可用于辅助蛋白功能研究的人呼吸道合胞病毒双顺反子微型基因组的构建及拯救

【目的】构建可表达增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)报告基因的人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,RSV)双顺反子微型基因组cDNA克隆及重组质粒,并进行拯救,以探讨并验证RSV的聚合酶蛋白或辅助蛋白在RSV反向遗传学操作中的作用。【方法】利用全基因合成和分子生物学相结合的方法,在获得可分别表达EGFP和无生物活性蛋白的单顺反子微型基因组质粒pUC57-RSV-EGFP和pUC57-RSV-ORF1的基础上,进一步克隆至pBR322B载体,获得编码EGFP及无生物活性蛋白的双顺反子微型基因组质粒,经限制性内切酶和核酸序列分析正确后,与可表达4种辅助蛋白的辅助质粒共转染至BHK-T7细胞,通过荧光显微镜观察EGFP的表达以及RT-qPCR对EGFP mRNA的转录水平进行定量分析。【结果】成功构建了编码EGFP和无生物活性蛋白的RSV双顺反子微型基因组质粒pBR322B-RSVⅡ-EGFP,经与编码4种辅助蛋白的辅助质粒共转染至BHK-T7细胞,发现4种辅助蛋白对EGFP的表达具有不同的功能活性。【结论】以可表达EGFP报告基因的RSV双顺反子微型基因组重组质粒,实现了对4种辅助蛋白的功能验证,其中M2-1蛋白在双顺反子微型基因组拯救过程中具有转录延长的生物学活性。     

呼吸道合胞病毒疫苗研究进展

呼吸道合胞病毒(RSV)是引起严重下呼吸道感染的重要病原体,尽管经历了半个多世纪的努力,至今仍未有安全有效的RSV疫苗上市。近年来在RSV F蛋白结构生物学方面的研究进展为新一代RSV疫苗的开发提供了新方向,同时更多的采用不同技术、或针对不同人群的RSV侯选疫苗也在迅速发展,尤其是针对婴幼儿及老年人的RSV侯选苗已有60多种在研究中,大部分已处于临床前研究阶段,18种侯选苗已进入临床试验。我们简要介绍RSV疫苗的最新研究进展。     

人呼吸道合胞病毒感染性克隆构建及其验证

人呼吸道合胞病毒（Human respiratory syncytial virus, HRSV）是引起全球婴幼儿急性下呼吸道感染的重要病原体。本研究旨在建立HRSV原型株Long毒株的反向遗传操作系统。通过利用细菌人工染色体（Bacterial artificial chromosome,BAC）为载体骨架构建HRSV的Long毒株全长质粒（Long-BAC）,以pcDNA3.1为载体构建分别表达HRSV N、P、M2-1和L蛋白（pcDNA3.1-N,pcDNA3.1-P,pcDNA3.1-M2-1和pcDNA3.1-L）的四个辅助质粒,将五个质粒共转染于表达T7 RNA聚合酶的BSR T7/9细胞系进行病毒拯救。采用间接免疫荧光（Immune fluorescence assay,IFA）和测序方法对拯救的病毒进行鉴定,并评价其在细胞和动物水平的生物学特征。本研究首次成功构建以BAC载体为骨架的HRSV原型株Long感染性克隆,拯救的病毒在不同代数测序结果显示无突变,能够稳定传代,病毒滴度为3×106 PFU/mL;与实验室保存野生型Long株（Long-WT）相比具有相似的细胞...     

呼吸道合胞病毒F蛋白研究进展

人类呼吸道合胞病毒(RSV)融合蛋白(F蛋白)为病毒表面结构蛋白,可以刺激机体产生保护性抗体。因此对F蛋白的深入研究将有助于了解病毒感染的机理,从而为诊断试剂和亚单位疫苗的研制提供帮助。本文就F蛋白结构及结构与功能关系的研究进展进行简要综述。     

人呼吸道合胞病毒小疏水蛋白研究进展

人呼吸道合胞病毒是人呼吸道感染病原中的重要病原。SH蛋白是人呼吸道合胞病毒粒子表面的一种小分子糖蛋白,可形成五聚体的离子通道结构。SH蛋白是人呼吸道合胞病毒复制的非必需蛋白,但可以影响病毒融合蛋白介导的细胞融合,近年研究发现SH蛋白胞外区与血蓝蛋白形成的复合物可作为人呼吸道合胞病毒疫苗的抗原,产生的抗体在体内能清除病毒感染的细胞。本综述旨在对人呼吸道合胞病毒SH蛋白最新研究成果进行总结和讨论,并对未来针对SH蛋白的研究方向加以展望。     

人呼吸道合胞病毒F蛋白多肽免疫原性的初步研究

人呼吸道合胞病毒（Human respiratory syncytial virus,hRSV）是引起全球婴幼儿下呼吸道感染的最主要病原体。hRSV融合蛋白（Fusion protein,F）高度保守,是激发机体产生保护性抗体的主要靶向蛋白。目前,多种基于F蛋白设计的hRSV疫苗处于三期临床试验阶段,但尚未批准上市。本研究基于hRSV F蛋白设计的2条多肽PA(F蛋白,aa216-244)、PB(F蛋白,aa110-136),及其不同组合形式PM(PA和PB等量混合)、PL(PA和PB通过Linker连接),分别通过肌肉注射和滴鼻免疫BALB/c小鼠,评价多肽在小鼠体内的免疫效果。每只小鼠多肽的免疫剂量为25μg,分别于第0、14、28 d等剂量（加强）免疫一次。实验结果显示,与铝佐剂和CpG混合,多肽PA、PB、PM和PL肌肉注射均能诱导小鼠产生高滴度结合抗体,降低肺脏病毒载量,其中PB免疫组小鼠在hRSV活病毒攻毒后,体重恢复时间及肺病毒载量降低程度优于PM和PL免疫组和对照组;将多肽PM和PL通过不同途径免疫小鼠,滴鼻免疫组小鼠体重恢复时间和肺脏病理损伤程度优于肌肉注射免疫组。结...     

人呼吸道合胞病毒的流行病学研究进展

人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus,hRSV)是婴幼儿毛细支气管炎和支气管肺炎等严重下呼吸道感染的最主要病原,还与之后哮喘的发生关系密切。hRSV可分为A、B两种抗原亚型,对hRSV的黏附蛋白G进行核苷酸序列分析又可进一步将其分为多种基因型,不同时间或地区流行的hRSV亚型和基因型有所差异,不同型别hRSV导致的hRSV疾病严重程度可能也存在差异。迄今为止仍没有安全有效的措施防治hRSV。本文现对hRSV的流行病学研究进展综述,为hRSV疫苗的研制和hRSV疾病的防控提供参考。     

呼吸道合胞病毒保护性抗原的研究进展

对呼吸道合胞病毒（ＲＳＶ）保护性免疫机理更为详尽的了解将有助于研制安全有效的疫苗。本文介绍ＲＳＶ的蛋白组成以及单一蛋白诱生保护性免疫的能力,研究结果显示,Ｆ和Ｇ蛋白为体液免疫保护性抗原,Ｍ２、Ｆ和Ｎ为细胞免疫保护性抗原。综合诱生保护性体液和细胞免疫的能力,ＲＳＶ蛋白在保护性免疫中的重要性为：Ｆ〉Ｇ〉Ｍ２〉Ｎ。     

呼吸道合胞病毒血清中和抗体检测方法的建立

目的 建立荧光检测法测定呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)血清中和抗体的检测方法,并对其进行验证和初步应用。方法 采用反向遗传学拯救的表达绿色荧光蛋白的重组呼吸道合胞病毒(recombinant RSV experssed the enhanced green fluorescent protein, RSV-EGFP)进行RSV重组腺病毒疫苗免疫后血清的检测。通过对RSV-EGFP在人喉癌上皮(human epithelioma-2,HEp-2)细胞上荧光的检测波长、检测时间、病毒的感染剂量和HEp-2的细胞密度进行优化,确定合适的条件后,再将RSV血清倍比系列稀释后与RSV-EGFP混合接种至HEp-2细胞培养,利用多功能酶标仪检测HEp-2细胞中表达的绿色荧光蛋白的荧光强度,从而计算其中和抗体滴度。同时,通过对RSV重组腺病毒载体疫苗免疫棉鼠血清的检测进一步评估中和抗体检测方法的精密度、重复性、准确度以及边缘孔效应。结果 结果显示,当检测的激发波长为479 nm,发射波长为517 nm,检测时间为病毒感染后48 h,最佳病毒感染剂量为3 000 pfu/孔,检测的最佳细胞密度为2.0×10～4个/孔时,相对荧光强度最高,且病毒数量与荧光强度之间呈现出较好的剂量-效应关系。采用该方法检测不同抗体滴度的血清样本,日内与日间精密度的CV均<15%;同一血清样本10次重复性检测结果最大值与最小值的比值均≤4,且RSD均<15%;用建立的方法实际测得的中和滴度结果与稀释后理论中和滴度(酶联免疫斑点法)的回收率均在80%～120%之间;在边缘孔与非边缘孔检测RSV血清中和抗体滴度结果一致性较好(P>0.05)。结论 建立的荧光检测法较酶联免疫斑点法操作简便、快捷,可被用来检测RSV血清中和抗体效价。     

呼吸道合胞病毒与哮喘

据流行病学资料统计,呼吸道合胞病毒感染与哮喘的发生和发展密切相关。大部分ＲＳＶ感染病儿数年后出现哮喘症状,且ＲＳＶ感染可存在于哮喘的各种不同时期中,故可能是哮喘的诱发和加重因素。其致病机制可能与ＲＳＶ特异性ＩｇＥ诱导的Ｉ型变态反庆,组胺释放因子和嗜酸性粒细胞正性蛋白等细胞因子,组胺等炎性介质的释放以及ＲＳＶ对上皮的直接毒性等有关。     

人呼吸道合胞病毒活疫苗研究进展

人呼吸道合胞病毒是引起婴幼儿支气管炎和肺炎的主要原因,也可导致免疫缺陷病人及老年人群显著发病和死亡.人呼吸道合胞病毒疫苗已被世界卫生组织(World Health Organization,WHO)列为全球最优先发展的疫苗之一.经过50多年的研究,尤其是随着重组技术和反向遗传学的出现,对RSV疫苗的研究取得了重要进展,...     

呼吸道合胞病毒细胞免疫的研究进展

本文通过介绍单核吞噬细胞、T辅助细胞、细胞毒性T细胞、NK细胞和K细胞在呼吸道合胞病毒感染免疫中的作用,对呼吸道合胞病毒的细胞免疫机制作一概述。     

人呼吸道合胞病毒M蛋白非复制型重组腺病毒的构建和鉴定

人呼吸道合胞病毒（human respiratory syncytial virus, RSV)基质蛋白（matrix protein,M）在RSV形态发生上具有重要作用,因含有CTL抗原表位,在疫苗研究上具有一定意义。为此,应用RT-PCR 方法从感染RSV的HEp-2 细胞中扩增获得M蛋白基因,构建了含M基因的非复制型重组腺病毒并进行表达和鉴定。基因序列分析显示RSV M基因仅有一处碱基发生错义突变。非复制型重组腺病毒DNA分子FGAd/RSVM转染293细胞,观察到细胞出现CPE,RT-PCR发现M基因有转录,Western blotting及间接免疫荧光分析检测到M蛋白。成功克隆A亚型RSV Long株M基因,并获得一株可表达A亚型RSV M蛋白的非复制型重组腺病毒FGAd/RSVM,可用于体内研究观察其免疫效果及免疫保护作用。     

人呼吸道合胞病毒SH蛋白混合多肽免疫原性初步研究

本研究旨在探讨人呼吸道合胞病毒（Human respiratory syncytial virus,HRSV）小疏水蛋白（Small hydrophobic protein,SH）T细胞表位肽的免疫原性和保护效果。通过设计并合成覆盖SH蛋白序列全长的10条多肽,利用HRSV感染小鼠的脾淋巴细胞进行IFN-γ-酶联免疫斑点（Enzyme-linked immunospot assay, ELISpot）的检测,筛选出5条能显著刺激IFN-γ产生的SH蛋白T细胞表位多肽。将其与CpG和磷酸铝（AL）佐剂配制成混合多肽疫苗,两次皮下给药的方式免疫C57BL/6J小鼠,评价其免疫原性和保护效果。结果显示,与佐剂对照组相比,SH蛋白混合多肽疫苗可以诱导免疫后的小鼠产生抗原特异性IgG抗体和Th1偏向的T细胞免疫应答,降低HRSV感染后肺病毒载量,并减轻肺脏病理损伤。研究结果表明,SH蛋白混合多肽通过免疫小鼠可以引起良好的免疫原性,并保护小鼠抵抗HRSV的感染。为进一步研究基于SH蛋白的HRSV多肽疫苗提供了科学依据。     

可表达人呼吸道合胞病毒融合蛋白辅助病毒依赖型腺病毒载体的构建与制备

构建可表达A亚型人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytialvirus,RSV)融合蛋白(fusion protein,F)的辅助病毒依赖型腺病毒载体(helper-dependent adenoviral vector,HDAd),并完成大量制备、纯化和F蛋白的体外表达鉴定。将带有CMV启动子序列的F基因亚克隆至克隆载体pSC11,鉴定正确后,克隆至HDAd质粒pSC15B,构建pSC15B/F HDAd重组质粒,PmeⅠ消化pSC15B/F去除原核复制元件及抗性基因,获得HDAd/F DNA分子,经磷酸钙共沉淀法转染293Cre4细胞,16h后感染辅助病毒,收获HDAd/F载体粗提液,随后以HDAd/F粗提液及辅助病毒连续共感染293Cre4细胞直至HDAd/F达到复制极限,同时以可表达β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,LacZ)报告基因的HDAdLacZ载体作为平行对照监测载体复制过程。与辅助病毒共感染293Cre4细胞进一步扩增HDAd/F、CsCl梯度法超速离心制备大量纯化的HDAd/F载体,体外感染293细胞,RT-PCR检测到F基因有转录,Western blot分析表明F蛋白有特异性表达。总之,成功构建HDAd/F载体并在真核细胞中实现表达,为体内免疫学效力试验奠定基础,为研制RSV疫苗提供了一种新方法。     

人呼吸道合胞病毒减毒活疫苗的研究进展

人呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)是一种可引起严重下呼吸道疾病的病原体,易感人群为婴幼儿、老年人及免疫力低下者。目前尚无针对RSV的疫苗和特异而有效的抗病毒药物。研究发现,减毒活疫苗不产生疾病增强效应,在母传抗体的存在下仍可复制,且有较强的免疫原性,被认为是最有希望的RSV疫苗。就RSV减毒活疫苗的研究进展作一综述。     

呼吸道合胞病毒疫苗研究进展

呼吸道合胞病毒(RSV)是引起婴幼儿支气管炎和肺炎的主要原因,并可致免疫缺陷病人显著发病和死亡,RSV疫苗已被WHO列为全球最优先发展的疫苗之一。经过几十年的研究,虽然取得了显著进展,但尚未有RSV疫苗上市。目前RSV疫苗的研究主要集中于亚单位疫苗、减毒活疫苗和DNA疫苗等,其中亚单位疫苗和减毒活疫苗被认为最有前途,已分别进行了的临床试验。     

人呼吸道合胞病毒疫苗的研究进展

人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,HRSV)是导致婴幼儿和老年人下呼吸道感染的主要病原体,给世界各国公共卫生安全造成了极大的威胁,迄今尚无批准上市的HRSV疫苗.福尔马林灭活HRSV疫苗(formalin-inactivated HRSV vaccine,FI-HRS...     

针对呼吸道合胞病毒的免疫应答

人体染呼吸道合胞病毒（ＲＳＶ）反仅部分人产生保护性免疫,部分人仍可重复感染。在保护性免疫应答中发挥主要作用提针对该病毒Ｆ蛋白和Ｇ蛋白的中和抗体。