釉基质蛋白对大鼠外胚间充质细胞黏附、伸展影响的体外研究

目的：了解体外研究环境中，两种不同形式釉基质蛋白（粗提型EMPs和纯化型EMD）对外胚间充质细胞黏附、伸展行为的影响力。方法：酶消化法培养SD大鼠颌突外胚间充质细胞，采用固相结合分析方法，观察外胚间充质细胞在不同浓度釉基质蛋白（50、100、150及200μg／mL等浓度的EMPs和EMD）包被的培养孔表面黏附、伸展情况，依次命名为ED2、ED2、ED3、ED4及EP1、EP2、EP3、EP4组。结果：①细胞黏附性实验中，仅ED2和ED3组结果高于空白对照组（P〈0．01）。②细胞伸展实验中，EP1、EP2和EP3组结果高于空白对照组（P〈0.01）。结论：EMD对外胚间充质细胞伸展无明显促进作用，但可显著促进其黏附贴壁；EMPs对外胚间充质细胞黏附无影响，但可促进其伸展。     

釉基质蛋白对大鼠外胚间充质细胞增殖和蛋白合成影响的体外研究

目的 :了解体外研究环境中 ,2种不同形式釉基质蛋白 (粗提型EMPs及纯化型EMD)对外胚间充质细胞增殖及蛋白生物合成能力的影响。方法 :酶消化法培养SD大鼠颌突外胚间充质细胞 ,采用细胞计数法及3 H-亮氨酸掺入实验 ,分别测定外胚间充质细胞暴露于不同浓度釉基质蛋白 (EMPs及EMD)的培养液中增殖及蛋白质合成代谢情况。结果 :各实验组细胞增长趋势与阴性对照组相似 ,4d及 7d时EP3及ED3 2组细胞计数显著高于阴性对照组 (P <0 .0 1)及阳性对照组 (P <0 .0 5 ) ;EP3 ,ED2及ED3组细胞蛋白合成量显著高于阳性对照组 (P <0 .0 5 )。结论 :釉基质蛋白特别是纯化型EMD能够促进外胚间充质细胞增殖及总蛋白合成代谢。     

诱导颌突外胚间充质干细胞向成骨细胞分化

目的：探讨外胚间充质干细胞向成骨细胞分化的能力；方法：利用矿化液诱导外胚间充质干细胞分化，通过免疫组化和RT—PCR鉴定，以大鼠成纤维细胞作为对照。结果：显示外胚间充质干细胞经矿化液诱导后，细胞形态发生变化，细胞形态为立方状，紧密排列，类似成骨细胞，随着培养时间增长，可形成矿化结节；免疫组化显示诱导的外胚间充质干细胞表达Ⅰ型胶原；RT—PCR结果说明诱导的外胚间充质干细胞表达成骨细胞特异标志-骨桥素mRNA。而对照组细胞形态未出现变化，也无成骨细胞标志表达。结论：外胚间充质干细胞经矿化液诱导后成为成骨细胞。     

釉基质蛋白对大鼠脂肪源性干细胞体外成骨分化能力的实验研究

目的 :通过配制不同浓度的釉基质蛋白(enamel matrix proteins,EMPs)培养液,体外培养SD大鼠脂肪源性干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs),初步探究EMPs对ADSCs体外增殖活性及成骨分化能力的影响。方法:酶消化法获得大鼠脂肪间充质细胞,通过流式细胞仪技术分离、筛选干细胞,多向诱导分化对所得细胞进行鉴定;乙酸法制备EMPs干粉并通过蛋白免疫印记技术鉴定其成分,配制不同浓度的诱导液以备用;采用MTT法检测EMPs对ADSCs增殖活性的影响,并用实时荧光定量PCR及蛋白免疫印迹的方法检测EMPs诱导ADSCs成骨分化标志物的m RNA及蛋白表达变化情况。结果 :釉基质蛋白(EMPs)对大鼠脂肪源性干细胞(ADSCs)的增殖具有明显的促进作用(P<0.05),并呈现剂量和时间依赖性;EMPs培养ADSCs 14 d后,成骨分化标志物Runx-2、Osteocalcin(OCN)、Collagen(Col-I)在m RNA和蛋白水平表达均增加,并且与EMPs成正比(P<0.05)。结论 :釉基质蛋白可作为一种成骨诱导剂,能有效增强大鼠脂肪源性干细胞体外增殖活性并诱导其成骨分化。     

RT-PCR检测釉基质蛋白对大鼠骨髓基质细胞成骨相关基因表达影响的研究

目的研究釉基质蛋白(enamel matrix proteins,EMPs)对体外培养大鼠骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BM-SCs)成骨相关基因表达的影响。方法采用乙酸法从猪恒牙胚中提取釉基质蛋白,取3周龄雄性SD大鼠胫骨和股骨骨髓体外培养,取生长良好的第3代细胞加入不同浓度的EMPs(0、25、50、100、200 mg/L)进行培养,MTT法检测BMSCs的增殖,用RT-PCR测定成骨相关基因骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP),骨桥蛋白(osteopontin,OPN)和Ⅰ型胶原(collagen typeⅠ,COL-Ⅰ)的表达。结果实验组的细胞增殖大于对照组(P<0.05),并且EMPs的浓度在100 mg/L时增殖作用最强;实验组骨相关基因(BSP、COL-Ⅰ)mRNA的表达高于对照组,并且具有浓度依赖性,但是实验组与对照组OPN mRNA的表达没有区别。结论 EMPs通过调节成骨相关基因的表达而促进大鼠BMSCs向成骨细胞分化。     

小鼠上颌突间充质细胞体内成骨发育和体外诱导成骨分化的比较

目的:比较体外成骨诱导培养的小鼠胚胎10.5 d(E10.5)的上颌突间充质细胞与体内发育的上颌突间充质细胞的成骨分化差异.方法:体外培养E10.5和E17.5的小鼠上颌突间充质细胞,观察其细胞形态.取体外培养3d的E10.5原代细胞进行成骨诱导培养7d,然后应用免疫荧光、qPCR等方法比较其与体外培养3d的E17.5原代细胞的成骨分化差异.采用SPSS 20.0软件包对数据进行成组样本t检验.结果:E10.5和E17.5的小鼠上颌突细胞在体外呈贴壁生长,细胞呈多边形、椭圆形.E17.5的小鼠上颌突原代间充质细胞在体外培养时,增殖速度较E10.5的小鼠上颌突细胞快.E10.5的小鼠上颌突间充质细胞成骨诱导7d后,成骨标志物Runx2和OCN的蛋白表达与未成骨诱导的E17.5上颌突间充质细胞表达相似,成骨标志物Runx2、OCN和OPN的mRNA表达和未成骨诱导的E17.5上颌突细胞表达相似.成骨诱导培养14d的E10.5的小鼠上颌突细胞与成骨诱导7d的E17.5上颌突细胞形成的钙结节无显著差异.结论:E10.5的小鼠上颌突间充质细胞体外成骨诱导培养,能较好模拟上颌突细胞体内成骨发育过程,为研究颌骨发育提供了合适的细胞模型.     

体外三维培养下诱导人胚胎面突外胚问充质干细胞向成牙本质样细胞分化

目的：探讨人胚胎面突外胚间允质干细胞向成牙本质样细胞分化的过程。方法：采用体外细胞三维立体培养的方法，在转化生长因子B1(TGFβ1)、牙本质非胶原蛋白(DNCP)的诱导下，通过形态学观察、免疫组化、RT-PCR等方法，探索外胚间充质干细胞向成牙本质样细胞分化的可能性及生长因子在其中所起的作用。结果：人胚胎面突外胚间充质干细胞在胶原中生长良好。培养4d，在TGFβ1 DNCP组中细胞出现核极化，有很长的突起，细胞平行排列。诱导的细胞有许多与成牙本质细胞相似的超微结构。抗牙本质涎蛋白(DSP)呈阳性反应。碱性磷酸酶活性增强。细胞在矿化液中能形成矿化结节。RT-PCR显示mRNA水平表达成牙本质细胞特异的牙本质涎磷蛋白(DSFP)。结论：三维立体培养下，人胚胎面突外胚间充质干细胞在TGFB1及DNCP的作用下能分化为成牙本质样细胞。本结果将外胚间充质干细胞作为前体，诱导分化出成牙本质样细胞，为研究牙齿的发育及分化提供了良好的模型和实验依据。     

FGF-9参与调控小鼠上颌突间充质细胞体外成骨分化的研究

目的:研究成纤维细胞生长因子9(FGF-9)对体外培养的小鼠上颌突间充质细胞成骨分化的调控作用。方法 :体外培养E12.5(胚胎第12.5天)的小鼠上颌突间充质细胞,取第1代细胞进行成骨诱导,实验组加入FGF-9人重组蛋白,诱导培养1周后通过q PCR、免疫荧光和茜素红染色检测其成骨能力。结果:体外培养的E12.5小鼠上颌突间充质细胞表达FGF9和FGFR3。成骨诱导可促进上颌突间充质细胞表达成骨标记物ALP、Runx2和OCN;加入FGF-9人重组蛋白可降低成骨标记物ALP、Runx2和OCN的表达,减少钙结节形成。结论:体外培养时,FGF9参与负调控上颌突间充质细胞的成骨分化。     

牙胚细胞条件培养液诱导大鼠胚胎面突外胚间充质细胞向成牙本质样细胞分化

目的：探讨牙胚细胞条件培养液（TGC—CM）在诱导面突外胚间充质细胞向成牙本质样细胞分化中的作用。方法：取妊娠12．5d SD大鼠胎鼠第4代下颌突外胚间充质细胞，在牙胚细胞条件培养液（TGC—CM）的诱导下，通过形态学观察、免疫组化、RT—PCR等方法，探索牙胚细胞条件培养液诱导面突外胚间充质细胞向成牙本质样细胞分化的可能。结果：面突外胚间充质细胞在诱导培养基中生长良好。培养7d，在诱导组中细胞出现核极化，有很长的突起，细胞平行排列。抗牙本质涎蛋白（DSP）呈阳性反应。RT—PCR显示mRNA水平表达成牙本质细胞特异的牙本质涎磷蛋白（DSPP）和牙本质基质蛋白-1（DMP-1）。结论：面突外胚间充质细胞在含有多种细胞因子的TGC—CM的作用下能分化为成牙本质样细胞，能为研究牙齿的分化和发育提供良好的模型和实验依据。     

釉基质蛋白联合骨髓基质细胞膜片促进类牙骨质异位生成的实验研究

目的:研究釉基质蛋白(enamel matrix proteins,EMPs)诱导犬骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)在裸鼠体内促进类牙骨质异位生成的作用和意义。方法:体外分离培养犬骨髓基质细胞并制备细胞膜片,包裹于牙本质根片上,与煅烧骨块紧密贴合捆绑后,制成牙根片/细胞膜片/煅烧骨复合物,体外模拟根周系统。据牙根片是否事先涂覆釉基质蛋白(EMPs),分为实验组和对照组。将2组的"牙根片/细胞膜片/煅烧骨复合物"分别植入裸鼠背部皮下,8周后取材,进行组织学观察和免疫组化检测。结果:实验组的根片上新生出了不规则类牙骨质样物质,并有矿化基质沉淀,有较强骨桥素(osteopontin,OPN)表达;对照组根片上未见类牙骨质样物质或矿化基质沉淀,OPN表达较弱。结论:釉基质蛋白在体内能诱导骨髓基质细胞向类成牙骨质细胞方向分化,从而促进牙周再生。     

The effect of Emdogain on ectopic bone formation in tubes of rat demineralized dentin matrix

BACKGROUND: Emdogain (EMD) is made from enamel matrix proteins (EMPs) from the tooth germ of swine and propylene glycol alginate (PGA) as a matrix. The function of EMD is known to differentiate cells of the dental follicle into cementoblasts. However, little is known about the effect of EMD on mesenchymal cells in other tissue. OBJECTIVE: The purpose of this study was to investigate whether EMD has the ability to induce hard tissue when applied with or without demineralized dentin matrix. METHODS: Half of the dentin tubes prepared from rat incisors were demineralized by treatment with 0.6 N hydrochloric acid for 3 h. EMD or PGA was injected into the demineralized or non-demineralized dentin tubes, which were then transplanted into rectus abdominis muscles. Untreated dentin tubes were also transplanted as a control. Animals were killed at 7, 14 and 21 days after the implantation. RESULTS: Non-demineralized dentin tubes with or without EMD or PGA did not form any hard tissue. In the demineralized group, chondrogenesis in the PGA groups occurred earlier than in the EMD groups. The expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) mRNA in the demineralized group with PGA at day 14 was the highest. The expression of osteopontin and osteocalcin mRNAs was higher in all groups at 21 days compared with 7 or 14 days. CONCLUSION: These results suggest that neither EMD nor PGA has the ability to induce hard tissue and that EMPs contained within EMD might aggregate on the dentin surface and inhibit the effect of the demineralized dentin matrix.     

骨皮质切开术辅助大鼠正畸牙移动中OPNmRNA、BSPmRNA、OCNmRNA表达的研究

目的:观察骨桥蛋白(OPN),骨涎蛋白(BSP),骨钙蛋白(OCN)在大鼠骨皮质切开术辅助正畸牙移动过程中的表达情况。方法:选取健康雄性Wistar大鼠65只,60只大鼠随机分成3组:组Ⅰ:选择性骨皮质切开术;组Ⅱ:传统的牙齿移动;组Ⅲ:混合组,剩余5只作为空白对照组(不作任何处理)。用镍钛螺旋拉簧施加约60 g力近中移动上颌实验侧第一磨牙,在第一磨牙颊腭侧行骨皮质打孔术式,分别在加载第7、14、21、28、42天颈椎脱臼处死取材,进行SYBR Green实时荧光定量PCR技术,对Ct值进行分析。结果:混合组中的成骨细胞相关细胞因子:OPN(骨桥蛋白),Bone sialoprotein(BSP骨涎蛋白),Osteocalcin(OCN骨钙蛋白)的表达早期增加暗示了同化合成反应的增加。结论:正畸牙齿移动初期骨皮质切开术加速了牙齿移动,改变了早期骨代谢状态,成骨活跃,支持区域性骨代谢加速学说。     

釉质基质蛋白通过miR-32对乳牙牙髓干细胞成骨与成脂分化的影响

目的: 探讨釉质基质蛋白（EMPs）对乳牙牙髓干细胞（SHED）成骨和成脂作用的影响,并探讨其分子机制。方法: 采用流式细胞术检测SHED表面抗原CD73、CD146、CD34和CD45的表达。通过OB成骨诱导液诱导SHED,采用茜素红染色检测其成骨分化能力。将SHED分为4组,NC组为无效序列shRNA干扰SHED,EMPs组为无效序列shRNA干扰SHED后,再用100 μg/L EMPs干预SHED,miR-32 inhibitor组为miR-32 shRNA质粒干扰SHED,EMPs+miR-32 inhibitor组为沉默miR-32后,再用100 μg/L的EMPs组干预SHED。qPCR检测miR-32、牙本质涎磷蛋白 (DSPP)、牙本质基质蛋白1 (DMP-1)、过氧化物酶体增殖剂激活受体γ（PPARγ）和CCAAT增强子结合蛋白α（C/EBPα）的基因表达。采用Western免疫印迹法检测DSPP、DMP-1、PPARγ和C/EBPα蛋白表达量,茜素红染色检测SHED成骨能力,油红O染色检测SHED成脂能力。采用GraphPad Prism 5软件进行统计学分析。结果: 流式细胞术结果显示,SHED的CD146和CD73阳性表达,CD34和CD45阴性表达,与干细胞表面标志物特征一致。茜素红染色和油红O染色显示,矿化结节和油滴明显增多,与干细胞多向分化特征一致。与NC组相比,EMPs组中miR-32基因表达量显著增加（P<0.05）,miR-32 inhibitor组和EMPs+miR-32 inhibitor组中miR-32表达量显著减低（P<0.05）。与NC组相比,EMPs组DSPP和DMP-1表达量,矿化结节数量显著增加（P<0.05）,PPARγ和C/EBPα表达量和油脂滴数量显著降低（P<0.05）,而miR-32 inhibitor组结果与之相反（P<0.05）。与miR-32 inhibitor组相比,EMPs+miR-32 inhibitor组DSPP、DMP-1、PPARγ和C/EBPα表达量,矿化结节数量和油脂滴数量无显著差异（P>0.05）。与EMPs组相比,EMPs+miR-32 inhibitor组DSPP和DMP-1表达量,矿化结节数量显著降低（P<0.05）,而PPARγ和C/EBPα表达量及油脂滴数量显著增加（P<0.05）。结论: EMPs通过促进miR-32的表达,从而调控SHED的成骨和成脂分化。     

金刚石涂膜种植材料骨界面区骨钙素mRNA表达

目的：探讨骨组织形成过程中骨钙素表达规律,评价金刚石-钛涂膜,纯钛和羟基磷灰石三种材料植入界面骨细胞功能情况,以利筛选出新的种植材料。方法：本实验将金刚石-钛涂膜、纯钛和羟基磷灰石三种种植材料,植入鼠下颌骨内,进行骨界面骨钙素mRNA检测及骨钙素免疫组织化学染色。结果：金刚石-钛涂膜材料新骨生成启动早,能明显加快组织的骨性愈合;金刚石和羟基磷灰石种植材料骨钙素mRNA表达量明显大于纯钛（P〈0．01）。结论：骨钙素mRNA表达与界面区细胞增殖、新骨形成有关;骨钙素mRNA的检测有助于界面区细胞功能状态的判断。     

壳聚糖纳米粒介导BMP-2基因转染骨髓基质干细胞的基因表达

目的旨在对壳聚糖纳米粒介导BMP-2基因转染骨髓基质干细胞向成骨样细胞分化的基因表达作一研究。方法根据不同浓度的壳聚糖纳米粒介导的BMP-2(pBMP-2),试验组分为CPB50组(50μg/mL pBMP-2),CPB100组(100μg/mL pBMP-2)和CPB200组(200μg/mL pBMP-2)。骨髓基质干细胞在壳聚糖纳米粒介导的BMP-2基因转染分化后,检测和分析成骨样细胞的特征性分子(碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)、护骨素(Osteoprotegerin,OPG)、骨钙素(Osteocalcin,OC)、骨桥蛋白(Osteopontin,OPN))的表达水平。结果基因转染后细胞中的ALP、OPG、OC和OPN基因呈现高表达,尤其是CPB200组最高。结论壳聚糖纳米粒介导BMP-2基因转染骨髓基质干细胞后能促进细胞中成骨样细胞特征性分子的高表达。     

Emdogain promotes osteoblast proliferation and differentiation and stimulates osteoprotegerin expression

PURPOSE: The purpose of this study was to investigate the effects of EMD on the growth and differentiation of osteoblastic cells (MC3T3-E1) and on the expression of osteoprotegerin (OPG), a key cytokine that inhibits osteoclastogenesis and osteoclast function. STUDY DESIGN: MC3T3-E1 cells were treated with 100 microg/mL EMD in serum-free medium for 1, 2, 3, 5, and 7 days, or in 2% fetal bovine serum (FBS) for 3 weeks. Cells incubated without EMD served as negative control. At the end of each incubation period, cell numbers were counted and total cellular mRNA was extracted. Northern blot analysis and RT-PCR were performed to determine the mRNA levels of core binding factor alpha (Cbfa1), collagen alpha1 (I), bone sialoprotein (BSP), osteocalcin (OC), insulin-like growth factor I (IGF-I), and OPG. Alkaline phosphatase (ALP) activity was also determined and compared between treatment and control groups. RESULTS: A marked increase in cell numbers was observed in EMD-treated groups from day 2 to day 7 (P < .01). mRNA expression of collagen alpha1 (I), BSP, OC, OPG, and IGF-I were up-regulated in cells treated with EMD. ALP activity was significantly increased by EMD treatment after 3-week culture under differentiating conditions (P < .05). The expression of Cbfa1 was not affected by EMD treatment from day 1 to day 5; the levels were elevated after culturing for 3 weeks in EMD-treated cells. CONCLUSIONS: EMD promotes both proliferation and differentiation of MC3T3-E1 cells and indirectly inhibits osteoclastogenesis and osteoclast function by stimulating the expression of OPG.     

Enamel Matrix Derivative Promotes Healing of a Surgical Wound in the Rat Oral Mucosa

Background: Enamel matrix proteins (EMPs) play a role in enamel formation and the development of the periodontium. Sporadic clinical observations of periodontal regeneration treatments with enamel matrix derivative (EMD), a commercial formulation of EMPs, suggest that it also promotes post‐surgical healing of soft tissues. In vitro studies showed that EMD stimulates various cellular effects, which could potentially enhance wound healing. This study examines the in vivo effects of EMD on healing of an oral mucosa surgical wound in rats. Methods: A bilateral oral mucosa wound was created via a crestal incision in the anterior edentulous maxilla of Sprague‐Dawley rats. Full‐thickness flaps were raised, and, after suturing, EMD was injected underneath the soft tissues on one side, whereas the EMD vehicle was injected in the contralateral side. Animals were sacrificed after 5 or 9 days, and the wound area was subjected to histologic and immunohistochemical analysis of the epithelial gap, number of macrophages, blood vessels, proliferating cells, and collagen content in the connective tissue (CT). Gene expression analysis was also conducted 2 days post‐surgery. Results: EMD had no effect on the epithelial gap of the wound. On both days 5 and 9, EMD treatment increased significantly the number of blood vessels and the collagen content. EMD also enhanced (by 20% to 40%) the expression of transforming growth factors β1 and β2, vascular endothelial growth factor, interleukin‐1β, matrix metalloproteinase‐1, versican, and fibronectin. Conclusion: EMD improves oral mucosa incisional wound healing by promoting formation of blood vessels and collagen fibers in CT.     

Survivin mRNA、Caspase-3mRNA在舌鳞癌中的表达及相关性

目的:检测舌鳞癌组织中凋亡抑制基因Survivin mRNA及Caspase-3 mRNA的表达,探讨其在舌鳞状细胞癌中的意义及相关性。方法:应用原位杂交方法检测10例正常舌黏膜、45例舌鳞状细胞癌标本中Survivin mRNA及Caspase-3 mRNA的表达情况。采用SPSS13.0软件包进行χ2检验及Fisher精确概率法检验,指标间关系采用Spearman等级相关分析。结果:舌鳞癌标本中Survivin mRNA阳性表达率为55.6%,正常对照组全部为阴性,两组差异显著(P<0.01);舌鳞癌标本中Caspase-3 mRNA阳性表达率为42.2%,明显低于正常对照组的80.0%(P<0.05);Survivin mRNA高表达及Caspase-3 mRNA低表达与舌鳞癌组织学分级、颈淋巴结转移相关(P<0.05);与TNM分期密切相关(P<0.01);经Spearman等级相关分析,两者之间呈显著负相关,r=-0.412,P=0.005。结论:在舌鳞癌中,Survivin mRNA参与了抑制Caspase-3m RNA的表达,且这种抑制作用与肿瘤的发生、发展相关。