特殊生境下耐药性生防放线菌的生物学习性研究

【目的】明确从特殊生境中获得的生防放线菌的耐药性及其生物学习性,为生防菌的筛选提供新思路。【方法】通过比较6种供试生防放线菌各种发酵液的抑菌活性及发酵产物的干物质量,初步确定其最佳发酵和营养条件;用对峙法测定供试生防菌的耐药性及抑菌谱;用平板稀释法测定供试生防菌在盆栽试验中的根际定殖能力。【结果】发酵和营养条件试验表明,高氏1号为菌株JSJF7的最佳培养液,菌株JSGF10、GXDM6、JSGF4、JSCK14和JSJF5的最佳培养液均为SNB;供试生防菌对50%多菌灵、40%五氯硝基苯和25%氰烯菌酯的耐药性较强;供试生防菌对选用的多种靶标病原菌均表现出一定的抑菌活性,抑菌谱较广;供试的6株生防菌均能在茄子根际定殖,但以菌株GXDM6的定殖能力最强。【结论】从特殊生境中获取耐药生防菌使菌药混用成为可能,同时也为特种有益菌的筛选提供了新思路。     

解淀粉芽孢杆菌在山茶叶中的定殖及对山茶灰斑病的防效

【目的】解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)是从山茶叶片内部分离得到的1株内生拮抗菌株,通过研究该菌株在山茶叶片表面和内部的定殖规律及其对山茶灰斑病的田间防治效果,为新型生防制剂的开发及山茶灰斑病的生物防治提供理论依据。【方法】采用抗生素标记法,结合比较标记菌株和非标记菌株的形态特征、拮抗能力、防病效果,筛选出最佳标记菌株;分别采用喷施和针刺法研究接种浓度、病原菌对生防菌在山茶叶表面及内部定殖动态的影响,并测定生防菌对山茶灰斑病的田间防治效果。【结果】从含500μg/mL链霉素抗性平板上得到最佳标记菌株,标记菌株与未标记菌株在形态特征、拮抗能力、防病效果方面均无明显差异。定殖试验表明,解淀粉芽孢杆菌能够高效定殖于山茶叶表面及内部,且叶表面的定殖较叶片内部更为高效、持久,其定殖量与接种浓度呈正相关,并在一定时间内维持相当数量,病原菌仅与叶表面定殖密切相关,与生防菌的叶内定殖无关。田间防治试验表明,生防菌解淀粉芽孢杆菌菌悬液对山茶灰斑病有显著生防效果,预先接种生防菌菌悬液后再接种病原菌的生防效果最好,防效为75.35%,先接种病原菌后喷施解淀粉芽孢杆菌菌悬液处理的防效为73.89%,同时接种生防菌菌悬液和病原菌时的防效最低,为72.95%。【结论】生防菌株B.amyloliquefaciens能够有效定殖于山茶叶片表面及内部,且对山茶灰斑病具有显著的生物防治效果。     

烟草青枯病拮抗芽孢杆菌的筛选、鉴定及其抑菌活性初探

【目的】从不同烟区健康烟草的根际土壤样品中筛选对烟草青枯病具有较强拮抗作用的芽孢杆菌,为防治烟草青枯病提供生防资源。【方法】随机从福建龙岩、四川德昌、陕西汉中等地健康烟草根际土壤中采集30份土壤样品,采用平板稀释法从中分离芽孢杆菌,以烟草青枯病菌为靶标菌筛选拮抗芽孢杆菌,并通过培养特性、菌体形态、生理生化特征分析及16SrDNA序列分析,对筛选的拮抗芽孢杆菌菌株进行鉴定;采用温室盆栽试验,测定拮抗芽孢杆菌的促生作用、定殖能力和抑菌活性。【结果】从健康烟草根际土壤中分离得到1株抗烟草青枯病菌活性较好的菌株LW-4,经鉴定其为甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus。LW-4菌悬液对烟草青枯病菌的防治效果为70.37%,其可定殖于烟草根际土壤,具有良好的定殖能力。LW-4对烟草有明显的促生作用;用饱和度为25%的硫酸铵获得的LW-4抑菌物质对烟草青枯病菌的抑菌活性较高,抑菌圈直径达37.82mm。【结论】菌株LW-4在烟草青枯病防治中具有潜在的利用价值。     

烟草青枯病拮抗菌TBWR1的筛选鉴定及防病促生能力

【目的】分离对烟草青枯病菌具有拮抗作用的细菌并对菌株进行分类、鉴定,以丰富烟草青枯病生防菌菌种资源。【方法】从健康烟株根际土壤中筛选拮抗菌株,测定其形态、生理生化特征及16S rDNA序列等,并对菌株进行分类鉴定,通过盆栽试验验证拮抗菌对烟草青枯病菌的拮抗活性及其对烟株的促生作用。【结果】在烟株根际土壤中分离获得1株对烟草青枯病有明显抑制作用的菌株TBWR1,序列基因登录号为EF562603,菌株TBWR1与枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis KC849252和Bacillus subtilis MN062963在同一分支上且同源性达85%,鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis);该菌株对烟草青枯病的生防效果达71.1%,并能显著促进烟草株高、叶长、茎围生长和根系生物量增加。【结论】枯草芽孢杆菌TBWR1可作为烟草病害生物防治的候选菌株,在烟草青枯病防治中具有潜在价值。     

混合接种对辣椒疫病生防菌定殖、辣椒生长及诱导抗性的影响

【目的】探索供试生防放线菌Act1、Act8和Act11与生防真菌C、D、M1和M2混合接种对辣椒根系生长、生防菌定殖能力及辣椒叶片和根系诱导抗性的影响。【方法】采用皿内拮抗试验确定适宜的生防真菌与生防放线菌组合,以甜椒和线椒幼苗为供试材料,蘸根接种处理后,于30和31 d时测定生防菌在辣椒根部的定殖量及辣椒叶片和根系的多酚氧化酶(PPO)活性,研究不同接种处理对生防菌在辣椒根部定殖能力及辣椒叶片和根系PPO活性的影响。【结果】(1)4株生防真菌与3株拮抗性生防放线菌形成的12个组合中有7个组合混接菌种之间无相互拮抗作用。(2)生防菌混合接种时甜椒叶片PPO活性的增率大于生防菌单独接种,混和接种处理的最大接种增率约为单接处理的5倍。(3)生防菌单独接种可使甜椒根系PPO酶活异常升高,但生防菌混接(除Act1+C、Act11+C、Act11+M1和Act11+M2外)会导致甜椒根系PPO活性降低。(4)Act1与生防真菌C、M1、M2混接和Act8与D、M1、M2混接均可明显促进甜椒根系生长。(5)在混接处理中,供试生防真菌不能促进生防放线菌在甜椒根内定殖,但M1可促进生防放线菌在甜椒根表的定殖;供试生防放线菌均能促进真菌M2在甜椒根内的定殖。【结论】生防真菌与生防放线菌混合接种(除Act8+D、Act11+D外)对辣椒叶片PPO活性的提高幅度大于单独接种,混合接种(除Act11+C、Act11+M1、Act11+M2外)对根系PPO活性的降低幅度大于单独接种;混合接种不能促进生防放线菌在辣椒根内定殖,但能显著促进根系生长。     

黄曲霉生防菌DJB5在玉米种子中的定殖研究

【目的】研究生防菌DJB5在玉米种子中的定殖能力与规律。【方法】利用自然转化方法把pHT01-P43GFPmut3a质粒导入生防菌DJB5中,测定转化子的稳定性、GFP标记菌(DJB5-GFP)的生长趋势和生物膜形成能力,并通过室内平板对峙和玉米活体试验对比DJB5-GFP和野生型菌株的防效。【结果】pHT01-P43GFPmut3a质粒可以在DJB5中稳定遗传,GFP基因的导入未影响其生防活性。玉米储藏试验表明:在不同玉米含水量和贮存温度下,含水量越高,DJB5的定殖能力越强,30%含水量下,定殖量最高可以达到107CFU/g数量级;DJB5在28～35℃下的定殖量大于28℃以下和35℃以上。【结论】生防菌DJB5具有在玉米收获到贮藏期间防治黄曲霉的潜力。     

小麦白粉病生防菌拟诺卡氏菌属TMG-8菌株的筛选研究

为更好地利用生防菌防控小麦白粉病危害,从不同省份、不同生态环境中采集52份土样,用稀释分离法得到150株菌株,通过小麦白粉孢子萌发抑制试验、小麦离体叶片药效试验及温室苗期药效试验筛选得到1株对小麦白粉病抑制作用较强的生防菌株TMG-8。采用16S r DNA序列分析法结合部分生化测定试验对生防菌TMG-8进行初步鉴定,并采用抗生素抗性标记法测定生防菌TMG-8的定殖能力。初步鉴定菌株TMG-8为拟诺卡氏菌属;生防菌可在叶面上短暂定殖,在小麦叶片上的定殖量为下部中部上部,在小麦苗上的定殖量为根部茎部叶部;菌株TMG-8可在土壤中短期稳定定殖,其含量随着时间逐步增加并趋于稳定,但增加幅度不大;无论是浸根处理还是灌根处理,生防菌都能在小麦苗上定殖,定殖量为根部茎部叶部,灌根处理比浸根处理含菌量多。     

花椒根腐病生防芽孢杆菌的筛选鉴定及定殖和防治效果

【目的】对花椒根腐病生防芽孢杆菌进行分离、筛选、定殖和防效评价,为开发高效、稳定、持久的生物农药提供理论与实践基础。【方法】采用稀释平板涂布法分离健康花椒根际土中的芽孢杆菌,利用点菌法和打孔法2次筛选拮抗效果最佳的芽孢杆菌,根据形态特征和生理生化试验对其进行初步鉴定,并测定其对1年生花椒根腐病的防治效果。用链霉素标记拮抗芽孢杆菌,并检测该菌在花椒根际及根内土壤中的定殖动态,以此为基础,运用灌根法对花椒根腐病进行预防和治疗处理,计算发病率、病情指数和防治效果。【结果】在分离获得的20株芽孢杆菌中,编号为B3的菌株拮抗作用最强,抑菌圈直径达26.0mm,高温处理后仍具有活性,初步确定其为蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus。盆栽试验结果表明,花椒根腐病发病率和病情指数随B3菌株发酵液稀释倍数增加而增加,B3发酵液原液至稀释200倍以下防治效果显著。定殖动态试验结果表明,无论病原菌存在与否,抗300μg/mL链霉素的突变菌株均能在根际土壤和根内定殖,但根际土菌量大于根内,且早于根内达到峰值,随接种时间延长,定殖量下降并维持稳定。田间试验中,突变菌株B3无论预防还是治疗试验,均能发挥很好的效果,并优于原始菌株和化学农药双效灵。【结论】菌株B3能在花椒根际和根内很好地定殖、排挤病原物,具有对花椒根腐病进行生物防治的潜力和良好的发展前景。     

防风枯萎病拮抗真菌的筛选鉴定及防效评价

【目的】从防风根际土中分离筛选出对防风枯萎病具有较强防治效果的生防真菌。【方法】采用对峙培养法从根际土壤中筛选出1株可拮抗尖孢镰刀菌的真菌菌株MR-97,并测定其抑菌谱;根据真菌菌落特征、显微特征,结合ITS序列分析等方法对拮抗菌株进行鉴定;通过显微观察MR-97对尖孢镰刀菌菌丝生长的影响;采用抗生素标记法测定拮抗菌株在土壤中的定殖能力;进行田间盆栽试验,检验MR-97对防风枯萎病的防治效果。【结果】本研究筛选出1株对尖孢镰刀菌抑菌效果为64.44%的拮抗菌株MR-97,其对木贼镰刀菌、灰葡萄孢等8种常见病原菌具有较强的抑菌效果,经鉴定菌株MR-97为土曲霉Aspergillus terreus。MR-97与尖孢镰刀菌对峙培养可使病原菌菌丝产生膨大、畸形、菌丝破损、内含物凝集等现象;在土壤中具有良好的定殖效果,土壤含菌量最高为9.8×10⁶ CFU/g。盆栽试验中,MR-97对防风枯萎病防效为67.86%,防治效果较好。【结论】土曲霉MR-97可有效抑制尖孢镰刀菌等多种病原菌菌丝生长,可在土壤中较快定殖并发挥生防效力。作为优质的生防菌源,MR-97具有一定的开发应...     

生防菌在棉田土壤中定殖数量与防病作用相关性

【目的】研究拮抗菌施入棉田土壤后生防菌的数量变化和棉花黄萎病的发病情况,分析生防菌的定殖与防病的相互关系,为生防细菌在棉花黄萎病的防治应用提供理论依据。【方法】选择4株棉花内生和根际拮抗菌Bacillus atrophaeus SHZ-24、Bacillus vanillea SMT-24、Bacillu subtilis SHT-15和Bacillus velezensis BHZ-29进行盆栽试验,使用平板计数和实时荧光定量分析细菌和病原菌。【结果】4株拮抗细菌在土壤中数量变化趋势相同,50 d时的存活量从高到低分别为SHZ-24、BHZ-29、SMT-24、SHT-15,4株拮抗细菌处理均可降低棉苗的病情指数。【结论】BHZ-29的防病效果较好。4株拮抗细菌在土壤中的定殖数量与防病效果呈显著正相关。     

瓜实蝇生物学特性研究

通过对瓜实蝇B actrocera(Z eug od acus)cucurbitae在10、14、18、22、26、30、34和38℃下卵、幼虫和蛹的发育历期及成虫羽化、取食、交尾和产卵等生物学特性的研究表明,瓜实蝇的卵、幼虫和蛹的发育历期随温度的升高而缩短,其最适发育温度在26~30℃范围内。14℃下卵期3.5~4.0 d,平均(3.68±0.14)d,30℃下仅需1 d;幼虫于14℃下历期最长为(9.0~16.0)d,平均(11.73±1.21)d,30℃下最短为4.0~6.0 d,平均(4.83±0.24)d;蛹14℃下最长为24.0~33.0 d,平均(26.95±0.41)d,最短30℃下为6.0~7.0 d,平均(6.39±0.02)d。成虫白天活动,黄昏时交尾,羽化多集中于凌晨。卵产于瓜皮内,以幼虫蛀食瓜肉为害,老熟幼虫脱离瓜果进入土中化蛹。     

二色胡枝子黄酮体外抗氧化活性

通过二色胡枝子黄酮(Lespedeza bicolor flavonoids ,LBF)清除羟自由基、超氧阴离子的效果及抑制猪油、菜油和亚油酸的自氧化来研究其体外抗氧化作用.结果表明:二色胡枝子黄酮对清除自由基有显著作用,且清除率随黄酮浓度的增加而增大;能够明显地抑制猪油、菜油、亚油酸的自氧化,抑制作用随浓度的增大而增强.作为天然的抗氧化剂,二色胡枝子黄酮具有一定开发利用价值.     

关于不定方程5x(x+1)(x+2)(x+3)=18y(y+1)(y+2)(y+3)

运用Pell方程、递推序列、同余式及平方剩余等初等数论知识,证明了不定方程5x(x+1)(x+2)(x+3)=18y(y+1)(y+2)(y+3)仅有4组非平凡整数解(x,y)=(6, 4),(-9, 4),(6,-7),(-9,-7),同时给出该不定方程的全部整数解,分别为(x,y)=(0, 0),(0,-1),(0,-2),(0,-3),(-1, 0),(-1,-1),(-1,-2),(-1,-3),(-2, 0),(-2,-1),(-2,-2),(-2,-3),(-3, 0),(-3,-1),(-3,-2),(-3,-3),(6, 4),(-9, 4),(6,-7),(-9,-7).     

桂花OfPSY、OfPDS和OfHYB基因启动子克隆及表达特性分析

  目的  探究高温和外源脱落酸对桂花Osmanthus fragrans类胡萝卜素生物合成的3个相关基因,包括八氢番茄红素合成酶基因(PSY)、八氢番茄红素脱氢酶基因(PDS)、β-胡萝卜素羟化酶基因(HYB)的调控作用,为阐释桂花类胡萝卜素代谢调控的机制提供研究基础。  方法  根据桂花基因组数据库的序列,从桂花品种‘堰虹桂’‘Yanhong Gui’中克隆OfPSY、OfPDS、OfHYB基因的启动子序列,并进行生物信息学分析,再构建PCAMBIA3301-LUC载体在烟草Nicotiana benthamiana中瞬时表达,结合高温(37 ℃)和200 mg·L?1脱落酸处理,分析启动子活性。  结果  获得OfPSY、OfPDS、OfHYB基因的部分启动子,其长度分别为1 908、1 521及1 830 bp。作用元件分析表明:3个启动子中均存在TATA-box和CAAT-box等启动子基本元件、光响应元件、脱落酸响应元件以及MYB和MYC结合位点。此外,在OfPSY启动子中,存在赤霉素响应元件;在OfPDS启动子中,存在茉莉酸甲酯响应元件、赤霉素响应元件、厌氧诱导型元件参与防御和胁迫的元件;在OfHYB启动子中,存在生长素、乙烯、茉莉酸甲酯等激素响应元件、低温响应元件和厌氧诱导型元件。烟草瞬时转化试验表明:相对高温能激活OfPSY、OfPDS和OfHYB的启动子活性,脱落酸能激活OfPDS和OfHYB的启动子活性。  结论  高温和脱落酸可能通过调控桂花类胡萝卜素合成基因启动子活性,影响桂花类胡萝卜素的积累。图4表5参28     

锈色粒肩天牛幼虫的COⅠ、COⅡ、Cytb和28S基因片段序列分析

  目的  基于分子生物学手段，探讨可快速准确鉴别锈色粒肩天牛Apriona swainsoni幼虫与其他天牛幼虫的目标基因，为该保健昆虫的食药用安全提供保障。  方法  利用线粒体COⅠ、COⅡ、Cytb基因和28S细胞核基因的通用引物分别克隆获得4种基因片段，并进行同源序列检索、多重比对、序列信息分析及进化树构建。  结果  基因克隆最终获得锈色粒肩天牛4种基因序列的片段大小分别为817、545、434和1 088 bp。特殊位点分布结果显示:28S的保守位点占比最高，其后依次为Cytb、COⅠ和COⅡ，变异率则正好相反。COⅠ、COⅡ和Cytb基因片段的碱基组成和替换信息特点均表现为A+T含量>G+C含量，颠换高于转换，28S基因片段则表现为A+T含量  结论  COⅠ、COⅡ、Cytb和28S基因均可作为鉴定该虫的分子生物学参考依据。     

欧洲千里光CYCLOIDEA(CYC)类SvRAY1基因的克隆及功能分析

  目的  揭示菊科Asteraceae欧洲千里光Senecio vulgaris CYC2类RAY1基因过表达使舌状花发生不同程度变宽现象的机制,进一步探究其产生原因。  方法  克隆欧洲千里光SvRAY1基因,利用生物信息学、实时荧光定量PCR反应(qRT-PCR)、超表达载体构建、扫描电镜观察、转基因植株形态学观察与统计等方法与技术,进一步进行SvRAY1基因功能分析。  结果  qRT-PCR反应显示:SvRAY1基因主要在欧洲千里光舌状花及筒状花中表达,且生殖发育第S3和S4阶段舌状花中表达量最高;形态学观察表明转基因欧洲千里光SvRAY1超表达植株的舌状花比野生型长度较短、显著变宽。扫描电镜观察舌状花腹侧表皮细胞大小与形状,宽度显著变宽的株系中显示远轴端细胞排列紧密且细胞分裂旺盛,中轴端细胞形状由边缘弯曲变为平滑,细胞长度变短且分裂旺盛。  结论  欧洲千里光舌状花发育过程中,SvRAY1基因可能促进细胞横向分裂,进而舌状花细胞形态和排列发生不同程度的变化引起舌状花变宽。图6表2参28     

花生油酸脱氢酶基因AhFAD2A和AhFAD2B的时空表达特征

花生Arachis hypogaea油酸脱氢酶AhFAD2是调控花生种子中油酸与亚油酸比值（oleic acid/linoleic acid,O/L）的关键酶,已确定存在2个编码AhFAD2的基因:AhFAD2A和AhFAD2B,但两者在花生中的时空表达特征尚不清楚。选取2个有代表性O/L的花生品种‘山花15’‘Shanhua 15’（O/L为1）和高油酸花生突变体（O/L大于20）为材料,根据AhFAD2A和AhFAD2B基因3'-UTR核苷酸序列的差异,设计了新型、简便的区分两者的特异性引物,并利用实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）技术,对2个花生品种的7个不同组织（根,茎,叶,花,开花后20,40,60 d种子）中AhFAD2A和AhFAD2B的表达特征进行了分析。结果表明:AhFAD2A和AhFAD2B在‘山花15’和高油酸花生突变体7个组织中都有表达;其中,在2个花生品种3个不同发育时期的种子中,AhFAD2A和AhFAD2B在开花后40 d的种子中表达量最高,推测在开花至花后40 d这一阶段种子中FAD2的表达量可能对花生最终O/L起主要的调控作用。另外,‘山花15’种子中AhFAD2B的表达量显著高于AhFAD2A,而在高油酸花生突变体种子中则相反,推测花生中AhFAD2B在催化油酸去饱和生成亚油酸的过程中比AhFAD2A可能起更重要的调控作用。     

草酸青霉和棘孢木霉对青枯劳尔氏菌的生防效果

  目的  探究自主筛选获得的2株生防菌棘孢木霉Trichoderma asperellum QZ2与草酸青霉Penicillium oxalicum QZ8对青枯劳尔氏菌Ralstonia solanacearum(简称青枯菌)的生防效果。  方法  以青枯菌作为靶标菌,通过平板培养法、生长曲线法测定2株生防菌及其发酵液对青枯菌生长的抑制作用;通过土培试验、基于稀释涂布法测定生防菌在土壤中对青枯菌的抑制效果。  结果  平板对峙培养试验发现:棘孢木霉QZ2和草酸青霉QZ8对青枯菌有显著的抑制作用(P＜0.05),抑制率分别达80.9%和45.9%;棘孢木霉QZ2与草酸青霉QZ8生防菌高温灭菌发酵液对平板培养青枯菌,同样呈显著的抑制作用(P＜0.05),抑制率分别达33.3%和34.8%。无菌滤膜处理的未高温灭菌2株生防菌发酵液的青枯菌液培养结果表明:其D(600)显著小于未添加生防菌发酵液的对照D(600)(P＜0.05),且棘孢青霉QZ8抑制效果好于草酸木霉QZ2。土壤培养结果显示:2株生防菌处理的土壤中青枯菌的活菌数量显著低于未添加生防菌的对照(P＜0.05)。  结论  棘孢木霉QZ2和草酸青霉QZ8对青枯菌均有显著的抑制效果,可作为番茄Lycopersicon esculentum青枯病的潜在生防菌。图5表2参32     

MutL调控水稻黄单胞菌的致病力

为了了解水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae,Xoo)中 的MutL/MutS系统是否参与DNA修复以及是否调控病原菌的致病力,构建了mutL突变体,比较了野生型与mutL突变体的突变率差异,野生型、mutL突变体及其互补菌株侵染水稻的能力。结果显示,mutL突变导致Xoo在H₂O₂胁迫下的突变率显著升高,mutL突变导致Xoo致病力下降,表明DNA错配修复蛋白MutL参与Xoo的DNA修复并正调控Xoo致病力。     

转酿酒酵母HOG1基因拟南芥植株的获得与检测

HOG1(high osmolarity glycerol,HOG1)是酵母中参与耐高渗透压调控的重要基因。根据已发表的酿酒酵母序列,设计特异引物,扩增到完整的HOG1基因;构建植物表达载体pBI121-HOG1,通过农杆菌介导转化拟南芥,获得转化植株种子。对收获的T0代种子进行卡那霉素抗性筛选,并通过PCR和RT-PCR对抗性苗进行检测。结果表明,构建的载体成功转化拟南芥,并获得了13份转HOG1基因苗。