〈0．01），凋亡率分别为24.3％（P〈0．05）和31．5％（P〈0．01），同时明显地下调了c—erbB-2、c—raf-1、PCNA、c-jun、c—fos基因蛋白质的表达水平。结论：c—erbB-2与c—raf-1基因反义寡核苷酸联合转染对人卵巢癌SKOV，细胞增殖的抑制作用优于单反义基因，其对卵巢癌细胞增殖的抑制作用可能通过下调c—erbB-2、c—raf-1、PCNA、c-jun、c—fos基因蛋白的表达水平实现。     

c-erbB-2反义寡核苷酸对人卵巢癌SKOV_3细胞增殖的抑制作用

目的探讨c-erbB-2基因反义寡核苷酸转染对人卵巢癌SKOV3细胞增殖的抑制作用及其分子机制。方法实验分空白对照组、正常对照组、c-erbB-2正义对照组及c-erbB-2反义治疗组。脂质体转染后不同时间分别进行MTT试验、集落形成试验、荧光显微镜检测、蛋白质荧光强度测定,以观察不同条件处理后各组细胞的增殖、凋亡、蛋白质表达有无差别。结果反义治疗组与正义对照组比较:转染72hOD值分别为0.201与1.298(P<0.01);克隆形成率分别为26.5%与76.5%(P<0.05);凋亡率分别为21.3%与7.5%(P<0.05),同时明显地下调c-erbB-2蛋白质的表达水平(P<0.05)。结论在卵巢癌的基因治疗中,c-erbB-2反义寡核苷酸能明显抑制人卵巢癌SKOV3细胞的增殖。     

血管内皮生长因子反义核酸对宫颈癌Hela细胞的放射增敏作用

目的：血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）在人类多数实体肿瘤中均有表达，射线可诱导其表达增加，产生放射抗拒。本实验目的在于探讨血管内皮生长因子反义寡核苷酸干涉对高转移宫颈腺癌Hela细胞株的放射增敏作用。方法：实验组通过脂质体介导将VEGF基因反义寡核苷酸瞬时转染入Hela细胞，设VEGF正义寡核苷酸组和空白对照组作比较，各组均予6MV-X线照射，剂量为0Gy、2Gy、4Gy和6Gy，用RT-PCR检测照射前后Hela细胞中VEGFmRNA表达；用流式细胞术检测细胞凋亡；平板克隆形成试验检测克隆形成率的变化。结果：与对照组比较，VEGF反义寡核苷酸不仅可抑制Hela细胞中内源性VEGFmRNA的表达（P〈0．01），亦可显著抑制辐射诱导的VEGF表达的增加（P〈0．01）；VEGF表达下调使射线诱导的细胞凋亡率明显升高（P〈0．01）．细胞克隆数量明显降低（P〈0．01）;结论：针对人VEGF基因反义寡核苷酸干涉可抑制射线诱导的VEGF的高表达，增强射线对肿瘤细胞的杀伤作用。提高细胞的放射敏感性。     

反义MRP3寡核苷酸对卵巢癌拓普替康耐药性的逆转作用

目的：探讨MRP3反义寡核苷酸对人卵巢癌拓普替康（TPT）耐药株SKOV3／TPT细胞的耐药逆转作用。方法：人工合成MRP3反义寡核苷酸（ASODN）相应的正义寡核苷酸（SODN）片段，用脂质体（LF）构建成ASODN／LF、SODN／LF，分别转染SKOV3／TPT细胞，用MTT法、流式细胞仪（FCM）及半定量RT-PCR检测体外转染后细胞内TPT的荧光强度、耐药指数及MRP3 mRNA表达的改变。结果：将MRP3反义及正义寡核苷酸片段分别转染进SKOV3／TPT细胞后，反义组细胞内TPT的荧光强度及耐药指数明显降低（P〈0．05），细胞内MRP3 mRNA的表达较未转染细胞下降了60．16％（P〈0．05）；正义组上述指标无明显变化。结论：转染MRP3ASODN／LF可部分逆转MRP3介导的人卵巢癌细胞对TPT耐药。     

反义寡核苷酸对鼻咽癌细胞乏氧条件下放射敏感性的影响

目的:探讨乏氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)在乏氧状态下对鼻咽癌CNE-1细胞放射敏感性的影响.方法:氯化钴处理CNE-1细胞模拟乏氧条件下的培养传代,通过脂质体将不同HIF-1α反义寡核苷酸酸导入CNE-1细胞中,根据转染复合物的不同将CNE-1细胞分为反义联合组、正义联合组、脂质体组和单纯放疗组(放疗对照组).X射线单次照射,照射条件为照射率4 Gy/min,共8Gy,细胞照射后继续乏氧条件下培养24 h.MTT法检测CNE-1细胞的存活率,Western blotting检测CNE-1细胞中HIF-1α和VEGF蛋白的表达.结果:在乏氧条件下,反义联合组的鼻咽癌CNE-1细胞存活率明显大于正义联合组和单纯放疗组.Western blotting结果显示,与正义联合组和单纯放疗组相比,反义联合组CNE-1细胞中HIF-1α蛋白表达显著下降(0.162 ±0.055vs 0.872 ±0.191,0.768±0.217,0.863±0.245,P＜0.05);同时反义联合组CNE-1细胞中VEGF蛋白的表达量较正义联合组和单纯放疗组明显减少(0.364±0.078 vs 1.165±0.346,1.068±0.379,1.087±0.266,P＜0.05).结论:HIF-1α反义寡核苷酸能有效抑制HIF-1α的表达,对乏氧状态下的鼻咽癌CNE-1细胞具有放射增敏作用.     

Chk2反义寡核苷酸对放射线照射诱导的HeLa细胞凋亡的影响

目的：观察宫颈癌细胞HeLa转染chk2反义寡核苷酸后，在X射线作用下对凋亡的影响。方法：以脂质体为载体将chk2正义链和反义链转染HeLa细胞，用Western blot检测HeLa细胞中Chk2蛋白的表达，用流式细胞仪和TUNEL法检测X射线照射后细胞凋亡率。结果：反义封闭chk2可明显抑制Chk2蛋白表达（P〈0．01），X射线作用下细胞凋亡率明显高于转染正义链组（P〈0．01）。结论：反义封闭chk2基因可增加He-La细胞对X射线照射的凋亡敏感性。     

反义血管内皮生长因子对食管癌细胞体外放射增敏作用

[目的]研究TE-1细胞转染VEGF反义寡核苷酸，观察转染后肿瘤细胞VEGF表达情况及其对放射敏感性的影响。[方法]将反义VEGF寡核苷酸经Lipofectamine^TM2000介导转染TE-1细胞；并经γ线照射。采用MTT法检测细胞生长状况，RT-PCR、Western blotting检测细胞照射前后VEGF基因的表达，流式细胞术检测细胞周期分布情况和凋亡率；克隆形成实验反映转染后细胞放射敏感性的变化。[结果]将反义VEGF寡核苷酸成功地转染人食管癌TE-1细胞中，VEGF表达水平明显降低，体外增殖反应无明显差异，细胞周期分布情况相似．未见明显凋亡发生。不同剂量照射后增殖情况无统计学差异；反义组细胞凋亡率略有上升．转染反义组细胞较未转染组细胞放射敏感性增加。[结论]转染反义VEGF寡核苷酸可抑制食管癌TE-1细胞VEGF表达，联合放射治疗，对TE-1细胞增殖无明显作用，而其放射敏感性有增强作用。     

WT1反义寡核苷酸对人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤形成的抑制作用

目的:观察WT1反义寡核苷酸作用后的人卵巢癌细胞株SKOV3在裸鼠皮下的成瘤能力.方法:应用反义寡核苷酸(ASODN)技术,将WT1反义寡核苷酸转染到SKOV3细胞中,然后将这种被转染的细胞接种于裸鼠皮下,观察肿瘤体积的变化,并计算抑瘤率.结果:脂质体介导的WT1反义寡核苷酸作用后的卵巢上皮癌细胞在裸鼠皮下成瘤能力降低...     

ATP7B基因反义寡核苷酸对卵巢癌SKOV3ipl细胞顺铂敏感性的影响

目的探讨ATP7B基因反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,ASODNs)片段对卵巢癌SKOV3ip1细胞顺铂敏感性的影响。方法人工合成包含ATP7B mRNA翻译起始位点的ASODNs片段及作为对照的正义寡核苷酸(sense ol-igodeoxynucleotide,SODNs)片段。脂质体lipofectamine2000(LF)将ASODNs及SODNs转染卵巢癌SKOV3ip1细胞后,用RT-PCR法、流式细胞测定法、Western blot及MTT法检测SKOV3ip1细胞转染后,ATP7B基因mRNA、蛋白表达及半数抑制浓度(IC50)的变化。结果SKOV3ipl细胞以及转染ASODNs后,ATP7B与β-actin mRNA的光密度比值分别为0.831±0.06和0.203±0.07(P<0.01)。流式细胞法检测细胞内ATP7B蛋白的荧光强度由转染前的79.42±4.04下降到50.87±5.47(P<0.05)。Western blot检测SKOV3ipl细胞以及转染ASODNs后,ATP7B与actin蛋白的光密度比值分别为2.60±0.44和1.01±0.06(P<0.01)。MTT检测IC50由转染前的(126.63±12.06)μmol/L下降为(80.90±20.09)μmol/L(P<0.01)。而转染SODNs及LF的SKOV3ip1细胞中,上述指标无统计学差异(P>0.05)。结论ATP7B基因反义寡核苷酸能显著抑制卵巢癌SKOV3ip1细胞ATP7B mRNA和蛋白表达,并能增加SKOV3ip1细胞对顺铂的敏感性。     

脂质体-c-raf-1 反义寡核苷酸转染对人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤形成的作用

 目的 探讨经脂质体一硫代磷酸化修饰的c-raf-1反义寡脱氧核苷酸(ASODN)作用后的卵巢上皮癌细胞株SKOV3在裸鼠皮下的成瘤能力。方法 利用脂质体将经硫代磷酸化修饰的寡核苷酸导入SKOV3细胞，然后将这种被转染的细胞接种于裸鼠皮下，观察肿瘤体积的变化，并计算抑瘤率。结果 经脂质体c-raf-1 ASODN作用后的卵巢上皮癌细胞在裸鼠皮下成瘤能力降低，最大抑瘤率达35．3％(P<0．05)。首次出现肉眼可见肿瘤的平均时间延长为8．8天(P<0．05)。结论 c-raf-1癌基因的反义调控能降低卵巢上皮癌细胞的成瘤能力，抑制肿瘤生长，在卵巢上皮癌的基因治疗中有一定作用。     

抗血管内皮生长因子发卡状核酶基因抑制卵巢癌细胞SKOV3增殖

 目的　观察抗VEGF发卡状核酶基因对卵巢癌细胞增殖的影响。方法　采用脂质体介导的方法将自行设计和构建的抗VEGF发卡状核酶基因真核表达载体转染人卵巢癌细胞 ,通过MTT、细胞贴壁克隆形成试验、软琼脂克隆形成试验及细胞周期分析观察其对卵巢癌细胞增殖的影响。结果　转染后的SKOV3 RZ细胞生长减慢 ,细胞贴壁克隆形成及软琼脂克隆形成率明显降低 (P <0 .0 0 1)。G1期细胞显著增多 (P <0 .0 1) ,S期细胞显著减少 (P <0 .0 1)。结论　抗VEGF发卡状核酶基因可显著抑制卵巢癌细胞SKOV3增殖 ,为进一步开展肿瘤血管靶向基因治疗提供了实验依据     

反义寡聚脱氧核苷酸对卵巢癌细胞系LPA受体抑制与对MMP-2和MMP-9的调控

目的:研究溶血磷脂酸受体(LPA1、LPA2、LPA3)的反义寡核苷酸(ASODN)对卵巢癌细胞的抑制作用;探讨LPA对表达LPA受体ASODN的卵巢癌细胞株MMP2和MMP9表达及活性的影响.方法:将LPA1、LPA2和LPA3ASODN转入卵巢癌细胞系SKOV3和3AO,用RT-PCR和蛋白质印迹法鉴定转染细胞株的表达水平.通过检测细胞株生长、增殖变化观察转染细胞株的生物学特性,明胶酶谱检测分析LPA对表达LPA受体的ASODN的卵巢癌细胞株MMP-2、MMP-9表达及活性的影响.结果:LPA1、LPA2及LPA3 ASODN均可有效的抑制LPA1基因、LPA2及LPA3蛋白质的表达.转染前后细胞株生长情况差异无统计学意义.明胶酶谱条带的灰度值分析显示,LPA诱导表达LPA2、LPA3 ASODN的卵巢癌细胞株MMP-2、MMP-9活性降低,与对照组及正义组相比,差异有统计学意义,P<0.05.转染LPA1 ASODN的卵巢癌细胞株MMP-2、MMP-9活性,与对照组及正义组相比,差异无统计学意义,P>0.05.结论:ASODN抑制LPA受体基因及蛋白质表达.在LPA诱导的MMPs活化过程中,LPA2及LPA3更有效,提示卵巢上皮性癌中LPA2和LPA3在LPA诱导的MMPs侵袭、转移过程中发挥主要作用.     

法舒地尔对胃癌MGC-803细胞增殖、侵袭和迁移的影响

目的 探讨法舒地尔对胃癌MGC-803细胞增殖、侵袭和迁移的影响及可能机制。方法 采用不同浓度的法舒地尔处理胃癌MGC-803细胞,检测细胞数目;选择无显著细胞毒性的3组浓度（10、25、50 μmol／L）法舒地尔进行后续实验,将经药物处理的胃癌MGC-803细胞作为处理组,而未经药物处理的胃癌MGC-803 细胞作为对照组;细胞培养0、24、48、72、96 h后,CCK-8法检测细胞增殖倍数;划痕实验检测细胞迁移能力;Transwell法检测细胞侵袭能力;Western blotting检测细胞中血管内皮细胞生长因子（VEGF）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）、基质金属蛋白酶14（MMP-14）和上皮间质转化（EMT）的标志蛋白波形蛋白（Vimentin）和上皮型钙黏蛋白（E-cadherin）的表达水平。结果 CCK-8法检测结果显示,法舒地尔以剂量依赖性的方式抑制胃癌MGC-803细胞的生长,法舒地尔浓度越高,处理组的细胞数量越少,增殖倍数明显降低（P＜0.01）;划痕实验结果表明,处理组伤痕愈合率明显较对照组降低,且法舒地尔浓度越高,处理组伤痕愈合率越低（P＜0.01）;Transwell结果显示,与对照组比较,处理组侵袭的细胞数目明显减少（P＜0.01）;与对照组比较,法舒地尔明显下调VEGF、MMP-9、MMP-14和Vimentin蛋白的表达水平,而上调E-cadherin蛋白的表达水平。结论 法舒地尔可抑制胃癌MGC-803细胞的的增殖、迁移和侵袭能力,降低MMP-9、MMP-14、VEGF表达水平,为胃癌的治疗研究提供新思路和理论基础。     

抗 VEGF发夹状核酶基因抑制 VEGF表达及卵巢癌细胞增殖的实验研究

背景与目的:研究表明血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在与上皮性卵巢癌有关的血管形成过程中可能发挥着重要作用.目前,核酶策略已成为一种基因治疗的策略,用于阻断肿瘤形成或肿瘤的生长与转移.VEGF在卵巢肿瘤形成中的作用尚不十分清楚.我们试图采用抗 VEGF发夹状核酶基因阻断卵巢癌中 VEGF的自分泌和 /或旁分泌通路,以检测其对卵巢癌细胞增殖的影响.方法:采用脂质体介导的方法将自行设计和构建的抗 VEGF发夹状核酶基因真核表达载体转染人卵巢癌 SKOV3细胞,采用 G418筛选获得阳性克隆 ; RNA斑点杂交检测核酶基因在卵巢癌细胞中的表达 ; 免疫组化、间接免疫荧光染色及流式细胞仪结合免疫荧光检测转染前后卵巢癌细胞中 VEGF表达 ; 通过 MTT、细胞贴壁克隆形成实验、软琼脂克隆形成实验及细胞周期分析观察其对卵巢癌细胞增殖的影响.结果:与 SKOV3细胞相比,转染后的 SKOV3-RZ细胞 VEGF表达明显降低(P< 0.01); 细胞生长减慢,细胞贴壁克隆形成及软琼脂克隆形成率明显降低 [(12.7± 1.4)% 和(9.4± 2.0)% 比(30.1± 1.9)% 和(24.8± 1.5)%,P< 0.001];G1期细胞显著增多(77.6% 比 57.9%,P< 0.01),S期细胞显著减少(17.0% 比 29.9%,P< 0.01). 结论:抗 VEGF发夹状核酶基因可显著抑制卵巢癌细胞 SKOV3增殖 ; 本研究为进一步开展肿瘤血管靶向基因治疗提供了实验依据.     

脂质体-c-erbB-2反义寡核苷酸转染对人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤形成的抑制作用研究

 目的　探讨经脂质体—硫代磷酸化修饰的c erbB 2反义寡脱氧核苷酸 (ASODN )作用后的卵巢上皮癌细胞株SKOV3 在裸鼠皮下的成瘤能力。方法　利用脂质体将经硫代磷酸化修饰的寡核苷酸导入SKOV3 细胞内 ,然后将这种被转染的细胞接种于裸鼠皮下 ,观察肿瘤体积的变化 ,并计算抑瘤率。结果　经脂质体 c erbB 2ASODN作用后的卵巢上皮癌细胞在裸鼠皮下成瘤能力降低 ,最大抑瘤率达 4 0 .0 %(P <0 .0 5 )。首次出现目检可见肿瘤的平均时间延长为 9.6天 (P <0 .0 5 )。结论　c erbB 2癌基因的反义调控能降低卵巢上皮癌细胞的成瘤能力 ,抑制肿瘤生长 ,在卵巢上皮癌的基因治疗中有一定价值。     

Induction of apoptosis in human ovarian epithelial cancer cells by antisurvivin oligonucleotides

Survivin, an anti-apoptosis gene that is abnormally overexpressed in a variety of human tumors, may play an important role in the carcinogenesis and drug resistance of cancer. This study was designed to explore the effects of liposome-survivin antisense oligonucleotide (Lip-ASODN) on the growth and apoptosis of human ovarian cancer cell lines, A2780 and SKOV3. To investigate the use of survivin as a therapeutic target on ovarian cancer, we carried out transfections with Lip-ASODN to induce apoptosis in ovarian cancer cell lines, A2780 and SKOV3. The expression of survivin mRNA and relative protein were evaluated separately by quantitative real-time RT-PCR and Western blot analysis. Cell proliferation inhibition was determined by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay, and the induced cell apoptosis was examined using flow cytometry (FCM) after Lip-ASODN transfection. Our results showed that the overexpression of survivin led to infinite carcino-proliferation, and survivin expression in the survivin-positive ovarian cancer cell line A2780 and SKOV3 cells was significantly and gradually reduced when transfected with Lip-ASODN at concentrations of 200, 400 and 600 nM by degrees. Lip-ASODN transfection induced greater apoptosis rates in the human ovarian cancer cell lines A2780 and SKOV3 (p<0.05). The growth inhibition and apoptotic rates of tumor cells change when treated with different concentrations of Lip-ASODN. The cell growth inhibition peak rate was reached when increasing Lip-ASODN concentration to 600 nM. Furthermore, time course evaluation showed that survivin protein expression was inhibited by Lip-ASODN within 12 h after transfection. We concluded that down-regulation of survivin by a targeted antisense oligonucleotide appears to be an effective gene therapy approach in the treatment of ovarian cancer.     

Expression and biological role of cytoglobin in human ovarian cancer

Loss of cytoglobin is found to be involved in the progression of several human cancers. However, its expression pattern and biological roles in human ovarian cancers are not clear. In this study, we examined cytoglobin expression in 118 archived ovarian cancer specimens using immunohistochemistry. A total of 72 specimens (61.0 %) showed cytoglobin downregulation. cytoglobin downregulation positively correlated with advanced FIGO stage and tumor grade. Cytoglobin plasmid transfection was performed in SKOV3 cell line and siRNA knockdown was carried out in SW626 cell line. MTT, colony formation assay and matrigel invasion assay were carried out to assess the role of cytoglobin on cell proliferation and invasion. Cytoglobin overexpression inhibited cell growth, invasion, cell cycle progression and cyclin D1 expression in SKOV3 cell line and its depletion promoted cell proliferation, invasion, cell cycle transition and cyclin D1 expression. In conclusion, cytoglobin is downregulated in ovarian cancers and associated with advanced stage. Our data provides evidence that cytoglobin regulates the ovarian cancer cell proliferation and invasion.