固定化米曲霉氨基酰化酶反应动力学及其连续拆分DL-蛋氨酸实验

探讨了用明胶－戊二醛固定化米曲霉菌球氨基酰化酶反应动力学,对固定化菌体连续光学拆分DL－蛋氨酸进行了研究。当底物浓度小于200mmol/L时,没有底物抑制现象,此时拆分反应速度符合Michaelis-Menten方程。在37℃时,米氏常数和最大反应速率分别为11.9mmol/L和1.3mmol/L。在连续拆分反应中反应物体积流量为7.5ml/h,底物浓度为200和400mmol/L时,L－蛋氨酸的转化率分别为93％和78％。随体积流量的增加,L－蛋氨酸转化率降低。固定化菌体的操作半衰期为82d。     

米曲霉氨基酰化酶拆分DL茶氨酸

DL-茶氨酸经乙酰化可生成N-乙酰-DL-茶氨酸，然后利用米曲霉氨基酰化酶拆分N-乙酰-DL-茶氨酸可以获得L-茶氨酸。本文对氨基酰化酶酶促反应也进行了初步研究，考察了反应温度、反应时间、pH值和底物浓度等因素对酶促反应的影响。实验表明，转化温度40℃、转化时间30h、pH为7．0和底物浓度0．2mol／L时，目的产物L-茶氨酸的产率最高。     

氨基酰化酶拆分制备手性蛋氨酸工艺条件研究

以N-乙酰DL-蛋氨酸(N-Ac-DL-Met)为拆分底物,对氨基酰化酶法拆分工艺参数如反应温度、pH、激活剂Co2 浓度以及底物浓度等因素进行了初步考察。结果表明,在反应温度37℃,缓冲体系pH7.5,Co2 浓度为0.5 mmol/L,初始底物N-Ac-DL-Met的浓度为0.06 mol/L,氨基酰化酶加入量为5μg/mL的较佳条件下,L-蛋氨酸(L-Met)的产率可达45%;产物L-Met结晶的光学纯度(用对映体过量值%e.e表示)为95.4%。实验中首次采用多组分标准曲线法,提高了茚三酮显色法在氨基酰化酶法拆分制备手性氨基酸的检测精确度     

培养基组成对米曲霉产氨基酰化酶的影响

氨基酰化酶是一类能够水解N-酰基-DL-氨基酸上酰胺键的酶。通过单因素实验和正交实验,对米曲霉产氨基酰化酶的培养基组成进行了优化,以提高其产量。确定较优培养基组成为:麸皮2%、尿素1.5%、磷酸二氢钠0.3%、硫酸镁0.35%、Tween-80 0.1%,在此培养基上得到的氨基酰化酶单位酶活可提高到440.51μmol.g-1.h-1。     

稀土和硫酸二乙酯联合诱变米曲霉产氨基酰化酶的研究

为获得高产氨基酰化酶的米曲霉菌株,选用稀土硝酸镧和硫酸二乙酯对米曲霉菌株CICC-2339进行联合诱变,经摇瓶发酵筛选到氨基酰化酶高产菌株SDESLa,其酶活为39.63 μmol·g-1·h-1,较出发菌株提高了39.50%,诱变效果显著.     

氨基酰化酶固定化细胞光学拆分DL-丙氨酸

用具有氨基酰化酶基因的大肠杆菌工程菌构建固定化细胞,并对DL-丙氨酸进行酶拆分进行了实验研究。考察了温度、pH、底物浓度、金属离子和时间对酶促反应的影响。确定了氨基酰化酶固定化细胞光学拆分DL-丙氨酸中酶促反应的最佳工艺条件:pH=7.5,温度50℃,反应时间6h,Co2+离子浓度5×10-4mol/L,在该条件下,D-丙氨酸产率为87.2%,光学纯度为98.0%。     

变色圈法筛选高产氨基酰化酶米曲霉菌株

将变色圈法用于筛选高产氨基酰化酶的米曲霉菌株,减少了筛选过程的工作量、缩短了筛选周期。通过实验验证了该方法在筛选高产氨基酰化酶米曲霉菌株时的可行性,并将其用于筛选经紫外线和硫酸二乙酯复合诱变的米曲霉。从突变株中获得了一株高产氨基酰化酶菌株W53,对其生长特性和产酶特性进行了研究。结果表明,米曲霉的氨基酰化酶是生长偶联型,菌体生物量和氨基酰化酶活力同时达到最高;突变株W53和出发菌株W19的产酶过程基本一致;W53拆分N-乙酰-DL-蛋氨酸的酶活力最高可达2569 U/g,比出发菌株W19提高了14.9%。     

利用正交设计优化产氨基酰化酶的米曲霉的培养条件

采用正交实验设计L9（3^4）方法，利用摇瓶培养研究了产氨基酰化酶的米曲霉的培养温度、培养基pH和培养时间3个因素对菌体酶活的影响。结果表明，在培养温度29℃，培养基起始pH6．5以及培养时间50h。其酶活达595U／g以上。采用正交试验设计可以大大减小工作量，是一种高效率、快速、经济的实验设计方法。     

固定化米曲霉菌体填充床拆分DL-丙氨酸的动力学行为

分析了固定化米曲霉拆分DL-丙氨酸的动力学特性，通过间歇反应器的实验数据处理，获得了酶促反应的动力学参数. 应用填充床的一维稳态轴向扩散模型进行数值求解，得到了模型计算值，与实验结果比较表明，提出的模型能较好地描述固定化菌体连续拆分DL-丙氨酸过程.     

米曲霉菌体光学拆分N-乙酰-DL-苯甘氨酸的动力学研究

用液相培养基培养的米曲霉菌体直接拆分N 乙酰 DL 苯甘氨酸,并对该酶促反应进行了初步研究。考察了反应温度、pH值、金属离子、底物浓度、产物浓度等因素对反应的影响。结果表明,酶促反应的最适反应温度和pH值分别为52℃和7.0,当底物浓度小于200mmol·L-1时,反应符合Michaelis Menten方程,当底物浓度大于200mmol·L-1时,反应存在底物抑制现象。进一步研究发现水解反应也存在着产物抑制现象。     

固定化氨基酰化酶载体结构及在拆分中的应用

对采用大孔弱碱性阴离子树脂DEAE-D/H为载体制备得到的高活性固定化氨基酰化酶的载体的结构进行了扫描电镜分析,具有这种结构的DEAE-D/H固定化酶活力接近1 400 U/g。采用自制的固定床反应器连续拆分乙酰DL-蛋氨酸,根据对停留时间的测量,在反应器的液体流动为全混流、液体流速低于25 mL/h时,转化率接近100%。固定化酶具有良好的连续操作稳定性和贮藏稳定性。     

DEAE-E/H固定化氨基酰化酶

对树脂DEAE-E/H(功能基化甲基丙烯酸环氧丙酯共聚物)固定化氨基酰化酶进行了研究。考察了树脂功能基含量、比表面和孔径对固定化酶活的影响。筛选出树脂Ⅱ进行了固定化条件的研究,具体分析了酶液溶度、吸附方式和吸附时间等影响因素。结果表明当酶液质量浓度为2.0mg/mL),循环吸附8 h时,树脂Ⅱ固定化酶的酶活为980 U/g。并通过电子扫描电镜(SEM)观察分析了DEAE-E/H的结构。     

米曲霉菌体的固定化及其稳定性

在液相培养基中将米曲霉菌体培养成直径为 1～ 2mm的菌球 ,以甲醛为交联剂、明胶为活性保护剂对其进行固定化研究 .在正交实验L₁₆(4⁵)的基础上 ,利用人工神经网络得到了较优的固定化条件 :菌体与固定液的用量比 (固液比 ) 1∶8,固定液中含明胶 5 g·L^-1、甲醛 5 g·L^-1,固定化时间为 1.5h .在此条件下制备的固定化米曲霉菌体比酶活为 15 0 0U ,比酶活保留率 83% .对固定化米曲霉菌体稳定性进行深入研究表明 ,其最适反应温度和 pH值分别为 6 3℃和 8.0 ,与游离菌体相比最适反应条件范围变宽 .在固定床反应器中用其连续拆分N -乙酰 -DL -丙氨酸 ,半衰期为 77天 ,具有较高的操作稳定性     

从液相培养米曲霉体中提取氨基酰化酶

液相培养米曲霉茵体具有生长速度快;茵体和培养基易分离等优点,培养得到的氨基酰化酶主要存在于细胞内,而α-淀粉酶则主要存在于发酵液中.通过细胞破碎、抽提和(NH4)2SO4分步盐析,再经聚乙二醇浓缩后得到的氨基酰化酶液的酶活为1 067 U·ml-1,纯化了1.99倍,总收率为77.86%;用丙酮沉淀法从发酵液中沉淀分离得到的口α-淀粉酶粉的酶活可达1 195.3U·g-1,纯化了2.6倍,最终收率为89.8%.从米曲霉的液相培养发酵物中同时提取两种工业用酶,工艺简单,酶活收率高,无需复杂的精制过程.     

DEAE-D/H树脂固定化氨基酰化酶

选用6种弱碱性大孔树脂固定化氨基酰化酶,结果发现DEAE-D/H（二乙基氨基乙基–二乙烯基苯聚合物）树脂固定化效果较好,固定化酶活1 356.41 U/g。考察了不同酶液浓度下的DEAE–D/H固定化酶活收率。研究发现：酶液浓度115 U/mL时,酶活收率最高,为59.49%。具体分析了此固定化酶拆分乙酰–DL–蛋氨酸的最佳操作条件。结果表明,最佳pH值、温度和Co2+浓度分别为6.5、65℃和5×10－4　mol/L。同时考察了固定化酶的稳定性、再生性。固定化酶连续拆分乙酰-DL-蛋氨酸30天,酶活降为最初的72.6%。失活的固定化酶经洗脱、再生后,酶活达1380.64 U/g,达到新树脂固定化效果,证明载体可重复使用。     

分子筛固定氨基酰化酶Ⅰ的研究

以Y型分子筛为载体,分别采用吸附法、吸附-戊二醛交联法、偶联法和偶联-重氮法4种方法对氨基酰化酶I进行固定化。 研究发现偶联法获得的分子筛固定化酶的活性最高,达0.258 IUmg-1,并对分子筛固定化酶最适pH值、最适反应温度、重复使用性和米氏常数进行了测定;结果表明该载体适合氨基酰化酶I的固定,可以获得较高的酶活力,分子筛固定化酶的最适pH值、最适反应温度都有所拓宽。     

弱碱性大孔树脂固定化氨基酰化酶的性能研究

对以弱碱性大孔阴离子树脂二乙胺基乙基羟乙酯(DEAE-E/H)为载体制备得到的固定化氨基酰化酶的性质进行系统研究。结果表明,DEAE-E/H固定化氨基酰化酶具有很好的热稳定性。与自由酶相比,固定化酶的最适反应温度分别由47℃变为57℃,pH值由7.0变为6.5,并且最适反应条件范围明显变宽。Co2+对固定化酶活力具有较强的激活作用,其最佳浓度为1×10-3mol/L。分别对其在间歇和连续操作过程巾的反应进行研究,结果表明,固定化酶具有较高的操作稳定性。     

大肠杆菌氨基酰化酶工程菌的固定化研究

分别以聚乙烯醇(PVA)、海藻酸钠(SA)及PVA-SA为固定化载体对大肠杆菌氨基酰化酶工程菌进行固定。结果表明,PVA-SA固定化凝胶颗粒具有较好的机械强度和稳定性。确定PVA-SA的最佳包埋条件如下:PVA质量分数为8%、SA质量分数为1%、固定剂为pH值6.7的3%硼酸-1%氯化钙,此条件下制备的固定化细胞的酶回收率为91.46%。固定化细胞于4℃保存7 d、再室温保存14 d后,其酶活力为初始对照的90.76%,而游离细胞只有初始对照的29.69%。     

酶法拆分N-乙酰-D,L-丙氨酸反应控制步骤

研究了固定化米曲霉菌光学拆分N-乙酰-D,L-丙氨酸反应过程的速率控制步骤。在近似无限浴的条件下,通过测量间歇拆分反应产生的L-丙氨酸的浓度变化规律,判断反应过程中的速率控制步骤。结果表明,底物浓度和反应温度是影响速率控制步骤的重要因素,用得到的有效扩散系数进行模型计算,结果与实验值基本一致。