携带Herceptin-MICB融合蛋白基因的腺病毒载体的构建

为了构建携带Herceptin-MICB融合蛋白基因的腺病毒载体,筛选出能表达该融合蛋白的重组腺病毒,检测其表达融合蛋白的情况及抗肿瘤特征.首先,通过PCR将NKG2D的配体MICB的基因片段插入含有全长抗体Herceptin基因的5型腺病毒穿梭载体pDC339-Her中,获得载体pDC339-Her-MICB与腺病毒骨架载体pBHGlox△E1,3Cr重组,然后在293细胞内进行病毒包装得到非增殖型腺病毒Ad-Her-MICB,纯化后测病毒滴度.双抗体夹心ELISA和Western blot检测融合蛋白的表达情况;间接免疫荧光实验(IFA)检测融合蛋白的特异性.酶切后DNA电泳鉴定证实载体构建成功,重组病毒经PCR鉴定携带融合蛋白基因.融合蛋白的表达量为(623.25±38.62)ng/mL;Westhern blot显示:该融合蛋白与商品化的Herceptin抗体轻链重链比较,大小一致,浓度匹配;间接免疫荧光检测(IFA)显示了融合蛋白与HER-2过表达的卵巢癌细胞株SK-OV-3结合的特异性.结果表明:腺病毒Ad-Her-MICB携带Herceptin-NKG2D配体融合蛋白基因能在体外正常表达且与商品化的Herceptin生物学特性相似,为融合蛋白的抗肿瘤治疗奠定基础.     

自噬基因融合蛋白重组多克隆抗体的纯化与检测

为了提纯并鉴定自噬基因融合蛋白重组多克隆抗体,探讨其在部分组织中的免疫定位．首先合成带谷胱甘肽转移酶标签的自噬基因融合蛋白,免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,然后用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测抗体浓度,最后用免疫亲和纯化方法提纯抗血清中的多克隆抗体,酶联免疫吸附法检测抗体效价,蛋白印迹检测抗体特异性及在组织中的表达情况．结果表明：制备得到自噬基因融合蛋白重组多克隆抗体经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其质量浓度为每10μL含5μg,用酶联免疫吸附法显示此抗体效价及特异性较高,蛋白印迹显示蛋白大小为55kD左右．     

大豆主要过敏原Gly m Bd 28K基因的克隆表达、纯化及多抗血清的制备

RT-PCR克隆大豆主要过敏原Gly m Bd 28K基因,根据序列设计引物,扩增目的基因的开放阅读框,与MBP载体连接,测序鉴定,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,并用IPTG诱导表达.亲和层析法纯化重组蛋白,SDS-PAGE验证蛋白的纯度,免疫新西兰大白兔,收集多抗血清,用ELISA法测效价.扩增出含Gly m Bd 28K目的基因片段,诱导并获得高浓度和预期相符的表达产物,经层析纯化出Gly m Bd 28K蛋白,免疫新西兰大白兔,获得效价为1∶1.6×106多抗血清.     

大肠杆菌中可溶性表达重组人成纤维细胞生长因子21及制备

为在大肠杆菌中高效、非融合、可溶性表达重组人成纤维细胞生长因子21(rhFGF-21),研究了纯化方法,以获得具有较高生物活性的rhFGF-21。全基因合成人成纤维细胞生长因子21cDNA序列,克隆进原核表达载体pET-3c,在转化大肠杆菌BL21(DE3)PlysS中进行表达。表达产物经盐析、层析等方法纯化后,利用3T3-L1细胞鉴定其促葡萄糖摄取的生物学活性。结果表明:rhFGF-21在BL21(DE3)PlysS实现了高效、非融合、可溶性表达,目的蛋白占菌体总蛋白的20%左右;表达产物经纯化后,纯度可达95%以上;表达产物能够明显促进3T3-L1细胞对葡萄糖的吸收。该方法成功实现了rhFGF-21在大肠杆菌中高效可溶性表达。     

家蚕新基因Bmbzj的表达、抗体制备及亚细胞定位

在自建的家蚕蛹cDNA文库中发现了一条新基因序列,GenBank登录号为DY231426.该基因是一个同源性很低的基因,未发现保守结构域,将其命名为Bmbzj.Bmbzj基因全长661bp,由99 bp的5'端非翻译区序列(5'UTR)、486 bp的开放读码框(ORF)和76 bp的3'端非翻译区序列(3'UTR)组成.生物信息学分析结果表明蛋白Bmbzj可能存在跨膜区和信号肽.将该基因插入到载体pGEX-4T-3中,构建了该基因编码的重组质粒pGEX-4T-3-Bmbzj,转化大肠杆菌Rosetta后,IPTG诱导表达了该融合蛋白,并利用亲和层析的方法纯化该重组蛋白,免疫新西兰兔制备多克隆抗体.亚细胞定位实验结果表明该蛋白只存在于细胞质中.     

利用GST融合多肽制备人源膜受体多抗的研究

膜受体是一类膜蛋白,而全长的膜蛋白很难通过基因工程获得,这给制备该类蛋白的抗体增加了难度。为了探索一条制备膜受体多克隆抗体的新途径,通过基因重组技术,将膜受体的抗原决定簇与GST标签进行融合表达,然后免疫新西兰兔,获得了相应的多克隆抗体。结果表明,利用融合GST的多肽进行抗体制备的方法是可行的。     

家蚕MBP-Bmlp7蛋白的克隆表达及免疫学鉴定

克隆表达家蚕蚕蛹30 kD(1 kD=1 u)脂蛋白家族成员Bmlp7(Bombyx mori lipoprotein 7)的融合蛋白,鉴定其致敏原性.合成Bmlp7的基因后连接至载体质粒p MAL-C5e上,在大肠杆菌BL21中诱导表达出麦芽糖结合蛋白(maltose binding protein,MBP)-Bmlp7,纯化后,利用Western blot鉴定MBP-Bmlp7融合蛋白与家蚕过敏患者血清中特异性免疫球蛋白E(immunoglobulins E,Ig E)的结合能力.结果显示,纯化得到了纯度较高的MBP-Bmlp7融合蛋白,且该融合蛋白能够与家蚕过敏患者血清特异性IgE结合,说明Bmlp7是家蚕中一种潜在的致敏原.     

约氏疟原虫Pys25和Pys48抗原的表达与产物活性初步研究

通过家蚕杆状病毒表面展示技术获得约氏疟原虫有性阶段候选抗原Pys25(217AA)和Pys48(455AA),以期建立一种新的鼠疟模型。首先利用大肠杆菌原核表达系统表达这两种抗原,免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体,同时利用家蚕杆状病毒表面展示技术,并改造pFastBac Dual载体,在其Ph启动子前端加入哺乳动物启动子CMV,并将目的蛋白基因与杆状病毒囊膜蛋白gp64基因片段融合表达,融合蛋白展示在病毒粒子表面。用其免疫Balb/c小鼠,在小鼠体内,CMV启动子启动融合蛋白表达,共同刺激小鼠产生多克隆抗体。通过间接ELISA检测,两种抗原抗体效价均能达到1∶12 800。本实验为后期免疫阻断效应研究、多时期多价疫苗的构建及鼠疫模型的建立提供了实验基础。     

嗜水气单胞菌RecA和Gap-2作为内参蛋白的评价

为确定嗜水气单胞菌中可用于Western Blot的适宜内参蛋白,考察了重组酶RecA和3-磷酸甘油醛脱氢酶Gap-2在该菌不同培养阶段及培养条件下的表达稳定性.以嗜水气单胞菌基因组为模板扩增recA和gap-2基因,并对蛋白进行异源表达.利用亲和层析和凝胶过滤层析技术纯化蛋白,制备多克隆抗体.通过Western Blot技术研究了RecA和Gap-2蛋白在嗜水气单胞菌不同培养时间、不同培养温度和培养环境中铁离子浓度差异条件下的表达情况.结果显示,重组表达载体pET-28a-recA和pET-28a-gap-2构建成功,可与His标签融合表达.纯化后得到了纯度较高的RecA和Gap-2,以二者为抗原制备的多克隆抗体效价均达到1:512000.Western Blot结果表明,RecA在细菌生长稳定期表达情况与前期有所差异,而Gap-2蛋白在该菌不同培养时期、温度及铁离子浓度差异的环境中表达较为恒定.研究表明,Gap-2更适合作为嗜水气单胞菌Western Blot检测用内参蛋白.     

携带Herceptin与MICA胞外结构域融合基因的重组腺病毒的构建及鉴定

通过构建能表达抗体Herceptin与MICA胞外结构域的融合蛋白的重组腺病毒,为进一步联合NK细胞的治疗研究奠定基础.采用Overlap-PCR的方法获得Herceptin与MICA胞外结构域的融合基因,并将融合基因连接到载体pDC339上.接着再利用酶切及PCR方法鉴定载体及重组病毒基因的正确性,并通过ELISA和Westem Blot检测融合蛋白的表达情况,最后经间接免疫荧光分析(IFA)检测融合蛋白的结合特性.构建的载体酶切后经电泳鉴定证实构建成功,重组病毒DNA的PCR显示病毒携带了Herceptin的轻链基因、重链基因及MICA胞外结构域的基因;ELISA和Western Blot证实重组腺病毒成功地表达出了目的融合蛋白;IFA实验表明融合蛋白能与SK-OV-3细胞表面的Her-2受体特异性地结合.最后成功地构建了能表达具有正常结合特性的抗体Herceptin与MICA胞外结构域的融合蛋白的重组腺病毒,为之后与NK细胞的联合治疗研究奠定基础.     

APOBEC 家族的功能研究进展

APOBEC是人体内具有胞嘧啶脱氨酶活性的家族，共11个成员，是人体的天然防御者。 APOBEC通过与DNA和RNA结合，使底物上的胞嘧啶C脱氨基，可完成其各自不同的功能。 APOBEC1编辑载脂蛋白B的mRNA，AID在抗体成熟中的体细胞超突变和类别转换重组中起关键作用，APOBEC3可抑制反转录病毒复制，而APOBEC2和APOBEC4的功能还不完全清楚。采用文献综述法，比较分析近年来国内外关于APOBEC家族各成员的结构和功能研究的新进展，为进一步研究APOBEC家族的抗病毒功能和艾滋病等疾病的治疗提供参考。     

CD44、CD133和ABCG2潜在癌症生物标记蛋白质的表达

癌症生物标记物是一种新的早期癌症治疗工具,它既可用于癌细胞抑制,也可用于将其杀灭.癌干细胞已被证明是癌症的一个关键标志细胞.最近,随着单克隆抗体技术的发展生物标记物的研究发展迅速,一些重要的癌干细胞标记已被确认.单克隆抗体是癌标记物应用的重要技术,也是临床诊断和治疗重要手段.本研究的癌干细胞标记物CD44,CD133和ABCG2,分别通过Genestar等软件分析,并选定目标抗原特异性的基板的基因,设计出目标基因的模板和引物.经过免疫分析,设计出编码基因,利用PCR克隆技术,将其并插入预先选定的pGEX-4T-1或pET32a质粒上的克隆位点上.载有预定基因的标记物,通过载体转入感受态的E.coli BL21中,在加入IPTG的条件下,诱导其蛋白质的表达,得到目标蛋白质产物.利用SDS-PAGE和Westem Blot analysis,验证其表达的正确性.研究的目标蛋白质片段CD44、CD133和ABCG2,可以用于癌干细胞进一步的研究和其单克隆抗体的制作.

Abstract：

Cancer biomarkers can provide the chance to develop therapies for cancer during its the natural progression, to either inhibit or eliminate the disease. Cancer stem cells have been proved to be critical in the progression of cancer. Recently,some important cancer stem cells markers have been characterized. The rapid development of cancer biomarker research is attributed to a large extent to the advance of the monoclonal antibody technology. Monoclonal antibodies specific for cancer biomarkers have important clinical use in diagnosis and therapeutics. In the present studies, the cancer stem cell markers,CD44,CD133 and ABCG2 ,were first analyzed for their respective antigenic epitopes by Genestar. Then the gene encoding protein fragment with sound immunogenicity was cloned by PCR and inserted to the multiple cloning site of the pGEX-4T-1 or pET32a plasmid. The resulting expression vector was transformed into the E. coli BL21 strain and the protein expression was induced by the addition of IPTG. Finally,the target protein was characterized by the SDS-PAGE and Western Blot analysis. In further study,these CD44 ,CD133 and ABCG2 target protein fragments will be utilized to develop monoclonal antibodies, which can be used in cancer stem cell research.     

人溶菌酶基因在毕赤酵母中的表达及其抗菌活性检测

将PCR扩增的人溶菌酶编码基因克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,双酶切和测序鉴定表明,重组载体构建正确.电转化毕赤酵母GS115菌株,通过G418筛选获得高拷贝重组菌株后,用甲醇诱导表达;通过SDS-PAGE检测证明上清中有目的蛋白,表达产物与预期大小的人溶菌酶蛋白分子质量15 ku一致,其表达量占分泌总蛋白...     

酵母多基因表达载体在纤维素生物转化中应用

构建含酿酒酵母组成型强启动子PGK、G418抗性基因及rDNA片段的整合型载体pScIKP,利用rDNA多个同源重组位点,将外源基因以多拷贝整合到酵母染色体上,无需诱导即可持续表达;利用载体位于表达盒两端同尾酶,可插入多个基因表达盒,实现多基因稳定共表达.为检验共表达情况,反转录从绿色木霉中获得纤维素酶基因eg3和cbh2, 克隆并转化获得重组酵母菌株S.cerevisiae-ec. 该重组酵母能降解羧甲基纤维素形成水解圈;用羧甲基纤维素还原糖法和滤纸酶活力法测定酶活力,其最适温度和最适pH值与所表达单酶相似,表明共表达未影响两种酶的生物学特性;且双酶具有协同作用,能更有效降解非结晶纤维素.pScIKP载体能成功用于多个外源基因共表达和产物协同作用的研究,为构建能直接降解纤维素的酿酒酵母菌株,实现纤维素可再生能源的生物利用奠定了基础.     

人血清淀粉样蛋白A1原核表达及胶体金检测方法的建立

通过胶体金免疫层析技术建立一种特异、便捷、快速的SAA1定量检测新方法.利用大肠杆菌BL21(DE3)原核表达人血清淀粉样蛋白A1(SAA1),根据BL21(DE3)表达偏好性设计并合成SAA1蛋白基因片段,构建表达载体pET-28a-SAA1,采用CaCl2法制备BL21(DE3)感受态,热激转化法将pET-28a-SAA1转入到BL21(DE3).经表达条件优化,获得重组蛋白最佳诱导表达条件:温度30℃,时间6h,转速180rpm/min,培养基pH 7.0,IPTG浓度0.4mM,诱导表达后目的蛋白经SDS-PAGE电泳鉴定,Ni柱纯化、透析、浓缩从而获得浓度为8.09mg/ml,纯度为85%的SAA1.同时,结合胶体金标记技术,建立了SAA1胶体金免疫层析试纸检测方法,线性范围0.16~500μg/ml,最低检测限0.16μg/ml,该研究为临床体外诊断SAA1快速检测提供技术基础.     

靶向肝癌细胞的嵌合AAV建库及筛选

采用Shuffling的方法,将AAVl-9Cap基因序列进行改组,筛选出高效靶向肝癌细胞的嵌合AAV载体。以pAAV-MCS载体为骨架,构建出含从V2ITR和Rep2序列的pAdB载体,在此基础上,构建含有嵌合Cap序列的pARC载体库,用于转染293细胞,并加入5型腺病毒（Ad5）,包装出嵌合AAV病毒。然后将包装出的嵌合AAV病毒与Ad5共感染BEL7402肝癌细胞,经过三轮筛选后,初步筛选出可以靶向肝癌细胞的嵌合AAV。最后将筛选出的AAVRep2嵌合Cap基因的融合片段连接到pMDl8-T载体上,构建出pARC-T载体,与AAV-EGFP质粒共转染293细胞,并加入Ad5,包装出病毒基因组合EGFP基因、病毒外壳为嵌合Cap的AAV病毒（cAAV-EGFP）,并用其感染BEL7402细胞,观察绿色荧光的表达。最后观察到绿色荧光表达,证明筛选出了靶向BEL7402肝癌细胞的嵌合AAV。     

HBV/HEV二价抗原的载体构建与表达

为构建一个能够表达出乙/戊型肝炎二价疫苗抗原的大肠杆菌高效重组原核表达载体,采用PCR方法扩增出HBV的S基因,及HEV的ORF2编码区的羧基末端中的414-606aa的基因片段,经过T载体连接、菌落PCR、双酶切、测序鉴定后,将这两部分重组入含有增强子的pT-T7高效的E.coli表达载体中。构建了pT-T7SE表达载体并且表达出相应的目的蛋白。该实验结果为研制预防乙型和戊型肝炎双价疫苗提供了实验技术基础。     

骨形态发生蛋白-2基因工程菌的构建及可溶性研究

骨形态发生蛋白是一类调节骨组织发育的生长因子,其中骨形态发生蛋白-2诱导成骨活性最强,在骨组织工程研究中最具研究意义.为获得能高效表达溶解性高的人骨形成蛋白-2(BMP-2)的基因工程菌,用PCR方法扩增得到BMP-2的基因序列,直接将PCR产物连接到胞内融合表达型T载体质粒pMT-L上,构建包括麦芽糖结合蛋白(MBP)、连接肽、6个His、EKsite(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)和BMP-2的表达载体,转化E.coli DH5α,经抗性筛选和菌落PCR鉴定,抽提阳性克隆质粒转化表达宿主E.coli BL21(DE3),成功构建可在大肠杆菌细胞质内表达MBP-BMP-2融合蛋白的基因工程菌.工程菌经0.1mmol/L IPTG诱导后,可获得表观分子量约为55kD的以可溶形式表达的BMP-2融合蛋白.