基于细胞自噬机制探讨祛风生脉颗粒保护血管内皮的研究

目的基于细胞自噬机制探讨祛风生脉颗粒保护血管内皮的干预效应。方法将缺血心肌微血管内皮细胞(CMECs)分为4组:缺血(QX)组、缺血+雷帕霉素(QX+RAPA)组、缺血+3-甲基腺嘌呤(QX+3-MA)组、缺血+祛风生脉颗粒含药血清(QX+QF)组;另设正常CMECs,作为正常(ZC)组。其中ZC组和QX组给予常规培养基培养,QX+RAPA组和QX+3-MA组在常规培养基基础上分别加入雷帕霉素和3-甲基腺嘌呤,QX+QF组给予祛风生脉颗粒大鼠含药血清与缺血CMECs共孵育。电镜观察各组细胞自噬小体及超微结构变化,Western-blot分析微管相关蛋白Ⅰ轻链3(LC3)-Ⅱ/Ⅰ比值;Annexin V-FITC和PI双标记法测定细胞凋亡,酶联免疫吸附法测定细胞培养液中一氧化氮(NO)与内皮素-1(ET-1)含量。结果 QX组在电镜下观察到有自噬小体形成,与ZC组相比,QX组LC3–Ⅱ/Ⅰ比值升高,细胞总凋亡率增加(P0.05),NO水平升高,ET-1水平升高(P0.01);与QX组相比,QX+RAPA组自噬小体数目有所增多,LC3–Ⅱ/Ⅰ比值升高,细胞总凋亡率减少,NO水平下降(P0.05),ET-1水平有所降低,差异无统计学意义(P0.05);与QX组相比,QX+3-MA组自噬小体数目减少,LC3–Ⅱ/Ⅰ比值降低,细胞总凋亡率增加,NO水平升高,ET-1水平升高(P0.05);与QX组相比,QX+QF组电镜下观察到自噬小体数目明显增多,同时观察到较多的自噬溶酶体,LC3–Ⅱ/Ⅰ比值显著升高,细胞总凋亡率明显减少,NO水平明显降低,ET-1水平降低(P0.01)。结论缺血能够诱导CMECs发生自噬,细胞凋亡增加,血管内皮功能受到损伤,祛风生脉颗粒干预后能够明显减少凋亡,改善CMECs功能,其机制可能与促进缺血CMECs自噬有关。     

活性维生素D3改善高糖环境下肾小管上皮细胞自噬溶酶体通路的研究

目的探讨活性维生素D3对高糖环境下肾小管上皮细胞自噬溶酶体通路的影响和机制。方法将人近端小管上皮细胞(HK-2)细胞分为正常对照(Con)组、甘露醇组(Man)、高糖组(HG)、高糖+活性维生素D3组(HG+VD)。Western blot法检测自噬小体(LC3II)、自噬底物(P62)、溶酶体相关膜蛋白1(LAMP1)和组织蛋白酶B(CTSB)、维生素D受体(VDR)及转录因子EB(TFEB)蛋白表达。结果与Con组比较,HG组LC3II、LAMP1、CTSB、VDR、TFEB蛋白表达降低,P62蛋白表达升高(P0.05)。与HG组比较,HG+VD组LC3II、LAMP1、CTSB、VDR、TFEB蛋白表达升高,P62表达降低(P0.05)。结论活性维生素D3可改善高糖环境下肾小管上皮细胞自噬溶酶体通路,其机制可能与调控TFEB相关。     

miR-24对氧化低密度脂蛋白胆固醇诱导的人脐静脉内皮细胞自噬的影响

目的探讨微小RNA(miR)-24对氧化低密度脂蛋白胆固醇(ox-LDL)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)自噬的调控作用及相关分子机制。方法将HUVECs随机分为正常组,ox-LDL组,阴性对照组,anti-miR-24组,miR-24组。正常组细胞正常培养,ox-LDL组细胞用100μg/ml ox-LDL作用6 h诱导自噬,阴性对照组、anti-miR-24组、miR-24组先分别转染相应慢病毒载体,再以同法诱导自噬。实时荧光定量(qRT)-聚合酶链反应(PCR)验证miR-24慢病毒稳转细胞株构建情况及ox-LDL对HUVECs内miR-24表达的影响;透射电镜观察各组细胞内部自噬小体和自噬溶酶体的数量;四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测各组细胞活性;Western印迹与qRT-PCR法检测LC3-Ⅰ/Ⅱ、Beclin-1、P62的蛋白和mRNA表达水平。结果慢病毒转染细胞成功后miR-24的表达受到影响;ox-LDL可诱导下调miR-24在HUVECs中的表达(P<0.05);与阴性对照组相比,anti-miR-24组细胞质内自噬小体及自噬溶酶体显著增加(P<0.05),但细胞活性无显著差异(P>0.05),LC3-Ⅰ/Ⅱ、Beclin-1的蛋白及mRNA相对表达量显著增高(P<0.05),P62的蛋白及mRNA相对表达量降低(P<0.05)。然而,miR-24组细胞质内自噬小体及自噬溶酶体显著减少,且细胞活性显著性降低(P<0.05),LC3-Ⅰ/Ⅱ、Beclin-1的蛋白及mRNA相对表达量显著降低(P<0.05),P62的蛋白及mRNA相对表达量升高(P<0.05)。结论过表达miR-24可通过抑制ox-LDL诱导的HUVECs自噬进而抑制细胞增殖,miR-24可能成为动脉粥样硬化(AS)的潜在治疗靶点。     

缺氧环境中犬内皮集落形成细胞成血管能力及自噬水平观察

目的 观察缺氧环境中犬内皮集落形成细胞（ECFCs）成血管能力及自噬水平。方法 取对数生长期的ECFCs，分为缺氧组和常氧组，缺氧组在缺氧环境中培养，常氧组在常氧环境中培养，比较两组成血管能力（细胞OD值、细胞迁移数、细胞迁移率、管分支数及VEGF mRNA、FGF mRNA、VEGF蛋白、FGF蛋白相对表达量）和自噬水平（细胞LC3 mRNA、P62 mRNA、LC3Ⅱ/Ⅰ、P62蛋白、LC3平均荧光强度、P62平均荧光强度）。结果 与常氧组比较，缺氧组培养48、72、96 h的OD值及细胞迁移数、细胞迁移率、管分支数和VEGF mRNA、FGF mRNA、VEGF蛋白、FGF蛋白相对表达量增加（P均<0.05）。与常氧组比较，缺氧组LC3 mRNA、LC3Ⅱ/Ⅰ表达增加及LC3平均荧光强度增强，P62 mRNA、P62蛋白表达减少及P62平均荧光强度减弱（P均<0.05）。结论 缺氧环境中犬ECFCs成血管能力增强，自噬水平升高。     

P62通过调控自噬与抗氧化通路保护大鼠脑缺血再灌注损伤

目的探讨大鼠脑缺血再灌注后P62介导的微管结合蛋白轻链3(LC3)和Kelch样ECH相关蛋白1(kelchlike ECH-associated protein 1,Keap1)表达的变化。方法将80只SD大鼠随机分为假手术组和模型组(采用线栓法制备局灶性脑缺血大鼠模型),每组40只,分别于12h,1、2和3d取材,每个时间点10只。采用化学荧光法测定脑组织活性氧水平,透射电子显微镜观察神经细胞中自噬及凋亡形态结构变化,分别采用qRT-PCR和Western blot法观察P62和LC3和Keap1 mRNA和蛋白在缺血半暗带表达变化。结果与假手术组比较,模型组大鼠各时间点脑组织中活性氧水平显著升高,1d时达峰值[(238.23±25.51)%vs (134.60±12.48)%,P0.01];透射电子显微镜下,模型组大鼠神经细胞线粒体肿胀,可见不同程度自噬小体形成,细胞发生迟发性神经元死亡。与假手术组比较,模型组各时间点P62mRNA和蛋白表达明显下调,1d达最低值(1.915±0.711 vs 1.253±0.679;0.10±0.02 vs 0.16±0.04,P0.01);各时间点LC3、Keap1mRNA和蛋白表达显著升高,1d达到最高值(0.862±0.501 vs 1.450±0.245,1.125±0.421 vs 2.037±0.730;1.25±0.17 vs 0.36±0.07,1.35±0.14 vs 0.24±0.05,P0.05,P0.01)。结论大鼠脑缺血再灌注损伤后LC3和Keap1表达水平增加,而P62表达减少,诱导了细胞自噬和氧化应激的发生。     

姜黄素激活自噬对非酒精性脂肪性肝病大鼠线粒体途径凋亡的影响

目的探讨姜黄素对非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)大鼠的治疗作用及机制。方法油红O染色观察各组大鼠肝内细胞脂滴分布,透射电镜观察肝组织中自噬泡形成情况。蛋白印迹检测P62、微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)、自噬相关蛋白(Beclin-1)和B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、相关x蛋白(Bax)、线粒体内细胞色素C(mCytc)、半胱氨酸蛋白酶(Caspase-3、Caspase-9)标记蛋白的表达水平。结果与正常对照组比较,肝组织脂质沉积在模型组中明显增加;姜黄素明显抑制模型组大鼠肝组织脂质沉积,自噬抑制剂削弱姜黄素的治疗作用;透射电镜观察发现正常对照组可见散在自噬泡,模型组自噬泡数量显著减少,姜黄素可明显增加自噬体数量。蛋白印迹结果提示,模型组大鼠肝组织中Bax、Caspase-3、Caspase-9、P62蛋白表达均升高,而mCytc、Bcl-2、Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ均降低;经姜黄素治疗后肝组织中Bax、P62、Caspase-3、Caspase-9蛋白表达均降低,而mCytc、Bcl-2、Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ升高;自噬抑制剂可以部分抑制姜黄素对自噬和凋亡相关蛋白的影响。结论姜黄素对NAFLD大鼠模型的抗凋亡作用与诱导自噬有关。     

大鼠心肌梗死后心脏线粒体及自噬小体的变化与Parkin蛋白活性的相关性

目的:本实验通过研究心肌梗死(心梗)后心肌组织内线粒体自噬功能以及帕金(Parkin)蛋白的变化,进而揭示Parkin蛋白在调节心脏线粒体自噬功能中的作用。方法:采用随机分组原则,将大鼠分为正常组,伪手术组和心梗组。心梗大鼠模型建立4周后,超声测量各组大鼠左室收缩末期内径(LVESD)、左室舒张末期内径(LVEDD)、左室射血分数(EF)、左室短轴缩短率(FS)和左室舒张期和收缩期容量。取心肌组织,在电镜下观察各组的线粒体和自噬小体的形态、大小和数量变化。采用Western Blot技术分析心肌组织内自噬相关蛋白LC3及Parkin蛋白的活性。结果:心梗4周后,心梗组大鼠与正常组相比,心功能降低,LVESD和LVEDD均增大(P0.05),左室EF降低,慢性心梗模型制备成功。大鼠心梗后心肌内线粒体及自噬小体数量增多(P0.05),且线粒体正常形态破坏。氯喹(CQ)能增强正常组大鼠心肌自噬流(P0.05),然而CQ对心梗组大鼠心肌自噬小体的变化无明显影响(P0.05)。此外,心梗组心肌内自噬相关蛋白LC3II表达水平相比正常组增加(P0.05)并且Parkin蛋白活性显著降低(P0.05)。结论:慢性心梗的过程中,心肌细胞线粒功能的破坏以及自噬小体清除能力的损害与Parkin蛋白密切相关。     

羟基红花黄素A对缺血性心力衰竭大鼠心肌自噬及ERK1/2通路的影响

目的:探讨羟基红花黄素A(HSYA)对缺血性心力衰竭(IHF)大鼠心肌自噬及细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)通路的影响。方法:将72只大鼠随机分为假手术组、模型组、阳性对照组(卡托普利组)、低剂量HSYA组(L-HSYA)、中剂量HSYA组(M-HSYA)、高剂量HSYA组(H-HSYA),每组12只。采用冠脉结扎法建立缺血性心力衰竭大鼠模型。超声仪检测大鼠左心室心功能水平,酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清N-末端脑钠肽前体(NTpro BNP)和超敏肌钙蛋白(hs-TnT)水平,透射电镜观察心肌细胞自噬,Western blot法检测心肌组织自噬相关因子微管相关蛋白1(Beclin1)、微管相关蛋白轻链3(LC3)、泛素和LC3结合蛋白p62(p62)、ERK1/2蛋白表达。结果:与模型组比较,阳性对照组、M-HSYA和H-HSYA组大鼠左室收缩末期室间隔厚度(LVSs)、左室舒张末期室间隔厚度(LVSd)、收缩末期左心室后壁厚度(LVPWs)、舒张末期左心室后壁厚度(LVPWd)、左心室射血分数(LVEF)及LHSYA组LVSd显著升高(均P 0. 05);心电图T波幅度和ST段抬高幅度显著降低,QT间期显著缩短(均P 0. 05);大鼠血清NT-proBNP和hs-TnT水平显著降低(均P 0. 05),心肌细胞自噬小体数量减少,自噬率显著降低(P 0. 05);心肌组织Beclin-1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达显著降低(均P 0. 05),p62和p-ERK1/2蛋白表达显著升高(均P 0. 05)。结论:IHF大鼠心肌损伤与自噬关系密切,HSYA可能通过激活ERK1/2信号通路抑制IHF大鼠心肌细胞自噬。     

依达拉奉对间歇低氧损伤后大鼠脑组织自噬及凋亡的影响

目的 探讨依达拉奉对间歇低氧损伤后大鼠脑组织自噬及凋亡的影响。方法 采用随机数字表法将96只Wistar大鼠分为对照组、5%间歇低氧(IH)组及依达拉奉(ED)组,每组又分为1 d、3 d、7 d、14 d 4个时间点,每个时间大鼠8只。透射电镜观察大鼠海马CA1区神经细胞的超微结构;免疫组织化学法观察大鼠神经细胞自噬效应蛋白(beclin)-1、微管相关蛋白1轻链(LC)3-Ⅱ蛋白的表达;原位末端标记法记录大鼠神经细胞的凋亡情况。结果 电镜下对照组神经细胞形态正常,染色质均匀,线粒体、高尔基体等细胞器结构正常;与对照组比较,5%IH组从间歇低氧损伤3 d开始逐渐出现神经元变形肿胀,核膜模糊,染色质密度欠均匀,线粒体空泡化、嵴出现断裂,激活溶酶体,出现自噬小体,随着低氧时间的延长,损伤越重;与5%IH组比较,ED组各个时间点神经元超微结构损伤减轻,自噬小体数目增多。对照组神经细胞beclin-1、LC3-Ⅱ的表达较少,各个时间点差异无统计学意义(P>0.05);与对照组比较,5%IH组及ED组各个时间点beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白的表达显著增多(P<0.05);与5%I...     

电针对继发性脊髓损伤后大鼠神经元自噬及相关蛋白轻链3Ⅱ和bcl-2/腺病毒E1B19000相互作用蛋白3表达的影响

目的观察电针治疗对大鼠继发性脊髓损伤(SCI)后神经元自噬及相关蛋白表达的影响。方法健康SD大鼠随机分为对照组、模型组、西药组(甲泼尼龙治疗)及电针组(电针大椎、命门穴治疗)4组;除对照组外,其他3组均采用改良的Allen打击装置(50 g/cm)复制大鼠T10~11中度SCI模型。分别于SCI后6 h、1 d、7 d取损伤局部脊髓组织,经透射电子显微镜及Western印迹法,观察各组SCI后神经元自噬的病理变化及轻链(LC)3Ⅱ、bcl-2/腺病毒E1B19000相互作用蛋白(BNIP)3的表达。结果 1SCI后1 d脊髓组织中LC3Ⅱ、BNIP3表达明显升高(P<0.01);电针组和西药组SCI后脊髓组织中LC3Ⅱ、BNIP3的表达显著降低,与模型组差异显著(P<0.01);西药组与电针组差异不显著(P>0.05)。2在透射电镜观察下,对照组脊髓组织神经元细胞核膜完整,胞质中线粒体形态分布及数目正常,未发现自噬小体,溶酶体数目也未见增多;模型组脊髓组织可见线粒体肿胀明显、空泡化,溶酶体数量增多,细胞核形不规则,可发现自噬小体;西药组和电针组可见脊髓组织神经元细胞肿胀,线粒体也略肿胀,核形规则,核内染色质欠均匀,溶酶体数目未见明显增多。结论电针可降低SCI大鼠脊髓组织中LC3Ⅱ和BNIP3的表达,抑制细胞自噬,减缓脊髓损伤后的病理损害,其作用与甲泼尼龙相仿。     

电针神庭、百会穴对脑缺血再灌注后学习记忆障碍大鼠皮质区内LC3 Ⅱ和Beclin-1的影响

目的 观察大脑中动脉缺血再灌注(MCAO)模型大鼠皮质区中自噬体的形成。方法 线栓法制备局灶性脑缺血损伤大鼠模型。45只SD大鼠造模成功后用随机数字表法分为电针组、模型组和假手术组各15只。电针组行电针干预治疗14 d。透射电镜下观察大鼠皮质区溶酶体及自噬体的形成；Western印迹及实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测大鼠脑组织中酵母Atg6基因在哺乳动物中同源类似物(Beclin)-1和自噬微管相关蛋白轻链3抗体(LC3)Ⅱ含量。结果 电针组溶酶体及自噬体形成数量明显多于模型组和假手术组(P<0.05);与模型组相比，电针组脑组织中Beclin-1和LC3Ⅱ含量明显升高(P<0.05);模型组脑组织中Beclin-1和LC3Ⅱ含量显著高于假手术组(P<0.05)。结论 自噬体形成及自噬相关蛋白可以调控脑缺血再灌注后大鼠的学习及记忆能力，自噬网络及其调控机制在脑卒中所导致的认知障碍形成及恢复过程中起着重要作用。     

FOXO3a蛋白对脑缺血损伤大鼠细胞自噬的影响研究

目的研究FOXO3a蛋白对脑缺血损伤大鼠细胞自噬的影响。方法选取20只Wistar大鼠,经过1周饲养时间后,随机分为正常组和脑缺血组,其中正常组10只,脑缺血组10只,采用四动脉结扎法构建脑缺血模型。采用免疫组化法检测FOXO3a蛋白、Bax蛋白及B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)蛋白表达水平,采用双盲法测定神经功能评分,采用Western Blot检测细胞自噬相关蛋白Beclin-1、LC3细胞自噬功能的改变,用倒置荧光显微镜观察细胞自噬现象的产生。结果脑缺血组大鼠FOXO3a蛋白表达高于正常组(P0.05);脑缺血组大鼠Bax蛋白表达高于正常组,Bcl-2蛋白表达低于正常组(P0.05);脑缺血组大鼠神经功能评分高于正常组(P0.05);脑缺血组细胞自噬相关蛋白Beclin-1、LC3及细胞自噬率高于正常组,均具有统计学意义(P0.05)。结论 FOXO3a蛋白在大鼠脑缺血损伤中高表达,Bax蛋白在大鼠脑缺血损伤中高表达,Bcl-2蛋白在大鼠脑缺血损伤中低表达,对细胞自噬具有诱导作用。     

健脾消积方水提物对人肝癌SMMC7721细胞自噬的调控机制

目的探讨健脾消积方水提物抗肝癌机制以及对细胞自噬流和自噬相关蛋白的影响。方法提取健脾消积方水提物,作用于SMMC7721细胞,使用CCK-8法检测细胞增殖,流式细胞学检测细胞的凋亡率,使用Western Blot检测自噬相关蛋白Beclin1、LC3和P62的表达,并监测自噬体的形成及自噬体与溶酶体的融合过程。计量资料两组比较采用独立样本t检验,多组比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。结果 CCK8检测显示,细胞加药后24 h、48 h、72 h、96 h,增殖均受到了明显抑制,与对照组相比差异均有统计学意义(t值分别为28. 458、81. 093、85. 328、100. 158,P值均0. 001)。流式细胞学凋亡检测结果显示,加药组肝癌SMMC7721细胞凋亡较对照组显著增加(t=-42. 629,P 0. 001)。Western Blot结果显示,与对照组相比,加药组Beclin1蛋白表达下调,自噬标志蛋白LC3Ⅱ表达上调,P62表达上调。加药组细胞的自噬体向自噬溶酶体的流动受到了阻滞,与对照组相比,差异有统计学意义(F=31. 155,P 0. 001)。结论健脾消积方水提物能够抑制人肝癌SMMC-7721细胞的增殖,促进细胞凋亡;同时能上调Beclin1的表达,下调LC3和P62的表达并阻滞自噬流的形成。     

自噬在顺铂诱导的心肌细胞凋亡中的调控作用

目的探讨自噬在顺铂心脏毒性损伤中的调控作用。方法采用顺铂处理心肌细胞,通过检测LC3、P62观察自噬的变化;通过阻断自噬,观察心肌细胞经顺铂处理后细胞活力的变化,并通过TUNEL染色检测细胞凋亡情况。结果采用顺铂分别处理原代新生大鼠心肌细胞(Neonatal rat cardiomyocyte,NRCM)和H9c2细胞系,观察到LC3-II的增加和P62蛋白的下调,表明顺铂可显著诱导心肌细胞自噬。采用自噬抑制剂氯喹或3-MA联合顺铂处理细胞后,发现细胞活力较单纯顺铂处理组显著下调。TUNEL染色结果显示,联合处理组细胞凋亡率较单纯顺铂处理组显著上调。结论顺铂诱导心肌细胞自噬,阻断自噬增强顺铂对心肌细胞的损伤作用。     

细胞自噬与结肠癌Lovo细胞迁移和侵袭的相关性研究

目的探讨不同自噬状态对结直肠癌Lovo细胞迁移和侵袭能力的影响。 方法将Lovo细胞分为自噬增强组、正常细胞组和3-甲基嘌呤自噬抑制组。用激光共聚焦显微镜观察绿色荧光颗粒,用Q-PCR检测Beclin1 mRNA表达水平,透射电镜观察自噬溶酶体,Transwell实验评价Lovo细胞迁移与侵袭能力。 结果绿色荧光颗粒数以自噬增强组最多,其次为正常细胞组,而自噬抑制组最少。Beclin1 mRNA表达量自噬增强组为(1.23±0.12)个,正常细胞组为(1±0.13)个,自噬抑制组为(0.98±0.1)个。自噬增强组可见大量的自噬溶酶体,明显多于正常细胞组和自噬抑制组。迁移实验细胞计数：自噬增强组高于正常细胞组(138.0±16.7与90.7±12.9,P＝0.026)和自噬抑制组(138.0±16.7与92.7±26.7,P＝0.030)。侵袭实验细胞计数：自噬增强组高于正常细胞组(147.0±13.0与99.0±20.5,P＝0.028)和自噬抑制组(147.0±13.0与95.7±25.6,P＝0.021)。 结论结肠癌Lovo细胞自噬增强促进肿瘤细胞迁移和浸润,可能是局部浸润和远处转移的机制之一。     

促红细胞生成素衍生肽抑制细胞自噬减轻小鼠心肌缺血/再灌注损伤

目的 探讨促红细胞生成素衍生肽即螺旋B表面肽(helix B surface peptide,HBSP)对缺血/再灌注(I/R)诱导小鼠心肌细胞损伤的保护作用及其机制。方法 将56只雄性昆明小鼠随机分成4组:假手术(Sham)组、I/R组、I/R+HBSP组、I/R+HBSP+Wortmannin(I/R+HBSP+Wort)组。将原代心肌细胞随机分成4组:空白对照(Control)组、缺氧/复氧(H/R)组、H/R+HBSP组、H/R+HBSP+Wortmannin(H/R+HBSP+Wort)组。分别使用超声检测系统测定左室射血分数(LVEF)、左室短轴缩短率(FS);双染法测定心肌梗死面积,Western blot检测蛋白表达及磷酸化水平,电镜观察细胞自噬小体及线粒体,共聚焦显微镜观察LC3(细胞自噬强度常用指标)数量。结果 与I/R组比较,I/R+HBSP组LVEF、左室FS增高(P<0.05),心肌梗死面积缩小(P<0.05),心肌细胞自噬小体数量减少。与I/R+HBSP组比较,I/R+HBSP+Wort组LVEF、左室FS下降(P<0.05),心肌梗死面积增加(P<0.05),心肌细胞自噬小体数量增加。与H/R组比较,H/R+HBSP组中p-Akt、p-mTOR及P62表达升高(P<0.05),LC3-II/LC3-I比值下降(P<0.05),LC3数量减少(P<0.05)。与H/R+HBSP组比较,H/R+ HBSP+Wort组中p-Akt、p-mTOR及P62表达下降(P<0.05),LC3-II/LC3-I比值升高(P<0.05),LC3数量增加(P<0.05)。结论 促红细胞生成素衍生肽能显著抑制细胞自噬减轻小鼠心肌I/R损伤,其保护效应可能与激活PI3K/Akt/mTOR转导通路相关。     

Wnt/β-catenin信号通路通过下调自噬改善大鼠脑缺血再灌注损伤

目的观察Wnt/β-catenin信号通路通过调控大鼠皮层神经元细胞自噬水平对脑缺血再灌注(CIR)损伤的影响。方法将56只雄性SD大鼠随机分为4组:假手术组(Sham组)、CIR组、Wnt/β-catenin激动剂氯化锂(Li Cl)处理组(Li Cl+CIR组)、生理盐水(NS)处理组(NS+CIR组),每组14只。采用大脑中动脉线栓阻塞法建立大鼠CIR损伤模型,缺血2 h后再灌注24 h。采用Garcia神经功能缺陷评分评估各组大鼠神经行为学改变;氯化三苯基四氮唑染色测定脑梗死体积;Western blot测定大鼠皮层β-catenin、LC3-Ⅱ及P62蛋白表达。结果再灌注24 h后,与Sham组相比,CIR组神经行为学评分升高,脑梗死体积增加,皮层β-catenin表达降低,LC3-Ⅱ表达升高,P62蛋白表达水平下降(P0.05);与CIR组相比,Li Cl+CIR组神经行为学评分降低,脑梗死体积减少,皮层β-catenin表达增加,LC3-Ⅱ表达降低,P62蛋白表达水平增加(P0.05)。结论 Wnt/β-catenin信号通路通过调控自噬改善大鼠CIR的神经损伤。     

外源性睾酮通过诱导自噬致大鼠肾脏损伤

目的 探索外源性睾酮(TP)致大鼠肾脏损伤的作用及可能机制.方法 SD雄性大鼠48只,随机分为6组(每组8只):control组、TP组、TP+氯喹(CQ)组、TP+甘草甜素(Gly)组、CQ(自噬抑制剂)组、Gly〔高迁移率族蛋白(HMG)B1抑制剂〕组.各组大鼠处理21 d后,测量其体重、肾脏湿重、计算肾脏指数;苏木素-伊红(HE)染色观察大鼠肾脏组织病理形态学变化;免疫组化法和Western印迹印迹法分析大鼠肾脏组织自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ、Beclin1、P62、HMGB1的定位和表达情况.结果 与control组比较,TP组大鼠肾脏湿重、肾脏指数无明显变化(P>0.05);肾小球毛细血管襻多呈分叶状改变,肾小囊间隙变窄,肾小管上皮细胞水肿,管腔变窄;肾脏组织LC3B-Ⅱ、Beclin1和HMGB1蛋白表达水平上调(P<0.05),联合给予TP与CQ后,仅见少数肾小体血管球呈分叶状改变,肾小管水肿明显减轻;Beclin1、LC3B-Ⅱ和HMGB1蛋白表达水平均下调(P<0.05);TP+Gly组大鼠肾脏组织病理学改变及自噬相关蛋白表达水平结果 与TP+CQ组类似.结论 外源性TP可能通过上调细胞自噬致大鼠肾脏组织损伤的发生,HMGB1可能参与此过程自噬水平的调节.     

siRNA靶向抑制eIF2α基因对非酒精性脂肪性肝病自噬及凋亡的影响

目的探讨siRNA靶向抑制eIF2α基因对非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)细胞模型自噬及凋亡的影响。方法体外0.6 mmol/L油酸诱导HepG2细胞脂质沉积建立NAFLD细胞模型,将HepG2细胞分为对照组、模型组、eIF2α-siRNA干扰组、NC-siRNA干扰组。油红O观察各组细胞内脂滴分布。采用Real-time PCR检测各组细胞eIF2αmRNA表达情况。LC3质粒标记绿色荧光蛋白(GFP-LC3)转染HepG2细胞后,荧光显微镜下观察细胞内绿色点状聚集的自噬小体分布,Honchst 33258染色观察细胞凋亡情况。Western blotting检测自噬、凋亡相关蛋白P62、LC3Ⅱ、Beclin-1、Bcl-2、Bax、Caspase-3及p-eIF2α、eIF2α的表达。结果 Real-time PCR及Western blotting实验表明,与对照组相比,模型组eIF2α蛋白及mRNA表达差异无统计学意义(P0.05);与模型组相比,eIF2α-siRNA干扰组eIF2α蛋白及mRNA表达明显下降。与对照组相比,模型组p-eIF2α表达增加;与模型组相比,eIF2α-siRNA干扰组p-eIF2α表达明显下降。荧光显微镜观察提示,与对照组相比,模型组自噬体数量明显降低;与模型组相比,eIF2α-siRNA干扰组自噬体数量明显增加。Hoechst 33258染色分析提示,与对照组相比,模型组凋亡率明显增加;与模型组相比,eIF2α-siRNA干扰组凋亡率明显减少。Western blotting检测提示,与对照组相比,模型组细胞Bax、P62、Caspase-3蛋白表达均增加,而Bcl-2、Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ均降低(P均0.05),经过eIF2α-siRNA干扰后,eIF2α-siRNA干扰Bax、P62、Caspase-3蛋白表达均降低,而Bcl-2、Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ增加。结论 siRNA靶向抑制eIF2α基因通过增强自噬及抑制细胞凋亡改善NAFLD,细胞模型脂肪变性。     

自噬在高磷诱导的大鼠血管平滑肌细胞钙化过程中的作用研究

目的:探讨自噬在高磷诱导的大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)钙化过程中的作用。方法:采用磷酸盐(3.2 mmol/L Pi,即高磷状态)建立大鼠VSMC钙化模型。实验分为三组:对照组、钙化组(分为3个亚组:3.2 mmol/L Pi 4d组、3.2 mmol/L Pi 6d组、3.2 mmol/L Pi 8d组);钙化+3-甲基腺嘌呤(3-MA)组(3.2mmol/L Pi 8 d+5 mmol/L 3-MA)。分别通过茜素红S染色法和邻甲酚肽络合酮比色法检测各组细胞钙结节形成及钙含量;蛋白免疫印迹法检测各组细胞转录因子蛋白(Runx2)、α-肌动蛋白(α-SMA)和自噬相关蛋白—膜型微管蛋白1轻链3β(LC3Ⅱ)蛋白表达量。透射电子显微镜观察VSMC内自噬小体形成情况。免疫荧光显微镜下观察VSMC中LC3和Runx2定位表达。结果:与对照组相比,3.2 mmol/L Pi 8 d组钙结节、钙含量、Runx2和LC3Ⅱ蛋白表达量及自噬小体均显著增高,α-SMA蛋白表达量降低,差异具有统计学意义(P0.05)。与3.2 mmol/L Pi 8 d组相比,钙化+3-MA组细胞钙含量增多,LC3荧光分布量降低,Runx2阳性细胞数增多,差异具有统计学意义(P0.05)。结论:自噬在磷酸盐诱导的VSMC钙化过程中具有保护作用。