杜氏利什曼原虫DNA探针及其在流行病学和诊断中的应用

描述了杜氏利什曼原虫的一种特异而敏感的DNA探针的制备、序列分析及在诊断中的应用。从体外培养的杜氏利什曼原虫HU3株前鞭毛体提取DNA和RNA。取后循环前鞭毛体的poly(A)~+RNA用RNase H法在λgt10中构建cDNA库,经源于HU3株对数生长期和后循环期前鞭毛体的标记cDNA     

杜氏利什曼原虫无鞭毛体表达抗原的Western blot和MALDI-TOF/TOF分析

目的鉴定杜氏利什曼原虫无鞭毛体特异表达抗原。方法培养杜氏利什曼原虫前鞭毛体并体外转化无鞭毛体,其总蛋白经2-DE电泳后以小鼠抗杜氏利什曼原虫无鞭毛体血清进行Western blot,对前鞭毛体与无鞭毛体特异表达抗原蛋白进行MALDI-TOF/TOF串联质谱鉴定。重组表达无鞭毛体特异表达抗原编码基因,以Western blot法对重组蛋白进行鉴定。结果等量的杜氏利什曼原虫前鞭毛体与无鞭毛体蛋白经2-DE电泳均可呈现680~742个蛋白点,Western blot及MALDI-TOF/TOF-MS分析甘油醛3-磷酸脱氢酶与延伸因子2为杜氏利什曼原虫前鞭毛体特异表达抗原,核苷二磷酸激酶为无鞭毛体特异表达抗原。重组核苷二磷酸激酶编码基因表达产物经Western blot证实为杜氏利什曼原虫无鞭毛体特异表达强抗原。结论杜氏利什曼原虫前鞭毛体与无鞭毛体抗原表达存在差异,核苷二磷酸激酶为杜氏利什曼原虫无鞭毛体特异表达强抗原。     

杜氏利什曼原虫动基体DNA种林特异片段的克隆

作者在质粒pUC18中克隆了限制性内切酶AIuI消化的Leishmania donovani四川人分离株kDNA片段,筛选后获得能区别杜氏利什曼原虫山丘疫区分离株和平原疫区分离株的的克隆pLK1-10和对杜氏利什曼原虫四川人分离株特异的克隆pLK1-14,对杜氏利什曼原虫种特异的克隆PLK1-1、pLK1-2等。这些克隆将是鉴定杜氏利什曼原虫,区别鉴定山丘及平原疫区黑热病病原体较好的探针。     

在肯尼亚杜氏利什曼原虫引起的人皮肤利什曼病

在肯尼亚证实有4种利什曼原虫对人致病,引起皮肤利什曼病的有埃塞俄比亚利什曼原虫、大型利什曼原虫和热带利什曼原虫,内脏利什曼病或黑热病则由杜氏利什曼原虫引起。内脏利什曼病在农村有活动性疫点,最近又有一新疫点发生。在研究利什曼病皮肤损害的诊断时,发现一病人的皮肤损害是由杜氏利什曼原虫所引起,而通常这种原虫常罹及内脏器官。本文报导此病例的临床表现,用同工酶和DNA对原虫的鉴定结果。     

杜氏利什曼原虫病的研究进展

杜氏利什曼原虫是一种专营寄生生活的单细胞低等真核生物,其生活史包括寄生于媒介昆虫白蛉消化道内的前鞭毛体期和寄生于脊椎动物单核吞噬细胞内的无鞭毛体期,能引起严重危害人类健康的内脏利什曼病.我国虽在大部分地区已基本控制或消灭,但新的疫区仍不断出现,控制和消灭黑热病的目标正面临挑战.了解杜氏利什曼原虫病的相关研究,对杜氏利什曼原虫的快速鉴定、杜氏利什曼病的早期诊断及防治极为重要.本文谨对杜氏利什曼原虫病的现状及进展作一综述.     

杜氏利什曼原虫在负鼠体内的情况

寻找抗利什曼病药物,一般选用啮齿类作为实验动物,但亦需研究非啮齿类哺乳动物对杜氏利什曼原虫的敏感性。本文作者在研究中发现负鼠(Didelphis marsupialis)对杜氏利什曼原虫很敏感。用在实验室内繁殖的一岁龄雌雄负鼠各一只,体重分别为2.29     

河南省1例输入性内脏利什曼病的实验室诊断

目的　分析河南省1例输入性内脏利什曼病病例,探讨内脏利什曼病的实验室诊断方法。方法　分析患者的流行病学资料和临床资料,镜检观察骨髓涂片中杜氏利什曼原虫无鞭毛体;rK39试纸条检测血清中利什曼原虫抗体;用两对引物K13A?K13B和 LITSR?L5.8S分别扩增利什曼原虫动基体DNA和核糖体DNA内转录间隔区基因片段。结果　 该患者曾去过内脏利什曼病流行区,有不规则发热、脾肿大、全血细胞减少、白蛋白/球蛋白比例倒置等症状,骨髓涂片查见杜氏利什曼原虫无鞭毛体,rK39试纸条检测阳性,两对引物K13A?K13B和 LITSR?L5.8S分别扩增出87 bp和285 bp的片段。两片段序列与杜氏利什曼原虫相应序列的相似性分别为94%和100%。结论　结合患者的流行病学资料和临床表现以及实验室检测结果,确诊该病例为内脏利什曼病病例,病原体为杜氏利什曼原虫。     

用纯化的杜氏利什曼原虫蛋白快速诊断内脏利什曼病

诊断内脏利什曼病通常采用骨髓或脾脏活组织检查法,病人十分痛苦,而一些血清学方法如直接凝集法、IFA、ELISA和RIA等虽敏感,但反应较慢。鉴于此,本文作者应用纯化的杜氏利什曼原虫蛋白发展了一种直接斑点印渍方法用以诊断内脏利什曼病。     

河南省1例输入性内脏利什曼病的实验室诊断

目的　分析河南省1例输入性内脏利什曼病病例，探讨内脏利什曼病的实验室诊断方法。方法　分析患者的流行病学资料和临床资料，镜检观察骨髓涂片中杜氏利什曼原虫无鞭毛体；rK39试纸条检测血清中利什曼原虫抗体；用两对引物K13A?K13B和 LITSR?L5.8S分别扩增利什曼原虫动基体DNA和核糖体DNA内转录间隔区基因片段。结果　 该患者曾去过内脏利什曼病流行区，有不规则发热、脾肿大、全血细胞减少、白蛋白/球蛋白比例倒置等症状，骨髓涂片查见杜氏利什曼原虫无鞭毛体，rK39试纸条检测阳性，两对引物K13A?K13B和 LITSR?L5.8S分别扩增出87 bp和285 bp的片段。两片段序列与杜氏利什曼原虫相应序列的相似性分别为94%和100%。结论　结合患者的流行病学资料和临床表现以及实验室检测结果，确诊该病例为内脏利什曼病病例，病原体为杜氏利什曼原虫。     

用非放射性标记杜氏利什曼原虫全虫DNA探针筛选自然感染的白蛉

印度比哈尔邦内脏利什曼病十分流行。传统的解剖白蛉调查自然感染方法,效率低且无法检测轻度感染的白蛉。分子生物学技术为此提供了快捷、特异的方法。本文讨论了非放射性地高辛标记的杜氏利什曼原虫全虫DNA探针检测白蛉感染利什曼原虫的情况。     

杜氏利什曼原虫激活蛋白激酶C受体的基因克隆化与序列分析

目的　克隆杜氏利什曼原虫 (LeishmaniadonovaniLd) 1S株激活蛋白激酶C受体 (RACK ,receptorofactivatedpro teinCkinase)的编码基因 ,为应用这种编码T细胞抗原的基因进行基因疫苗的研究奠定基础。方法　体外培养杜氏利什曼原虫 1S株无鞭毛体 ,常规方法提取制备基因组DNA。以硕大利什曼原虫 (Leishmaniaamjor)的RACK基因的核苷酸序列为参照 ,设计并合成利什曼原虫RACK基因序列特异性的引物。以杜氏利什曼原虫的基因组DNA为模板 ,利用多聚酶链反应(PCR)技术 ,扩增获得了杜氏利什曼原虫RACK的全长编码基因。结果　基因序列测定结果表明 ,杜氏利什曼原虫 1S株RACK基因序列长度为 981bp ,开放读码框架由 831bp组成 ,编码产物为 2 76个氨基酸残基。获得的杜氏利什曼原虫 1S株的RACK基因与来源于硕大利什曼原虫的RACK基因序列同源性达 98% (2 6 4 / 2 6 7)。结论　本研究克隆了杜氏利什曼原虫的RACK基因 ,为应用诱导T细胞免疫应答抗原的编码基因进行杜氏利什曼原虫的基因疫苗研究奠定了基础     

用利什曼原虫感染白蛉的一种简易方法

以往对白蛉人工感染利什曼原虫均采用白蛉叮咬感染动物或病人皮肤损害处的方法,这种方法既不简便又昂贵,为此作者建立了一种快速而简便的新技术:将在37℃下连续培养的小鼠巨噬细胞接种不同种的利什曼原虫前鞭毛期。实验用的虫种为热带利什曼原虫、杜氏利什曼原虫、巴西利什曼原虫巴拿马亚种、墨西哥利什曼原虫亚马逊亚种、墨西哥利什曼原虫墨西哥亚种以及恰加斯利什曼原虫等。媒介昆虫白蛉为静食白蛉与长须白蛉。     

无症状的内脏利什曼病

以色列及其附近地区是内脏利什曼病的流行区;皮肤利什曼病主要是在其南半部,而内脏利什曼病则存在于加利利地区,用ELISA对加利利东部地区的犬进行利什曼病调查,阳性率为5％;自犬分离的原虫属杜氏利什曼原虫。1991年自加利利西部一病犬分离的原虫经鉴定亦为杜氏利什曼原虫。     

新疆利什曼原虫同工酶谱的初步研究：Ⅰ.酶谱型的分布

用５种酶ＭＥ，ＧＰＩ，Ｇ６ＰＤＨ，ＭＤＨ，ＥＳＴ的聚丙烯酰胺凝胶电泳法对新疆不同来源分离的５株利什曼原虫进行了同工酶谱的比较研究。所分析的虫株包括１株杜氏利什曼原虫，２株婴儿利什曼原虫，２株都兰利什曼原虫以及作为参比虫株的杜氏利什曼原虫（ＭＨＯＭ／ＩＮ／８０／ＤＤ８），硕大利什曼原虫（ＭＨＯＭ／ＩＱ／００／ＬＨ３２），沙鼠利什曼原虫（ＲＨＯ／ＣＮ／６２／＃ｌ）和蜥蜴利什曼原虫各１株，共分出９个酶谱型。表明不同来源的２株婴儿利什曼原虫是两个不同的酶谱型，２株都兰利什曼原虫为两个不同的酶谱型，新疆的杜氏利什曼原虫与来源于印度的杜氏利什曼原虫标准株也为两个不同的酶谱型。     

杜氏利什曼原虫蛋白磷酸酶-2C的基因克隆化与序列分析

目的　克隆杜氏利什曼原虫 (Leishmaniadonovani,Ld) 1S株蛋白磷酸酶 2C(PP2C)的编码基因 ,为应用这种编码T细胞抗原的基因进行基因疫苗研究奠定基础。方法　体外培养杜氏利什曼原虫 1S株无鞭毛体 ,常规方法从虫体提取制备基因组DNA。以夏科氏利什曼原虫 (Leishmaniachagasi,Lc)的PP2C基因序列为参照 ,设计并合成利什曼原虫PP2C基因序列特异性的引物。结果　以杜氏利什曼原虫的基因组为模板 ,利用多聚酶链反应 (PCR)技术 ,扩增获得了杜氏利什曼原虫PP2C的全长编码基因。基因序列测定结果表明 ,杜氏利什曼原虫 1S株PP2C基因序列长度为 1317bp ,开放读码框架由 12 2 1bp组成 ,编码产物为 40 6个氨基酸残基。获得的杜氏利什曼原虫 1S株的PP2C基因与来源于夏科氏利什曼原虫的PP2C氨基酸残基序列的同源性为 95 % (387/ 40 6 )。结论　本研究克隆了杜氏利什曼原虫的PP2C基因 ,为应用诱导T细胞免疫应答抗原的编码基因进行杜氏利什曼原虫的基因疫苗研究奠定了基础     

我国不同地区的杜氏利什曼原虫对亚历山大白蛉感染性的观察

用白蛉人工感染利什曼原虫的方法,观察从新疆荒漠、甘肃山区及河南平原三地自人体成蛉体分离出来的杜氏利什曼原虫对新疆亚历山大白蛉的感染性。以白蛉的感染率、感染程度以及原虫在白蛉消化道内的进展等项指标,来衡量原虫对白蛉的适应性。结果发现,新疆荒漠的原虫对亚历山大白蛉有高度的感染性,甘肃的原虫居次,河南的原虫对白蛉的感染性很差。结合以往用单克隆抗体检测法和K-DNA杂交法对我国一些地区杜氏利什曼原虫的研究,以及我国荒漠、山区和平原地区的黑热病具有不同的流行病学特征等的结果分析,认为我国的杜氏利什曼原虫很可能存在不同的地域株。     

黑热病患者脾、血样本中利什曼原虫动基体DNA的快速敏感检测

本文报道用PCR快速检测黑热病患者脾穿刺物、血液中利什曼原虫动基体DNA(kDNA)的方法和结果。利什曼原虫的kDNA部分呈微环状,杜氏利什曼原虫的微环长度约为800bp,每个原虫约合一万个这种微环。引物的合成:用PstⅠ酶将杜氏利什曼原虫北京分离株全长微环线性化并克隆进质粒pUC8的PstⅠ酶切位点,再将这种微环亚克隆进M13mp10中进行序列分析。根     

在醋酸纤维素薄膜上进行对流免疫电泳诊断人和犬的内脏利什曼病

用杜氏利什曼原虫鞭毛体抗原进行琼脂内的免疫沉淀反应,即免疫扩散及免疫电泳试验,因费用很贵,抗原用量多,而且反应时间长,所以不适用于大规模诊断。为了纠正这些缺点,作者采用醋酸纤维素薄膜对流免疫电泳方法以诊断内脏利什曼病。杜氏利什曼抗原依照作者早先发表的方法提取。电泳时所用缓冲液为pH9.2的巴比妥-Tris缓冲液,或pH8.2的巴比妥钠-盐酸缓冲液。此法特异性强,35例骨髓涂片中查见原虫的患     

杜氏利什曼原虫特异性kDNA片段扩增及用于内脏利什曼病诊断的研究

本文报道了用杜氏利什曼原虫特异的一对寡核苷酸引物Ⅰ和Ⅱ进行PCR,扩增微环kDNA分子上一种特异性kDNA片段,进行杜氏利什曼原虫虫种鉴定和病原体检测。敏感性分析表明用此法能够检测到的最低模板DNA需要量为1fg,检测健康犬全血稀释的利什曼原虫前鞭毛体,最低可达2个/ml。扩增六种不同的利什曼原虫kDNA样品,在L.donovani四川人株、四川犬株和L.infantum出现阳性产物,其长度和设计扩增长度一致,扩增产物和地高辛标记的重组质粒探针pLK2斑点杂交结果表明为利什曼原虫kDNA序列。应用此对引物,检测8份内脏利什曼病患者骨髓样品和4份血清样品,经琼脂糖凝胶电泳,Southern杂交证实,分别有7例和2例阳性,显示出可喜的应用前景。     

重组杜氏利什曼原虫39kD抗原的诊断价值

为了给内脏利什曼病患者提供较为准确的实验诊断方法。我们将表达杜氏利什曼原虫３９ｋＤ抗原的大肠杆菌制备物进行电泳并转移至硝酸纤维滤膜上，以１１例确诊ＶＬ病人的不同稀释度血清对其识别，当稀释度达１：４００时，全部病人血清均能明显识别３９ｋＤ抗原带，而正常人血清和其他病人血清不识别３９ｋＤ抗原带，说明重组杜氏利什曼原虫３９ｋＤ抗原具有一定的诊断价值，用其检测病人血清中相应抗体可以诊断内脏利什曼病。