人CTLA-4胞外区cDNA的克隆及Ig融合蛋白表达载体的构建

目的 克隆人ＣＬＴＡ－４胞外区ｃＤＮＡ－４胞外区与人免疫球蛋白ＩｇＧ Ｆｅ融合蛋白表达载体,为研究ＣＴＬＡ－４／Ｉｇ融合蛋白及其临床应用奠定基础。方法 从抗人ＣＤ３单克隆抗体和ＰＭＡ活化的健康人中国外周血淋巴细胞总ＲＮＡ中,扩增人ＣＴＬＡ－４基因胞外区ｃＤＮＡ片段,经ＨｉｎｄⅢ＋ＢｃｌⅠ双酶切后定向插入Ｉｇ融合蛋白表达载体。结果 从活化人Ｔ细胞中扩增出人ＣＴＬＡ－４胞外区ｃＤＮＡ片段,并将其正确插     

人淋巴霉素cDNA克隆及顺序分析

目的：克隆人淋巴毒素ｃＤＮＡ并测序。方法：采用ＲＴ－ＰＣＲ技术，从ＰＨＡ／ＰＭＡ活化的Ｔ细胞系Ｊｕｒｋａｔ细胞总ＲＮＡ中扩增入淋巴毒素ｃＤＮＡ并定向克隆于ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１９质粒载体Ｓａｎｇｅｒ双脱氧链终止法测序，结果：ＲＴ－ＰＣＲ扩增出一个５４１ｂｐ的ＤＮＡ片段，限制性内切酶图谱分析和测序结果显示。该５４１ｂｐ片段为编码人淋巴毒素成熟肽的ｃＤＮＡ，与公布的人淋巴毒素ｃＤＮＡ序列完全一致，结论；     

人抗乙肝表面抗原抗体Fab片段/αA-干扰素融合蛋白原核表达载体的构建

目的：为深入开展乙型肝炎的生物导向治疗，我们构建了人抗乙肝表面抗原（ＨＢｓＡｇ）抗体Ｆａｂ片段／αＡ－干扰素（ＩＦＮ－αＡ）融合蛋白原核表达载体ｐＨＳ／ＩＦＮ－α。方法：采用ＰＣＲ方法，将ＩＦＮ－αＡＤＮＡ两端引入酶切位点及５端引入－Ｌｉｎｋｅｒ，重组入抗ＨＢｓＡｇ抗体Ｆａｂ表达载体ｐＨＳ相应酶切位点，酶切鉴定并筛选出阳性克隆ｐＨＳ／ＩＦＮ－αＡ，并对插入基因片段测序。结果：重组阳性克隆经酶切鉴定证实重组片段已正确插入载体相应酶位点，片段与ＰＣＲ扩增片段大小相同，硷基序列正确。结论：ｐＨＳ／ＩＦＮ－αＡ的成功构建，为人抗ＨＢｓＡｇ抗体Ｆａｂ片段／αＡ－干扰素融合蛋白在大肠杆菌的表达打下基础     

人抗惭肝表面抗原抗体Fab片段／αA—干扰素融合蛋白原核表达 …

目的：为深入开展乙型肝炎的生物导向治疗。我们构建了人抗乙肝表面抗原（ＨＢｓＡｇ）抗体Ｆａｂ片段／αＡ－干扰素（ＩＦＮ－αＡ）融合蛋白核表达载体ｐＨＳ／ＩＦＮ－α，方法：采用ＰＣＲ方法，将ＩＦＮ－αＡＤＮＡ两端引入酶切位点及５；引入－Ｌｉｎｋｅｒ，重组入抗ＨＢｓＡＧ抗体Ｆａｂ表达载体ＰＨＳ相应酶切位点，酶切鉴定并筛选出阳性克隆ＰＨＳ／ＩＦＮ－α，并对插入基因片段测序。结果：重组阳性克隆经酶切鉴定证实     

人神经营养素-4的克隆及其在原核细胞的表达

目的：体外扩增人神经营养素－４（ＮＴ－４）基因,经克隆后在原核细胞中表达并鉴定人重组ＮＴ－４,为研究其生物学特性及临床应用奠定基础。方法：以人类基因组ＤＮＡ为模板,扩增ＮＴ－４成熟活性蛋白ＤＮＡ编码序列,将此ＤＮＡ片段克隆到载体ＰＢＶ２２０中,对重组质粒进行ＰＣＲ筛选和限制性酶切分析,确定后将该重组质粒转化到大肠杆菌ＤＨ５α进行诱导表达。用抗ＮＴ－４抗体进行Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定重组蛋白。结果：体外成功扩增ＮＴ－４基因,转染的大肠杆菌经诱导后表达出能被抗ＮＴ－４抗体识别的重组蛋白,其表达量为１５％。结论：在原核细胞能成功表达ＮＴ－４。     

人淋巴毒素cDNA克隆及顺序分析

目的：克隆人淋巴毒素ｃＤＮＡ并测序。方法：采用ＲＴ－ＰＣＲ技术，从ＰＨＡ／ＰＭＡ活化的人Ｔ细胞系Ｊｕｒｋａｔ细胞总ＲＮＡ中扩增人淋巴毒素ｃＤＮＡ，并定向克隆于ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９质粒载体，Ｓａｎｇｅｒ双脱氧链终止法测序。结果：ＲＴ－ＰＣＲ扩增出一个５４１ｂｐ的ＤＮＡ片段，限制性内切酶图谱分析和测序结果显示，该５４１ｂｐ片段为编码人淋巴毒素成熟肽的ｃＤＮＡ，与公布的人淋巴毒素ｃＤＮＡ序列完全一致。结论：本实验成功地克隆了人淋巴毒素ｃＤＮＡ，为在大肠杆菌表达人淋巴毒素并进一步研究其功能，以及淋巴毒素的开发与临床应用奠定了基础。     

NADH—细胞色素b5还原酶基因Arg57Gln／Cys203Tyr复合杂合？…

调查中国人遗传性高铁血红蛋白血病患ＮＡＤＨ－细胞色素ｂ５还原酶基因突变情况。方法采用逆转录－聚合酶链反应产物直接测序法,分析ＲＣＭ患ｂ５Ｒ基因的ｃＤＮＡ全部编码序列;ＰＣＲ结合限制内切酶ＭｓｐⅠ和ＲｓａⅠ酶切分析患及其母亲的ｂ５Ｒ基因组ＤＮＡ扩增片段。     

人脑胶质细胞来源神经营养因子基因的克隆及测序

为研究人脑胶质细胞来源的神经营养因子（ｇｌｉａｌｃｅｌｌｌｉｎｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ, ＧＤＮＦ） 在神经系统疾病中的作用,根据ＧＤＮＦ 的ｃＤＮＡ 序列设计并合成引物,以流产胎儿脑组织为来源,分别提取ＲＮＡ 和基因组ＤＮＡ 作模板,经ＲＴ ＰＣＲ 和ＰＣＲ 技术扩增人ＧＤＮＦ 基因片段,采用ＤＮＡ 重组技术将其克隆于ｐＧＥＭ Ｔ Ｅａｓｙ 载体中并测序。结果：ＲＮＡ 和基因组ＤＮＡ 体外扩增得到的片段均是４１０ ｂｐ ,两者无差异。ＰＧＥＭ ＧＤＮＦ 经酶切鉴定正确,测序结果与Ｇｅｎｅｂａｎｋ 比较基本相同。由于ＲＮＡ 和基因组ＤＮＡ 扩增得到的片段大小相同,证实该基因片段内无内含子插入,该片段可用于真核及原核表达。     

人GDNF基因的克隆

克隆可表达人胶质细胞源性神经营养因子的基因。方法；从脑胶质细胞瘤患术后的脑瘤组织中提取总ＲＮＡ，以ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增出了一般约５５８ｂｐ的ｃＤＮＡ片段，将这一片段克隆于ｐＵＣ１８载体中，进行全序列分析。结果：证实该研究所克隆的ｃＤＮＡ是编码正确的ＧＤＮＦ基因。     

小鼠耳蜗组织NT3基因的克隆及其原核表达鉴定

目的：克隆小鼠耳蜗组织中重要神经营养因子NT3的基因,并对其进行原核表达鉴定,为进一步研究该基因对内耳听觉功能的影响以及对耳聋的基因治疗提供基础。方法：根据所设计的引物用RT－PCR方法扩增目的基因,克隆人pUC19载体,行酶切鉴定和测序;然后进一步克隆人原核表达载体pDH,温度诱导表达,SDS－PAGE检测表达产物。结果：RT－PCR得到长度为777bp的基因片段,克隆后酶切鉴定正确,测序结果经BLAST对比,与GenBank中小鼠NT－3序列完全一致。成功构建了原核表达载体,经温度诱导表达出NT3蛋白。结论：从耳蜗组织中能获得正确的NT3基因克隆以及稳定的原核表达,为后续实验提供了保证。     

人野生型抑癌基因PTEN/MMAC1的巢式PCR法克隆、测序及表达载体的构建

目的 :克隆人野生型抑癌基因 PTEN/MMAC1 c DNA序列并构建其表达载体。方法 :利用RT- nested PCR法从正常人胎盘组织中扩增出约 1 2 0 0 bp的 DNA片段 ,与 p UCm- T载体连接 ,作全自动测序确证 ,并将其重组入 pc DNA 3.1载体中 ,构建为表达质粒 pc DNA- w P。结果 :对 PCR产物进行测序 ,序列基本正确。结论 :利用 RT- nested PCR法成功克隆了人野生型抑癌基因 PTEN/MMAC1c DNA序列并构建了表达质粒 pc DNA- w P。     

Cloning of NHE-1 gene fragment from human lung can.cer cells and construction of its antisense expression vector

Objective: To clone the partial sequence of Na^ /H^ exchanger- 1 (NHE- 1) gene of human lung cancer cells and insert it reversely into the multiclone site of pLXSN in order to construct an antisense expression vector for tumor gene therapy it~ vivo. Methods: With use of the upstream and downstream primers containing Barn H I and EcoR I in their 5‘ ends respectively, a partial sequence of the first exon of NHE-1 gene was cloned in a length of 454 bp from genomic DNA of human lung cancer cell A549 with PCR method. The product was then direetionally and reversely insert into the multiclone site of pLXSN. Finally, the constructed recombinant was identified with agarose gel electrophoresis and DNA sequencing. Results: The cloned fragment was 461 bp in length and successfully ligated to pLXSN with the identification by agarose gel etectrophoresis. DNA sequencing confirmed that the fragment cloned and inserted into the vector was identical with the targeted one. Conclusion: The targeted fragment is successfully cloned and reversely inserted into pLXSN in our experiment. The antisense expression vector of NHE-1, pNHE-1, was constructed successfully.     

鼻咽癌患者血浆EB病毒DNA荧光定量PCR标准品的构建

目的: 构建检测鼻咽癌患者血浆EB病毒(人疱疹病毒4型)DNA的荧光定量PCR标准品。方法: 用EB病毒基因高度保守序列设计特异的引物和荧光探针,常规PCR法扩增目的片段,将纯化的PCR产物与PMD-18T载体进行连接,转化宿主菌DH-5α,然后用PCR初筛和测序分析证实目的片段克隆成功,提取重组质粒DNA,纯化质粒并检测260 nm吸光度,确定重组质粒拷贝浓度,并以此制备荧光定量PCR梯度浓度标准品。结果: PCR初筛及测序分析均证实EB病毒DNA重组到PMD-18T载体上。结论: 本试验成功克隆EB病毒DNA荧光定量PCR标准品。     

人肺癌细胞NHE-1基因部分正调控序列的克隆

目的 克隆人肺癌细胞Na∧ /H∧ 交换泵-1（NHE-1）基因上游正调控序列部分,为进一步将该片段导入肺癌细胞株,竞争性结合转录因子,达到抑制细胞内NHE-1基因的表达奠定基础。方法 采用PCR技术从人肺癌A549细胞基因组中扩增长约170bp的NHE-1基因调控序列中起正调控作用的片段。在上、下游引物的5′-端带上BanHI和EcoRI酶切位点。然后将该片段连接到pUC18载体上,最后对产生的重组子进行酶切、PCR和测序鉴定。结果 经酶切及PCR鉴定,所克隆的目的片段大约为180bp,而NDA测序证实克隆并插入到载体中的片段为目的的片段,长度为168bp,与报道的序列比较缺失2个t。结论 本实验已成功地克隆了人肺癌细胞NHE-1基因调控序列中正调控序列片段。     

人骨形态发生蛋白12前体蛋白cDNA的克隆及序列分析

目的 克隆人骨形态发生蛋白12前体蛋白的基因。方法 根据Genbank人骨形态发生蛋白12的基因序列合成两条引物，从人胎盘组织中提取总RNA，用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增出长920bp编码人骨形态发生蛋白12(BMP12)前体蛋白的基因序列。将所得的基因片段插人载体pTARCET^TM质粒中并转化大肠杆菌JM109，提取重组质粒进行鉴定并测序。结果 RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳显示一长约920bp的条带．阳性克隆质粒经PCR扩增出约920bp的片段，全自动DNA测序结果表明和Genbank中的序列完全相符。结论 通过RT-PCR可从人胎盘组织中成功地克隆出人pMP12前体蛋白基因，基因序列完全正确。     

胎盘HBV-DNA定量检测与宫内感染关系的研究

目的 探讨胎盘HBV—DNA含量与官内感染的关系及作为胎盘传染性和病毒复制的直接指标的可靠性。方法 采用FQ～PCR（荧光探针定量聚合酶链反应）检测344例HBV标志物阳性孕妇足月分娩后的胎盘的HBV—DNA含量，并分别检测同一孕妇分娩前的外周血及脐血的HBV—DNA含量，比较其测定值范围及相互关系。结果 344例孕妇按乙肝标志物组合，分为三组，分别检测分娩前外周血HBV—DNA、胎盘HBV—DNA及脐血HBV—DNA，检出率分别为：（1）HbsAg携带组90例，22．2％（20／90）、33．3％（30／90）和5．6％（5／90）；（2）大三阳组134例，70．9％（95／134）、85．8％（115／134）和11．9％（16／134）；（3）小三阳组120例，20.8％（25／120）、20．8％（25／120）和3．3％（4／120）。孕妇乙肝标志物阳性以大三阳组HBV—DNA阳性率最高，胎盘组织HBV—DNA含量与母血HBV—DNA含量有一致性和相关性。结论 外周血HBV—DNA阳性孕妇更易发生胎盘感染。官内感染的程度可随胎盘组织HBV—DNA含量增加而程度加重。胎盘HBV—DNA含量可作为一个宫内感染的判断指标。     

膜联蛋白A5 cDNA的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的:克隆人膜联蛋白A5 cDNA并在大肠杆菌系统内作表达.方法:利用RT-PCR技术从人胎盘组织的总RNA扩增膜联蛋白A5的cDNA序列,将该基因插入GST融合表达载体pGEX-5T,在tac 启动子控制下,IPTG诱导表达GST融合蛋白.以亲合层析法纯化表达的融合蛋白,用KPTT法验证抗凝血活性.结果:凝胶电泳显示PCR扩增产物的长度为978 bp,重组质粒测序结果表明,插入片段与人膜联蛋白A5的序列完全一致.在IPTG诱导下,K802重组菌高效表达出相对分子质量为58 000的融合蛋白,表达量占菌体总蛋白的26%.纯化蛋白具有很强的抗凝血活性.结论:成功克隆人膜联蛋白A5基因并在大肠杆菌中高效表达.     

人骨形态发生蛋白12前体蛋白cDNA的克隆及序列分析

目的克隆人骨形态发生蛋白12前体蛋白的基因。方法根据Genbank人骨形态发生蛋白12的基因序列合成两条引物,从人胎盘组织中提取总RNA,用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增出长920 bp编码人骨形态发生蛋白12(BMP12)前体蛋白的基因序列。将所得的基因片段插入载体pTARGETTM质粒中并转化大肠杆菌JM109,提取重组质粒进行鉴定并测序。结果RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳显示一长约920 bp的条带,阳性克隆质粒经PCR扩增出约920 bp的片段,全自动DNA测序结果表明和Genbank中的序列完全相符。结论通过RT-PCR可从人胎盘组织中成功地克隆出人BMP12前体蛋白基因,基因序列完全正确。     

人肌肉组织中GLUT4 cDNA的克隆及测序

目的：通过RT-PCR，以特异引物，从人新鲜手术肌肉组织获得人葡萄糖转运子4(GLUT4)cDNA基因，并体外克隆入测序载体，获得具有正确序列的目的基因．方法：经GeneBank在线检索，确定人GLUT4 cDNA基因特异引物，采用反转录聚合酶链方法从1例人手术新鲜腹部肌肉组织RNA模板中，获得人GLUT4表达片段cDNA的基因，经克隆入测序载体pGEM-3zf(-)，自动测序，验证cDNA大小及序列．结果：以我们设计的特异引物，从人肌肉组织模板中能得到预期大小的人GLUT4 cDNA基因RT-PCR产物，并能插入预定的克隆载体中测序，所得基因的序列符合目的基因的序列．结论：从人肌肉组织中能获得具有正确序列、含完整起始及终止密码的人GLUT4 cDNA基因。     

人类抗砷相关基因（hARRG）的克隆和表达

克隆并表达人类抗砷基因ｈｕｍａｎ ａｒｓｅｎｉｔｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ（ｈＡＲＲＧ）。方法。从人胎脑中获得ｍＲＮＡ,建立ｃＤＮＡ文库,通过大规模测序克隆出一人类新基因。结果：该基因全长１１７０ｂｐ,读框为（ＯＲＦ）７２３ｂｐ,经序列分析,与中国仓鼠抗砷基因ａｒｓｅｎｔｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ（ａｓｒ２）同源性达８８％。根据ＯＲＦ上物,ＰＣＲ扩增,扩增产物酶切后