重组HIV-1腺病毒载体活疫苗的冻干保护剂研究

目的研制重组HIV-1腺病毒载体活疫苗的冻干保护剂。方法在重组HIV-1腺病毒载体活疫苗中加入不同配比的保护剂,在适宜条件下制备成冻干剂型。根据冻干后外观、病毒滴度和热稳定性试验等结果,筛选出冻干保护剂的最适配方。结果以人血白蛋白、海藻糖、甘露醇、右旋糖苷和蔗糖等成分按比例配伍制备的保护剂,对重组HIV-1腺病毒载体活疫苗显示了较好的保护作用。冻干前后疫苗病毒感染性滴度下降在0.17LogCC ID50/ml以内;37℃放置1周,滴度下降0.3LogCC ID50/ml左右;37℃放置3周后,滴度下降约为0.6LogCC ID50/ml。而无保护剂的液体疫苗对照于37℃放置1周,滴度下降近2.5个LogCC ID50/ml。结论以人血白蛋白、海藻糖、甘露醇、右旋糖苷和蔗糖等配伍而制备的保护剂效果较好。     

脊髓灰质炎病毒冻干保护剂的筛选

目的筛选脊髓灰质炎病毒冻干保护剂。方法将不同配方的冻干保护剂与脊髓灰质炎病毒(SabinⅠ型、SabinⅡ型及中Ⅲ2型)混合,进行冻干,并检测冻干前后病毒感染性滴度及冻干后的热稳定性。结果经检测发现,第Ⅷ组配方(海藻糖8%、人白蛋白1%、山梨醇5%、明胶0·5%和甘氨酸1%)在脊髓灰质炎病毒的冻干过程中保护作用较好。冻干前后感染性滴度下降在0·5LgCCID50/ml以内,且热稳定性好,37℃放置1周后SabinⅠ型、SabinⅡ型及中Ⅲ2型病毒的感染性滴度平均下降分别为0·2、0·3和0·4LgCCID50/ml,而相应对照组的感染性滴度平均下降分别为1·1、1·1和1·3LgCCID50/ml,二者差异有显著意义(P<0·05)。结论含有海藻糖、人白蛋白、山梨醇、明胶和甘氨酸的保护剂对脊髓灰质炎病毒冻干具有良好的保护效果。     

冻干乙型脑炎减毒活疫苗非动物源性稳定剂的配方及其缓冲液的筛选

目的筛选冻干乙型脑炎减毒活疫苗非动物源性稳定剂的配方及其缓冲液。方法分别以0.01 mol/L PBS和Earles液为缓冲液,右旋糖苷-70、蔗糖、山梨醇、乳糖及组氨酸不同组合构成的冻干稳定剂,制备乙型脑炎减毒活疫苗半成品及冻干疫苗成品,观察在不同温度存放不同时间的稳定性,并检测不同配方冻干稳定剂的崩解温度(Tc)。结果 12种配方冻干稳定剂制成的疫苗半成品可在4℃1周内保持滴度稳定性,在25℃3 d内保持滴度无明显变化,3 d后滴度大幅下降;以0.01 mol/L PBS为缓冲液的稳定剂制备的疫苗的Tc值低于Earles液,以Earles液为缓冲液的D2和F2配方制备的冻干疫苗成品,在4℃及37℃放置1周后,滴度均>5.7 logPFU/ml。结论已筛选出以Earles液为缓冲液,含右旋糖苷-70、蔗糖、山梨醇、乳糖及组氨酸的稳定剂配方,用于制备冻干乙型脑炎减毒活疫苗具有良好的保护效果。     

冻干乙脑减毒活疫苗保护剂的筛选

目的　筛选冻干乙脑活疫苗的保护剂。方法　通过优化组合筛选出A、C、D、E、F 5种保护剂配方 ,其中A为现行生产配方作为对照与其他配方进行比较。结果　使用A保护剂的疫苗在 37℃放置 7d和 2 1d ,病毒滴度分别下降 0 .98和 1.6 6LogPFU/ml;使用D、E保护剂的疫苗热稳定性最好 ,在 37℃放置 7d滴度分别下降 0 .19和 0 .0 7LogPFU/ml,2 1d分别下降 0 .42和 0 .39logPFU/ml。结论　D、E保护剂配方为最佳候选配方     

冷冻干燥法制备1型糖尿病噬菌体展示疫苗

目的采用冷冻干燥法制备1型糖尿病噬菌体展示疫苗。方法将正交试验筛选的不同冻干保护剂与1型糖尿病噬菌体展示疫苗混合,优化冻干曲线进行冻干。检测冻干前后噬菌体疫苗的滴度,并通过各项指标对冻干后的疫苗进行评价。结果经筛选,最佳保护剂配方为:10.85%海藻糖+17.37%甘氨酸(w/v);最佳冻干曲线为:S1:-40℃4h,1.5℃/min;S2:-15℃5h,1.5℃/min;S3:25℃4h,1.5℃/min;真空度:0.02mbar。冻干后疫苗滴度下降不超过0.5pfu/ml,外观及电镜观察疫苗样品形态均较好,玻璃态转化温度能达到220℃以上,含水量小于3%。结论以海藻糖、甘氨酸为保护剂,采用冷冻干燥法制备的1型糖尿病噬菌体展示疫苗具有保护剂组成成分少、热稳定性强、含水量低、冻干曲线简化、保存时间长等特点。     

北京株(VZV84-7)水痘病毒在麻疹-腮腺炎-风疹-水痘联合减毒活疫苗中的稳定性

目的观察北京株(VZV84-7)水痘病毒在麻疹-腮腺炎-风疹-水痘(measles-mumps-rubella-varicella,MMRV)联合减毒活疫苗中的稳定性。方法将4批MMRV联合减毒活疫苗成品分别置37℃保存4周、2~8及-15~-20℃保存24个月,采用蚀斑形成单位(plaque forming unit,PFU)试验检测不同时间点疫苗中水痘病毒滴度。将水痘病毒原液于-80℃反复冻融1、2、3次后,分别与麻疹、腮腺炎、风疹各单价疫苗原液按一定比例配制成MMRV联合减毒活疫苗,进行冻干,采用PFU试验分别测定冻干前、冻干后基础水痘病毒滴度及冻干后于37℃热稳定1周的水痘病毒滴度。结果 4批MMRV联合减毒活疫苗成品于37℃保存4周后,水痘病毒滴度下降范围为0.5~0.7 lg PFU/ml;于2~8℃保存24个月,水痘病毒滴定最高达4.6 lg PFU/ml,最低为4.4 lg PFU/ml;于-15~-20℃放置24个月,水痘病毒滴度基本保持不变,均达合格标准(不低于3.6 lg PFU/ml)。水痘病毒原液经1、2、3次冻融后制备的MMRV,通过37℃热稳定1周,水痘病毒滴度分别为4.9~4.6、4.6~4.4、4.5~4.3 lg PFU/ml,均达到合格标准(不低于3.6 lg PFU/ml)。结论北京株(VZV84-7)水痘病毒在MMRV联合减毒活疫苗中稳定性良好。     

喷雾干燥法制备脊髓灰质炎微球减毒活疫苗

目的采用喷雾干燥法制备脊髓灰质炎微球减毒活疫苗。方法以正交试验法筛选最佳保护剂配方及最佳工艺条件,通过样品的得率、含水量、病毒滴度、微球形态、粒径大小分布和热力学性质等特性评价疫苗的稳定性。结果最佳喷雾干燥工艺为:入口风温180℃,入口风压3.9m/s,进样速度2.5ml/min,保护剂配方1.5%海藻糖+0.2%人血白蛋白(HSA)+0.2%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)(w/v)。微球形态完整,分散性好,平均粒径为10.9μm,得率为54.25%,干粉疫苗37℃放置1周和25℃保存6个月,病毒的滴度下降不超过0.5lgCCID50/ml。结论喷雾干燥法制备的脊髓灰质炎微球减毒活疫苗稳定性好,工艺简便,易于工业化生产。     

人胎盘血水解液代替人红细胞水解液用作疫苗保护剂的研究

人胎盘血水解液的一般理化指标、氨基酸组成和含量均与人红细胞水解波接近。用其作为麻疹、风疹和腮腺炎疫苗的保护剂，在疫苗冻干前、冻干后及37℃1周后病毒滴度均能达到规程要求。用于制备麻疹和风疹疫苗共200余批，成品病毒滴度和37℃1周后病毒滴度均优于人红细胞水解液，说明人胎盘血水解液完全可以代替人红细胞水解液作为保护剂用于制备麻疹、风疹和腮腺炎疫苗。     

聚乙二醇-重组人干扰素α2b结合物冻干保护剂的筛选

目的筛选聚乙二醇-重组人干扰素α2b(PEG-rhIFNα2b)结合物的冻干保护剂。方法采用两步筛选法,以氨基酸、甘露醇和糖类作为冻干保护剂,与PEG-rhIFNα2b在适宜条件下制备成冻干制剂,分别于40、25和4℃放置不同时间取样,检测其理化性质和生物学稳定性,筛选最佳保护剂配比。结果通过6～12个月的试验,证实该冻干制剂外观、pH无明显改变,但再溶解速度略慢于以人血白蛋白作保护剂的冻干制剂;采用15mmol/L精氨酸+10mmol/L谷氨酸+4%甘露醇+1%蔗糖/海藻糖的冻干保护剂配方,在4℃和25℃放置12个月后,抗病毒活性仍较好,相当于人血白蛋白的冻干保护效果。结论已筛选出不含人血白蛋白的PEG-rhIFNα2b结合物的冻干保护剂。     

乙脑风疹联合减毒活疫苗病毒间的相容性

目的研究乙脑风疹联合减毒活疫苗中乙脑病毒和风疹病毒的相容性。方法将乙脑病毒SA14-14-2疫苗株制备的乙脑减毒活疫苗原液与风疹病毒RA27/3疫苗株制备的风疹减毒活疫苗原液按体积比1∶1比例混合,加入保护剂,冻干制成乙脑风疹联合减毒活疫苗。采用BHK21细胞蚀斑法测定联合疫苗中的乙脑病毒滴度,细胞病变法检测风疹病毒滴度;通过鉴别试验、热稳定性试验、乙脑疫苗免疫原性试验、安全性试验、异常毒性试验、无菌试验以及基因稳定性分析观察联合疫苗病毒间的相容性。结果联合疫苗的乙脑和风疹病毒滴度与单价疫苗的病毒滴度变化在检测误差的允许范围内;联合疫苗于37℃放置7 d,与放置前相比,风疹病毒和乙脑病毒的滴度值下降分别小于1.0 LgCCID50/ml和1.0 LgPFU/ml,符合《中国药典》三部(2010版)要求;联合疫苗中的风疹疫苗对乙脑疫苗的免疫原性无明显的干扰效应;鉴别试验、安全性试验、异常毒性试验、无菌试验结果均符合《中国药典》三部(2010版)要求;联合疫苗在BHK21细胞上传代5次后,乙脑和风疹病毒基因序列均未发生变化。结论乙脑风疹联合减毒活疫苗中的乙脑和风疹病毒具有较好的相容性,本实验为乙脑风疹联合疫苗的进一步研制奠定了基础。     

无明胶保护剂在麻疹风疹联合减毒活疫苗中的应用

目的研制一种安全有效的无明胶保护剂,并应用于麻疹风疹联合减毒活疫苗的制备。方法制备麻疹风疹联合减毒活疫苗原液,取同一批麻疹病毒原液,分别加入不同成分和配比的无明胶保护剂,制成成品,以含明胶保护剂作对照,检测成品外观、病毒滴度及水分,确定保护剂的成分,再确定保护剂的配比。将麻疹与风疹病毒原液混合,加入筛选出的无明胶保护剂,制备麻疹风疹联合减毒活疫苗(共3批),同时制备3批含明胶保护剂对照疫苗。按《中国药典》三部(2010版)要求对联合疫苗原液、半成品、成品进行检定;分别将制备的联合疫苗于2～8℃放置3和6个月,检测疫苗外观、病毒滴度及水分的变化,于37℃放置1、2、3、4周,检测病毒滴度的变化;按《中国药典》二部(2010版)要求进行过敏试验。结果含海藻糖和右旋糖酐成分的保护剂为首选保护剂。制备的无明胶保护剂联合疫苗原液、半成品及成品的各项检定指标均符合《中国药典》三部(2010版)要求;无明胶保护剂联合疫苗成品于2～8℃放置6个月的水分和病毒滴度及37℃放置4周的病毒滴度与对照组疫苗相比,差异均无统计学意义(P>0.05);注射了无明胶保护剂联合疫苗的豚鼠在试验期内均未发生过敏反应,符合《中国药典》二部(2010版)的要求。结论无明胶保护剂对麻疹和风疹病毒具有较好的保护作用。     

鸡胚细胞制备17D黄热疫苗

目的应用鸡胚细胞制备17D黄热疫苗。方法细胞与病毒同时接种,选择病毒增殖的适宜条件,收获病毒液,加入稳定剂,制备成冻干鸡胚细胞黄热疫苗,并进行鉴别试验、病毒滴定和疫苗保护力试验。结果病毒增殖的最适MOI为0.00046PFU/cell;最适培养温度为37℃;第2天洗换,第4天收获更合适;最适病毒感染细胞数为6.80×105～7.00×105个/ml。病毒感染鸡胚细胞后,滴度可达6.15～6.97LgPFU/ml。疫苗主要指标均达到《中国生物制品规程》(2000版)和WHO对疫苗的要求。免疫小鼠45d后,用卵黄囊疫苗4×103PFU脑内攻击,小鼠全部存活。结论在适宜的条件下,用鸡胚细胞制备17D黄热疫苗,能达到WHO疫苗人用标准。鸡胚细胞有取代鸡胚卵黄囊制备黄热疫苗的可能。     

聚乙烯吡咯烷酮稳定剂风疹减毒活疫苗的研制

目的研制安全有效的不含人血白蛋白稳定剂的风疹减毒活疫苗。方法将风疹减毒活疫苗毒种RA27/3株按适当比例接种单层人二倍体细胞MRC-5株,使用无血清、无蛋白的CDM培养基培养病毒,收获病毒液,加入聚乙烯吡咯烷酮作为病毒稳定剂,制备疫苗原液,加入冻干保护剂,制备5批冻干疫苗,进行各项检定。另取1批原液样品,分别加入聚乙烯吡咯烷酮和人血白蛋白作为病毒稳定剂,制成疫苗,进行各项检测。结果5批疫苗各项指标均符合《中国药典》三部(2005版)要求。同1批原液制备的聚乙烯吡咯烷酮与人血白蛋白稳定剂疫苗的病毒滴度和热稳定性无明显差异。37℃放置6周,两种稳定剂疫苗的病毒滴度均为3.63LgCCID50/ml。结论聚乙烯吡咯烷酮稳定剂风疹减毒活疫苗质量符合《中国药典》三部(2005版)的要求。     

甲型肝炎减毒活疫苗冻干保护剂的研究

目的 研究冻干甲型肝炎减毒活疫苗的保护剂。方法 甲型肝炎病毒L-A-l株经2BX二倍体细胞培养,制备成甲型肝炎减毒活疫苗,再添加不同保护剂进行冷冻干燥。结果 以山梨醇、蔗糖、脂肪酸盐等为主的保护剂,对甲型肝炎减毒活苗病毒显示了较好的保护性,疫苗冻干前后感染滴度下降在1.0Log CCID50/ml以内,符合《中国生物制品规程》要求。结论 以山梨醇、蔗糖、脂肪酸盐等为主的保护剂是一种安全性较高、疫苗冻干效果较好,适合于疫苗规模化生产的保护剂。     

喷雾干燥法制备1型糖尿病反义肽噬菌体壳聚糖微球疫苗

目的制备1型糖尿病反义肽噬菌体壳聚糖微球疫苗,并观察其热稳定性。方法采用水溶性壳聚糖、海藻糖、甘氨酸作为保护剂,通过喷雾干燥技术制备1型糖尿病反义肽噬菌体壳聚糖微球疫苗,扫描电镜下观察其形态及粒径大小,并检测入口温度及海藻糖浓度对壳聚糖微球疫苗活性的影响。将喷雾干燥样品置37℃放置6d,检测其热稳定性。结果通过喷雾干燥法制备的1型糖尿病反义肽噬菌体壳聚糖微球疫苗电镜下呈不规则的球形,粒径大小为20μm左右。喷雾干燥后样品的滴度与喷雾干燥前的疫苗原液相比均降低,且随着入口温度的升高而先升高后降低;喷雾干燥后的样品随着海藻糖浓度的增加,滴度也相应升高。与喷雾干燥前的疫苗原液相比,壳聚糖微球疫苗具有更好的热稳定性。结论已成功制备了1型糖尿病反义肽噬菌体壳聚糖微球疫苗,其具有良好的热稳定性。