TNFα-Tumstatin45-132分子构建、生物学特征预测和活性验证

目的 构建人重组TNFα-Tumstatin45-132融合蛋白的表达载体，预测接头的合理性和可行性．并对融合蛋白活性进行验证。方法 采用基因融合序列重叠延伸（s0E）策略，构建新型TNFα-Tumstatin45-132表达载体；应用核酸和蛋白质序列软件Antheprot和PepTool对融合基因及接头部位翻译后在二级结构水平上的柔性、抗原性、亲水性等生物特性加以预测；用细胞毒试验和内皮细胞增殖试验测定表达的融合蛋白活性。结果 构建新型重组TNFα-Tumstatin45-132融合基因．经DNA测序证实与设计完全一致；TNFa-Tumstatinml32融合基因的氨基酸序列经软件分析，并与TNFα和Tumstatin45-132单独分析的结果比较，未出现新的抗原性，亲水性没有改变，接头部位具有很低的抗原性，接头部位呈中性；表达的融合蛋白经证实具有杀伤L929细胞和抑制ECV304细胞增殖的作用。结论 通过计算机软件对TNFα-Tumstatin45-132融合蛋白的预测，并与TNFα和Tumstatin45-132分别对比分析，有利于合理设计融合蛋白，最大程度地保留TNFα和Tumstatin45-132各自的生物活性和功能；生物活性分析证实设计具有一定的科学性和合理性。     

MSH-PE40重组毒素的构建和抗头颈部肿瘤的实验性研究

目的构建以绿脓杜菌外毒素A(PE40)为毒性部分的重组毒素,并研究其抗头颈部肿瘤的效应。方法利用基因工程技术将α促黑激素(-αmelanoma stimulating hormone,-αMSH)与绿脓杆菌外毒素A的部分重组基因,克隆到高效表达载体pET-20b中,表达出重组蛋白MSH-PE40,进行头颈部肿瘤细胞的体外杀伤实验。结果成功地将-αMSH基因与PE40基因融合,处于T7启动子和终止子调控之下。初步纯化的MSH-PE40对黑色素瘤具有明显的细胞毒性。结论MSH-PE40具有特异性杀伤-αMSH受体的肿瘤的功能。     

荧光蛋白标记的促红细胞生长素融合蛋白的设计和预测

目的：探讨pTRE顺式作用元件调控，EGFP标记hEPO(hEPO-EGFP)融合蛋白设计的合理性。方法：应用Gene Construction Kit2．5、www．expasy．com网站提供的分析方案，分析重组体的开放读框以及融合蛋白的柔性．并作蛋白质二级结构模拟。结果：重组体的转录受pTRE顺式作用元件调控，Linker所在部位柔性高，融合蛋白表达后，二级结构预测Linker不改变蛋白结构，完全符合作者设计EGFP标记hEPO融合蛋白的初衷。结论：重组蛋白设计合理，融合蛋白有很大可能保留了hEPO和EGFP的理化特性，为进一步的实践操作提供了可靠的理论基础。     

EGF-linker-PE40重组毒素的构建、表达及其意义

目的构建人表皮生长因子(EGF)-柔性连接肽(linker)-铜绿假单胞菌外毒素活性片段(PE40)重组毒素的表达载体并诱导表达,以探索其成为治疗肿瘤新型靶向药物的可能性。方法用PCR技术扩增出EGF和PE40基因,通过引物设计在两者之间加上19个中性氨基酸短肽(TS-(G4S)3-AC)的linker编码序列、克隆PCR产物,并构建pET22b(+)-EGF-linker-PE40表达质粒,将其转化E.coli BL21(DE3)后,诱导表达,SDS-PAGE及凝胶薄层扫描分析EGF-linker-PE40重组毒素的表达情况。结果 EGF-linker-PE40重组毒素在BL21(DE3)中可溶性表达,目的蛋白占细胞总蛋白的18%左右。结论应用基因工程技术,成功地构建了重组毒素EGF-linker-PE40的表达载体,并得到高效可溶性表达,为进一步研究其结构功能关系和肿瘤临床应用奠定了基础。     

新型重组IL6D24-PE40KDEL外毒素融合蛋白的理化分析

为了对构建成功的新型重组IL6D24-PE40KDEL外毒素融合蛋白的部分物化表征进行分析鉴定，采用Edman法、SDS-PAGE法、胰蛋白酶消化的MALDI—TOF—MS质谱法、蛋白印迹法和MTT法分别测定该融合蛋白的N-末端6个氨基酸、相对分子量、肽谱、抗原特异性以及靶向杀伤生物学活性。结果表明：所构建表达纯化的新型重组IL6D24-PE40KDEL外毒素融合蛋白N末端6个氨基酸序列为Met—lie—Asp—Lys—Gin—Ile-，而IL-6缺失24个氨基酸后的原序列为Ile—Asp—Lys—Gin—Ile-，由于采用了大肠杆菌表达系统，因此在N末端第1位多出了1个Met，经12％SDS-PAGE蛋白电泳和凝胶成像系统分析计算，其相对分子量为58．75kD，与理论值56．9kD相比误差在5％之内。MALTI—TOF—MS质谱测定共获得10个与理论预测值相符的肽段，经瑞士生物信息研究所的EXPASY分子生物服务网站的Peptident数据库搜索证明，在分子量为57kD左右的范围内未检索到与上述务件相符的已知蛋白，证明本融合蛋白为全新蛋白，与预测的目的蛋白相符。WB实验显示IL6D24-PE40KDEL外毒素融合蛋白能与IL-6及PEA抗体特异性结合。MTT生物活性测定表明，该融合蛋白对表达IL-6R的多发性骨髓瘤细胞系U266产生特异性杀伤，而对不表达IL6R的CEM淋巴细胞系无任何杀伤。结论：所研制成功的重组IL6D24-PE40KDL外毒素融合蛋白的确为一全新的具有靶向杀伤生物活性的蛋白质，与设计的完全一致，同时也证实了构建策略的可行性。     

人卵巢癌相关抗原OVA66的B细胞表位预测

目的:预测人卵巢癌相关抗原OVA66的B细胞表位。方法:B细胞表位预测,以单参数(亲水性、可及性、柔韧性、极性)预测为基础,结合ABCpred预测结果,并经二级结构预测筛选等综合分析。结果:OVA66的B细胞表位可能位于209-216,266-275,294-301,362-368和391-396氨基酸残基的区域内或附近。结论:该结果对应用合成肽抗原进行肿瘤患者的早期诊断研究具有重要指导意义。     

结核潜伏感染蛋白Rv1737cB细胞、CTL及Th表位预测与分析

目的利用生物信息学方法建立一套预测B细胞、CTL及Th细胞免疫功能多肽的方法,用于筛选新型结核病诊断抗原分子和候选疫苗抗原。方法采用DNAStar软件包中的Protean软件从α螺旋、β折叠及转角等二级结构的数量和分布、亲水性和表面可及性等方面预测分析该蛋白序列成为B细胞表位的可能性,预测CTL表位时,先采用Blast方法分析该序列与人类序列的同源性,然后综合应用SYFPEITHI超基序法、BIMAS量化基序法及Net CTL预测其CTL表位,应用RANKPEP及SYFPEITHI超基序法远程预测Th细胞表位,筛选表位集中、分值较高者作为候选多肽片段。结果 Protean软件预测结果表明Rv1737c蛋白序列亲水性和表面可及性都较弱,α转角、β折叠结构数目较多且分布广泛,而转角及卷曲结构较少,B细胞表位数目较少;Rv1737c蛋白的CTL及Th表位主要集中于第100位氨基酸之后,其中与HLA-A2表型相对的CTL表位,与HLA-DRB1*0401及HLA-DRB1*1501表型相对的Th表位较其他表型数目较多、分值较高。结论 Rv1737c蛋白可能不利于作为B细胞抗原,但其可能是一种较好的T细胞抗原,成为结核病诊断抗原分子和候选疫苗抗原。     

细粒棘球蚴 GST 抗原表位的生物信息学预测?

目的：应用生物信息软件分析细粒棘球蚴谷胱甘肽 S-转移酶(EgGST)的蛋白二级结构并预测 B 淋巴细胞表位和 T淋巴细胞表位,为后续表位疫苗的设计研究提供基本的数据和资料。方法采用 DNAstar 软件、ProPred MHC Class-Ⅱ Binding Peptide Prediction Server 和 Biosun 软件对 EgGST 的 B 淋巴细胞表位和 T 淋巴细胞表位进行预测。结果预测 EgGST 存在8个 B 淋巴细胞表位区域和7个 T 淋巴细胞表位。结论分析预测的 EgGST 抗原表位将对后续的表位疫苗研究具有重要意义。     

寨卡病毒E、NS5蛋白生物信息学分析

目的对寨卡病毒(ZIKV)E蛋白和NS5蛋白序列进行生物信息学比较研究,并分析其意义。方法利用多种生物信息在线分析工具和软件包对ZIKV E、NS5基因及编码蛋白与其他黄病毒属代表株序列比对,计算核苷酸和氨基酸同源性。预测ZIKV E、NS5蛋白跨膜区、信号肽与二级结构以及B细胞表位。结果不同地理株的ZIKV E蛋白核苷酸和氨基酸同源性分别为87.1%～100%和94.2%～100%,与黄病毒属中Spondweni病毒最接近,氨基酸同源性最高达72.8%。不同地理株的ZIKV NS5蛋白核苷酸和氨基酸同源性分别为88%～99.9%和95.5%～100%,与Spondweni病毒最接近,氨基酸同源性最高达77.5%。E蛋白二级结构以无规则卷曲居多,占50.79%,存在两个跨膜结构区域461～479aa、483～501aa,信号肽断裂位点位于501aa,可能的抗原表位区域有:317～342aa、155～181、66～89、226～238、380～384aa;NS5蛋白二级结构也以无规则卷曲居多,占51.60%,无跨膜结构区域,信号肽断裂位点位于152aa,可能的表位区域有100～114aa,、360～372、148～159、688～707aa。结论预测到ZIKV E、NS5蛋白的基本结构特征和潜在的线性B细胞表位,为ZIKV的疫苗研究和免疫诊断试剂的研制打下基础。     

巨细胞病毒抗原性肽段的固相合成及其抗原性的初步评价

目的合成巨细胞病毒结构蛋白的强抗原性表位肽段,并对其抗原性进行初步评价。方法根据巨细胞病毒结构蛋白的抗原性表位,以Fmoc基团保护的氨基酸为原料,用固相多肽合成技术(SPPS)合成了具有强抗原性的部分肽段,以高效液相色谱技术鉴定纯化,并用酶联免疫吸附剂试验对其抗原性进行了初步评价。结果成功合成了包含巨细胞病毒的结构蛋白强抗原性表位的两个肽段,纯度达95%以上,并且具有很高的抗原性。结论固相多肽合成技术可以用于制备巨细胞病毒的抗原性表位肽段,并且所合成肽段具有良好的抗原活性,可以作为抗原用于巨细胞病毒感染的检测。     

Molecular construction and characterization of a novel exotoxin fusion protein that selectively blocks the B7:CD28 costimulatory signal system

An important strategy for specifically preventing and treating graft-versus-host and host-versus-graft diseases is to selectively block the B7:CD28/cytotoxic T-lymphocyte A4 costimulatory signal system for induced immune tolerance. In this study, a novel recombinant B7-2-L-PE40KDEL fusion protein was created to target the B7:CD28 system. We used a flexible linker sequence (Gly4Ser)4 and overlapping sequence extension to link the cDNAs encoding a human B7-2 extracellular domain and a mutant truncated form of Pseudomonas exotoxin A (PE), PE40KDEL. This B7-2-L-PE40KDEL fusion gene was then inserted into the pTYB4 expression vector, expressed in Escherichia coli, and purified through Ni-NTA mealty affinity-->MonoQ anion exchange-->Superdex75 gel filtration chromatography 3-step purification protocols. Western blotting demonstrated that the B7-2-L-PE40KDEL fusion protein specifically bound antihuman B7-2 monoclonal antibody and anti-pseudomonas exotoxin A antiserum. We used the Antheprot nucleic acid and protein analyzing software to predict the characteristics of this fusion protein, and showed that the fusion did not confer new antigenicities to the fusion protein. 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide tests demonstrated that at doses ranging from 0.2 to 2 microg/mL, this fusion protein specifically killed CD28-overexpressing Jurkat cells but even at doses of 2 microg did not kill CD28-negative Hut28 cells. The results of a one-way mixed lymphocyte reaction demonstrated that the fusion protein has a range of suppressive effects on HLA class I and II matched related donors and recipients, and HLA class I and II mismatched unrelated donors. Taken together, these results demonstrate that we have developed a novel recombinant human B7-2-L-PE40KDEL exotoxin fusion protein that specifically blocks the B7:CD28 costimulatory signal system in a manner that may be of significant importance in preventing and treating graft-versus-host or host-versus-graft diseases.     

人白细胞介素2-Linker-PE38重组毒素的构建

目的　构建人白介素 2 linker PE38融合基因 ,为进一步表达具有特异性杀伤作用的融合蛋白奠定基础。方法　用PCR方法扩增绿脓杆菌外毒素 (PEA)衍生物PE38基因及柔性连接肽linker片段 ,并与人白介素 2 (Interleukin2 ,IL2 )基因连接插入质粒pET2 8a中。结果　构建的表达载体经核苷酸测序分析无突变发生。结论　成功地构建了表达质粒pIL2 linker Pe38。     

新型重组免疫抑制融合毒素蛋白B7-2-PE40KDEL的分离纯化

为了建立高效快捷能分离大量重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白的下游纯化路线，比较了不同组合的纯化策略和条件，包括反相层析、金属螯合层析、阴离子交换层析、蓝染料亲和层析和凝胶过滤层析等，并采用MTT法检测该融合蛋白的靶向杀伤活性。结果表明，在反相层析分离中疏水相分别采用了常规的甲醇和乙腈．结果为所分离的该重组融合蛋白均发生了变性，从色谱柱中分离出来就生成了絮状沉淀。在蓝染料亲和层析一步分离中，由于全菌体蛋白中与亲和树脂发生非特异结合的成分较多，极难区分目的蛋白和杂蛋白。但是，PRSETA—B7-2-PE40KDEL表达载体上带有翻译增强序列T7-g10，可在表达目的蛋白N端融合6个组氨酸，这十分有利于通过Ni—NTA金属鏊和层析法快速高纯度地纯化表达产物。根据这一特性，经反复筛选实验设计最终确定了金属螯合层析、阴离子交换层析和凝胶过滤层析三步法的纯化路线，用于纯化分离B7—2-PE40KDEL融合蛋白。所得的目的蛋白的纯度可达95％以上，总回收率为8％。Western—blot实验显示，所得蛋白可与B7-2及PEA抗体特异性结合；MTT生物活性测定表明，该融合蛋白对表达CD28受体的人T细胞系Jurkat产生特异性杀伤作用，而对不表达CD28的淋巴细胞系Raji无任何杀伤作用。结论：建立了高效快速纯化大量重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白的技术路线，所纯化的重组B7—2-PE40KDEL融合蛋白能特异性靶向杀伤表达CD28受体的人T细胞。     

Fcγ-Der f2载体构建及融合蛋白表达

目的构建人IgG Fcγ1片段Fcγ与粉尘螨Ⅱ类抗原Der f2嵌合基因真核表达载体pDisplay-Fcγ-Der f2,并转染入HEK293T细胞系瞬时表达,获得Fcγ-Der f2融合蛋白。方法以pMD19-T-Der f2载体为模板,设计引物并加入linker序列,经PCR扩增得到linker-Der f2 DNA片段。经限制性内切酶酶切后,先后将人Fcγ及linker-Der f2基因片段接入pDisplay真核表达载体。用Attractene转染试剂将其转染至HEK293T细胞使之表达融合蛋白。免疫荧光检测转染后γ2 h的HEK293T细胞并裂解细胞进行Western Blot检测。结果 pDisplay-Fcγ-Der f2质粒经双酶切鉴定及DNA测序鉴定证实序列完全正确,真核表达载体构建成功。免疫荧光鉴定转染细胞可见明显红色荧光。Western Blot检测证明融合蛋白相对分子质量为40×10~3,与理论预期值相符合,并证明了Fcγ与Der f2双功能特性。结论构建的融合蛋白Fcγ-Der f2符合目的要求。     

编码人B7-2胞外区cDNA的克隆、表达及生物活性鉴定

B7-2分子是共刺激信号系统B7/CD28/CTLA-4中的重要成员之一。为了更深入地探讨B7-2分子在调控T细胞增殖，分化及相关信号传导过程中的作用，本研究通过聚合酶链式反应（PCR）扩增编码人B7-2分子胞外区的cDNA，测序后定向插入多个原核表达载体并诱导目的蛋白表达，用Western印迹和MTT鉴定生物活性。结果表明；通过pGEX-4T-2载体实现了在宿主菌BL-21（DE3）-codenplus-RIL中较高水平的表达，蛋白表达量为20%。经Western印迹和MTT鉴定，所表达及初步纯化的B7-2胞外区重组蛋白能与抗人B7-2单抗发生特异性结合；在抗人CD3单抗的协同下，B7-2胞外区重组蛋白能有效地促进外周血单核细胞的增殖。结论：B7-2胞外区重组蛋白的获得为进一步研究B7-2分子结构与功能的关系奠定了基础。     

Protein transfer of glycosyl-phosphatidylinositol (GPI)-modified murine B7-1 and B7-2 costimulators.

The feasibility of using protein transfer as a means for enhancing the immunogenicity of murine tumor cells was evaluated. Glycosyl-phosphatidylinositol (GPI)-modified variants of the murine costimulators B7-1 (CD80) and B7-2 (CD86), designated B7-1.GPI and B7-2.GPI, respectively, were immunoaffinity-purified from CHO-K1 cells transfected with glutamine synthetase amplification/expression constructs encoding each of these chimeric proteins. The proteins, once purified in detergent-depleted pseudomicelles, were exogenously incorporated into the membranes of several different murine tumor lines (EL-4, SMUCC-1, BW5147.3, P815, Ag104A, and EMT6). Successful membrane painting with the B7.GPI proteins was documented by immunofluorescence and flow cytometry, and membrane integration was verified by demonstrating that the reincorporated proteins were phosphatidylinositol-phospholipase C-sensitive, glycosyl-phosphatidylinositol-phospholipase D-resistant, and refractory to removal with dimyristylphosphatidylcholine vesicles. Significantly, B7-1.GPI and B7-2.GPI could be together copainted onto EL-4 cell surfaces with no interference observed between the two. A standard in vitro proliferation assay was used to show that both of the B7.GPI proteins retained costimulator function after membrane reincorporation. These findings further validate the therapeutic potential of protein-transferred costimulator.GPIs and pave the way for their combinatorial use in animal tumor models.     

多发性骨髓瘤黏蛋白-1基因真核表达载体构建及其在COS-7细胞中的表达

本研究旨在构建多发性骨髓瘤黏蛋白1（两串联）基因（rnuc1-2vntr）的真核表达载体及该重组体在COS-7细胞中的表达,为研制多发性骨髓瘤基因疫苗奠定基础。以MUC1—2VNTR蛋白的编码基因作为目的基因,在其前端加上KOZAK序列后,两端分别加上HindⅢ和XbaⅠ酶的酶切位点,将人工合成的全基因定向插入pcDNA3．1／myc—his B载体中,转化E-coli感受态细胞获得重组菌株,经酶切及测序鉴定为pcDNA3．1-2vntr／myc—hisB重组质粒后,采用Lipofectimine脂质体介导法转染COS-7细胞,用荧光显微镜对荧光表达进行观察,然后用Western blot检测重纽体在细胞内外的表达。结果表明：合成的MUC1-2VNTR基因全长约140bp,所构建的pcDNA3．1-2vntr／myc—hisB重组质粒经双酶切及测序鉴定后,与预期片段大小相符,并含有完整的阅读框架和目的基因。将其转入COS-7细胞后48小时,荧光显微镜和Western blot检测均可证实黏蛋白1表达。结论：成功的构建了多发性骨髓瘤真核表达载体pcDNA3．1—2vntr／myc—hisB,并在COS-7细胞中成功地表达黏蛋白1,这为黏蛋白1的功能研究和多发性骨髓瘤基因疫苗的研制提供了实验基础。     

B7-1与CD40L在淋巴瘤免疫治疗中的协同作用

为了研究B7-1与CD40L共刺激途径在淋巴瘤的免疫治疗中的作用，探讨治疗淋巴瘤疫苗有效的作用方式，将A20淋巴瘤细胞株接种在BALB／C小鼠身上以构建荷瘤小鼠模型，将B7-1与CD40L表达载体单独或联合导入肿瘤内，以PBS和空载体作为对照，观察肿瘤生长的情况；应用肿瘤病理切片和HE染色技术观察肿瘤组织形态及淋巴细胞浸润情况，采用CCK-8试剂盒检测荷瘤小鼠脾CTL杀伤效应。结果显示，瘤内注射B7-1或CD40L表达载体可导致肿瘤生长延缓或体积缩小，两者联合注射较对照组和单独注射组的肿瘤消退效应明显增强。肿瘤形态学观察表明，治疗小鼠肿瘤局部有炎性细胞浸润并伴有大面积的坏死，肿瘤局限化；CCK8试剂盒检测显示小鼠脾CTL杀伤能力增强。结论：B7-1与CD40L疫苗对淋巴瘤具有治疗效应，两者联合治疗的效果优于单一治疗。质粒载体瘤内注射可作为一种安全有效的肿瘤疫苗作用方式。     

呼吸道合胞病毒F蛋白第168～289氨基酸片段的昆虫细胞表达及其抗原性分析

目的 研究人呼吸道合胞病毒(RSV)F基因第546～881碱基编码的融合蛋白(即F蛋白)主要抗原性区域第168～289氨基酸片段的抗原性初步探讨其作为诊断抗原的应用价值.方法 用逆转录(RT)-PCR的方法扩增出RSV Long株F基因546～881 bp片段(F'),将其插入到转移载体质粒pBacPAK9中,获得相应的重组质粒pBacRSV F',与线性杆状病毒BacPAK6 DNA(Bsu36 Ⅰ酶切)共转染Sf9昆虫细胞获得重组病毒BacPAK F',并在昆虫细胞中表达.重组蛋白用Ni2+螫合柱亲和层析纯化,用免疫印迹(Western blot,WB)法检测重组蛋白的抗原活性.并用该方法检测33例急性下呼吸道感染患儿血清特异性抗体,同时用间接免疫荧光法检测患儿的鼻咽分泌物中RSV抗原.对两种方法检测标本的阴性率进行比较.结果 重组病毒BacPAK F'在昆虫细胞中表达相对分子质量约13 000的重组蛋白.纯化后的重组蛋白能与特异性抗RSV抗体结合.WB检测33例急性下呼吸道患儿血清特异性抗体,结果显示阳性11例,阳性率为33.3%,免疫荧光法检测结果阳性9例,阳性率为27.3%,2种检测方法阳性率差异无统计学意义(x2=0.29,P>0.05).结论 纯化后的在昆虫细胞中表达的RSV F基因546～881 bp片段编码的融合蛋白片段具有较强的抗原活性,对RSV感染的快速诊断具有一定的临床应用价值.