荧光定量RT-PCR法快速检测麻疹病毒核酸

麻疹是由麻疹病毒引起的一种以发热、呼吸道症状和出疹为特征的急性传染病。目前确诊麻疹的实验室手段主要是用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测麻疹特异性IgM抗体,但在感染初期以及免疫功能低下的患者中该抗体的滴度较低,ELISA法检测可能为阴性[1]。而近年发展起来的荧光定     

实时定量RT-PCR法检测咽拭子中麻疹病毒核酸

目的应用实时定量RT-PCR方法检测咽拭子中麻疹病毒核酸。方法荧光定量real-timeRT-PCR方法检测麻疹病毒核酸;酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测麻疹特异性IgM抗体。结果荧光定量RT-PCR方法在咽拭子中检测麻疹病毒核酸的结果是准确的。结论荧光定量RT-PCR方法是一种快速、简便检测麻疹病毒核酸的方法 ,适用于麻疹病毒的早期诊断。     

实时荧光定量PCR技术快速检测麻疹病毒核酸的研究

目的建立以特异性荧光探针为特点的TaqMan荧光定量RT-PCR方法,对麻疹病毒的核酸进行检测.方法对设计的引物与探针进行了筛选与条件优化,克服了常规RT-PCR定性检测的不足.结果具有对麻疹病毒检测的高度特异性与准确性,检测的敏感度可达0.1 TCID50,从病毒核酸提取至检测完成仅需3个多小时,操作简便,而且大大减少了常规PCR扩增产物的污染机会.结论采用该方法对麻疹病毒与相关的临床样本进行了检测,均获得了满意的结果,为麻疹病毒的分子生物学检测,提供了一种新方法.     

荧光定量-聚合酶链反应法快速检测麻疹病毒核酸

目的：采用荧光定量一聚合酶链反应（FQ-PCR）法，检测麻疹病毒核酸，用以建立和推广一种敏感、特异、快速的麻疹检测新技术。方法：TaqMan特异性荧光标记探针法，进行特异性、敏感性和麻疹疑似患者临床标本的检测。结果：FQ-PCR法检测麻疹病毒核酸具有高度的特异性和敏感性，本次试验检测灵敏度达0．1TCID砷。在14份麻疹患者咽拭子标本中，有13份标本检出麻疹病毒核酸，从核酸提取至完成检测仅需3h。结论：FQ-PCR法为麻疹病毒核酸检测提供了一种可靠的方法。     

麻疹病毒检测中实时荧光定量RT-PCR的价值分析

目的评价麻疹病毒检测中实时荧光定量RT-PCR的应用价值。方法选取疾病预防控制中心在2013年4月至2014年12月期间收治的70例疑似麻疹病例,采集患者血清标本及咽拭子标本,分别采取酶联免疫吸附试验(ELISA)法、RT-PCR法检测;比较两种检测技术检测结果。结果 ELISA法检测血清标本IgM抗体阳性率10.77%,RT-PCR检测阳性率为24.62%,数据具显著性差异(χ~2=4.279,P=0.039);ELISA法于出疹1～3d内总检测阳性率为42.86%,RT-PCR法于出疹1～3d内总检测阳性率为93.75%,数据差异具显著性(P0.05)。结论对麻疹病毒采取实时荧光定量RT-PCR检测,具较高的灵敏度,操作简单,值得临床推广。     

荧光定量RT-PCR快速检测乙型流感病毒核酸

目的建立以特异性荧光探针为特点的TaqMan荧光定量RT-PCR方法用于检测乙型流感病毒核酸.方法根据GenBank登录的流感毒株序列,应用生物学软件进行序列比对,在乙型流感病毒核蛋白(NP)基因的保守区设计引物和TaqMan探针进行筛选,对荧光定量RT-PCR反应条件进行优化,检测该方法的特异性和灵敏度.此外还对疑似乙型流感含漱液标本进行检测.结果该方法对乙型流感病毒的检测有高度的特异性,对甲1型、甲3型、禽流感病毒H5、SARS病毒及其他呼吸道病毒均无交叉反应,检测的灵敏度达0.01 TCID50,可从疑似流感患者含漱液中直接检测流感病毒核酸,从病毒核酸提取至完成检测仅需3 h左右.结论本研究建立的TaqMan荧光定量RT-PCR是一种快速检测乙型流感病毒特异、敏感的新方法.     

应用TaqMan-BHQ探针实时荧光RT-PCR法定量检测马秋波病毒核酸

〔目的〕建立一种适应口岸马秋波病毒实时荧光定量RT-PCR快速的检测方法。〔方法〕用专业软件设计引物和TaqMan-BHQ探针,以人工合成马秋波病毒S基因的片段作为模板,进行实时荧光定量RT-PCR研究。〔结果〕模板的Ct值与模板稀释浓度的对数存在良好的线性关系,标准曲线为Y=-3.281X+50.975,R2=0.999361,PCR扩增效率为101.0%,其最低检出限为28 copies/μl。〔结论〕应用TaqMan-BHQ1探针的实时荧光RT-PCR检测马秋波病毒核酸,具有耗时短、灵敏度高等特点。     

TaqMan荧光定量逆转录-聚合酶链反应快速检测麻疹病毒核酸

目的建立以特异性荧光探针为特点的TaqMan荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法.方法检测麻疹病毒的核酸,对设计的引物与探针进行筛选与条件优化.结果 Tag Man荧光定量RT-PCR方法具有对麻疹病毒核酸检测的高度特异性与准确性,检测的敏感度可达0.1TCID50,从病毒核酸提取至检测完成仅需3个多小时,操作简便,而且大大减少了常规PCR扩增产物的污染机会.结论采用Tag Man荧光定量RT-PCR方法对麻疹病毒与相关的临床样本进行了检测,均获得了满意的结果,为麻疹病毒的分子生物学检测,提供了一种新方法.     

水体中轮状病毒实时荧光RT-PCR法检测

轮状病毒(Rotavitus,RV)是引起婴幼儿肠胃炎(腹泻)的最主要病原体,全球每年约60万5岁以下儿童因轮状病毒感染引起急性腹泻而死亡,其中80%以上发生在发展中国家[1].轮状病毒随粪便排出体外后,容易进入水体并稳定存在[2],较低数量的病毒即可引发感染,所以轮状病毒污染的水体对公众健康构成严重威胁.为了有效防状病毒疫情,对常见水体进行轮状病毒监测和来源分析,本文拟通过实时荧光定量PCR技术和测序来快速检测水体中的轮状病毒.     

实时荧光RT-PCR快速检测手足口病病原体结果分析

目的建立手足口病的实时荧光RT-PCR检测技术平台,开展手足口病病原学检测工作,为手足口病防控提供实验依据。方法用实时荧光RT-PCR法检测河池市2010—2011年手足口病EV、EV71和CA16病毒核酸。结果共检测578例手足口病临床诊断病例样本,421例EV阳性,阳性率为72.84%;其中EV71阳性109例(25.89%),CA16阳性198例(47.03%),其他肠道病毒阳性114例(27.08%);6岁以下儿童EV阳性占所有感染者的99.05%;2010和2011年儿童EV71、CA16、其他肠道病毒阳性率分别为47.86%、10.00%、18.57%和9.59%、42.01%、20.09%;重症病例EV71阳性率为65.38%。结论实时荧光RT-PCR法,适合于手足口病快速确诊及常规监测,特别是重症病例诊断的重要依据。该市不同年度手足口病感染型别有差异,2010年的主要病原体为EV71,其次是其他肠道病毒;而2011年的主要病原体为CA16,其次其他肠道病毒。6岁以下儿童是EV感染的高危人群;EV71是引起重症病例的主要病原体。     

细胞培养结合实时荧光RT-PCR法快速检测7型腺病毒感染

目的建立一种细胞培养与实时荧光RT-PCR相结合的检测7型腺病毒（ADV7）感染的技术。方法A549细胞分离培养鼻咽分泌物中的腺病毒纯化后,以感染复数（MOI）为0.1、0.5、5.0和10.0的纯化病毒感染A549细胞,分别在感染后3、6、12和24h提取总RNA进行ADV7E1A基因的实时荧光RT-PCR检测并测序验证;最后用该法直接检测鼻咽分泌物标本中的7型腺病毒。结果实时荧光RT-PCR最快可在感染后3h检测出0.5MOI病毒感染的早期转录物;感染后6h可检测出0.1MOI病毒感染的早期转录物;鼻咽分泌物标本直接感染后6h即可检测到病毒的早期转录物。结论细胞培养结合实时荧光RT-PCR法能快速、灵敏、特异地检测出感染性的7型腺病毒,具有一定的推广应用价值。     

实时荧光RT-PCR法与常规RT-PCR法检测手足口病病原体的比较

目的对比分析实时荧光RT-PCR法与常规RT-PCR法在手足口病病原体检测中的差别,并评价其优劣。方法采用实时荧光RT-PCR法与常规RT-PCR法,对手足口病患者的咽拭子标本进行检测,并对检测结果作统计学分析。结果实时荧光RT-PCR法与常规RT-PCR法检测EV71结果差异有统计学意义(χ2=21.62,P0.01),EV71阳性率分别为76.53%(75/98)和41.84%(41/98),实时荧光RT-PCR法EV71阳性而常规RT-PCR法EV71阴性的样品有7份。实时荧光RT-PCR法与常规RT-PCR法检测Cox A16结果差异有统计学意义(χ2=34.45,P0.01),Cox A16阳性率分别为13.26%(13/98)和5.10%(5/98),实时荧光RT-PCR法Cox A16阳性而常规RT-PCR法Cox A16阴性的样品有3份。实时荧光RT-PCR法从RNA提取到检测结果需3 h~4 h,常规RT-PCR法需6 h~7 h。结论实时荧光RT-PCR法具有快捷、灵敏、直观等特点,在手足口病病原体检测中具有较大的应用价值。     

肠道病毒TaqMan荧光定量RT-PCR法快速检测

目的建立一种特异、灵敏、快速的荧光定量RT-PCR方法检测肠道病毒核酸,应用于暴发疫情的实验室应急检测。方法根据GenBank登录的肠道病毒基因序列,应用生物学软件进行序列比对,在肠道病毒基因的保守区设计特异性引物和TaqMan探针;对荧光RT-PCR反应条件进行优化,验证方法的特异性和灵敏度。同时对疑似肠道病毒感染者的临床样本进行检测。结果该方法对肠道病毒的检测有高度的特异性,可检出脊髓灰质炎、柯萨奇和埃可等肠道病毒,与腮腺炎、麻疹、风疹、乙型脑炎等病毒均无交叉反应。检测的灵敏度达0.1病毒效价滴定（TCID50）;可直接从疑似肠道病毒感染者的脑脊液、疱疹液和粪便等标本中检测肠道病毒核酸,从病毒核酸提取至完成检测仅需3 h左右。结论所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR是一种快速检测肠道病毒特异、敏感的方法,适用于由肠道病毒感染引起的应急疫情的实验室早期诊断。     

多重实时荧光定量RT-PCR法快速检测3种蚊媒病毒

目的建立多重实时荧光定量RT-PCR快速检测方法,用于黄热病毒(YFV)、登革热病毒(DFV)、基孔肯雅热病毒(CHIKV)的同时检测和鉴别诊断。方法分别针对YFV 3'UTR基因、DFV 3'UTR C-M基因和CHIKV nsp2基因保守区设计特异性引物和Taq Man探针,建立并优化多重实时荧光定量RT-PCR反应体系,评价方法的特异性、敏感性和稳定性,并用临床标本进行验证。结果该方法可同时检测YFV、DFV和CHIKV,检测结果的特异性强,灵敏度达1×103copy/ml,结果的重复性很好,其变异系数分别为1.03%、0.90%和0.34%。临床确诊的11例DFV标本,5例CHIKV标本和10例黄热病疫苗标本核酸检测结果皆为阳性。结论研究建立的多重实时荧光定量RT-PCR方法可同时检测YFV、DFV和CHIKV,灵敏度高、特异性强、稳定性好,是一种可同时快速检测多种蚊媒病毒的新方法。     

实时荧光RT-PCR技术在黄热病快速检测中的应用

[目的]建立黄热病病毒的实时荧光RT-PCR检测方法并用于口岸黄热病的快速检测. [方法]体外转录黄热病病毒5-UTR的部分序列核酸作为阳性对照模板,设计实时荧光RT-PCR不同的反应程序和引物/探针浓度的组合,摸索最佳反应体系条件并用于黄热病疫苗和入境发热患者标本的检测.[结果]建立的黄热病病毒的实时荧光RT-PCR检测方法最佳反应体系为:2xRT-PCR缓冲液10 μl,正向引物5UTR-FP终浓度750 nM,反向引物5UTR-RP终浓度750 nM,探针5UTR-Probe终浓度500 nM,25xRT-PCR Enzyme Mix 0.8μl,RNA 5μl,用DEPC H2O补足到反应总体积20μl;Roche lightcycler仪器适用的扩增程序为:45℃10 min,95℃10 min;95℃5 s,56℃10 s(single),72℃15 s,45次循环.该方法最低检测限约为20copies病毒/反应,与登革病毒、西尼罗病毒、日本脑炎病毒、基孔肯雅病毒等蚊媒病毒无交叉反应.应用该方法对黄热病疫苗、媒介蚊虫和入境发热患者的血清标本进行检测,结果为黄热病疫苗核酸阳性,其他标本为阴性.[结论]该实时荧光RT-PER方法灵敏度高,特异性强,适用于黄热病病毒的快速检验,防止该病在国境口岸的传入.     

肠道病毒EV71荧光定量RT-PCR法快速检测

手足口病 (HFMD)是由多种人肠道病毒感染引起,其中以EV71及Cox A16型最为常见 (1-3).由于肠道病毒传统的检测方法是病毒分离中和法定型,繁琐费时,不适合早期诊断.逆转录-聚合酶链反应 (RT-PCR)方法敏感、特异、快速,但由于PCR扩增产物需要凝胶电泳检测,易造成实验室交叉污染.本研究建立的肠道病毒EV71TaqMan荧光定量RT-PCR方法,具有敏感、特异、快速和实时在线检测等特点,较RT-PCR法具有更多的优点,适合于突发疫情的实验室早期诊断,该方法的建立为手足口病感染实验室检测提供了有效的分子生物学检测手段.现报告如下.     

运用实时荧光RT-PCR方法检测疟原虫的研究

目的对比金标准的厚薄血膜显微镜检查法(以下简称"镜检法"),对国产疟原虫核酸实时荧光PCR检测试剂(以下简称"RT-PCR检测试剂")进行研究。方法首先提取全血样本的DNA,加入RT-PCR检测试剂进行荧光定量PCR检测,比较其相关指标。结果 2种方法经配对比较,RT-PCR检测试剂检测45份全血临床标本的总符合率达93.33%,经测序对3例不符样本进行复检,3例镜检法检测为阴性,经RT-PCR检测试剂检测为阳性的样本经测序结果显示均含有疟原虫核酸序列。结论 RT-PCR检测试剂与镜检方法在各项指标差异无统计学意义,甚至在样本处理的时效性和阳性率等方面更具有明显的优势,该实时荧光PCR试剂有良好的检测质量,特别适用于口岸、进出境等单位疟原虫DNA的检测。     

实时荧光定量RT-PCR快速检测星状病毒方法的研究

目的建立以特异性荧光探针为特点的Taq Man荧光定量RT-PCR检测星状病毒。方法根据星状病毒基因组保守序列设计引物和探针,建立并分析荧光定量RT-PCR的重复性、特异性、敏感性;以所建立方法对128例病毒性腹泻患者粪便标本进行检测,同时以基因测序进行验证。结果所建立的荧光定量RT-PCR检测方法对星状病毒具有很好的特异性和重复性,灵敏度达102copy/μl。128例粪便标本中星状病毒的检出率为3.1%,与基因测序比对结果相符。结论构建的星状病毒荧光定量RT-PCR方法具有快速、特异且灵敏的特点,可用于临床病原诊断和流行病学调查。     

病毒分离、RT-PCR和实时荧光RT-PCR法检测肠道病毒71型比较

评价病毒分离培养、RT-PCR及实时荧光RT-PCR法对于肠道病毒7l型的检测效果。方法分别用疖毒分离培养、RT-PCR、实时荧光RT-PCR方法对2009年龙岩市手足口病哨点监测医院送检的153份手足口病患者咽捌子样本进行EV71检测，并对检测结果进行配对卡方检验。结果3种方法总体符合率为81．0％，3种检测方法对样本呻EV71阳性检出率差异无统计学意义（P〉0．05）。结论病毒分离、RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测方法均适用于EV71的检测，可以作为EV71的日常临床诊断方法。     

实时荧光RT-PCR法快速检测三带喙库蚊中的流行性乙型脑炎病毒

目的从四川省成都地区采集三带喙库蚊样品,快速检测蚊虫中的流行性乙型脑炎病毒(JEV),并确定JEV基因型别。方法采用实时荧光RT-PCR方法检测蚊体内的JEV。利用一步法RT-PCR试剂盒扩增阳性样品Pr M区段特异性核苷酸序列,测序后应用Clustal X1.83和Mega 5.0软件构建系统进化树,并进行基因分型和同源性分析。结果 2012年采集三带喙库蚊雌蚊10 656只,分为219份,检测出7份JEV阳性核酸样品,阳性率为3.2%。扩增Pr M区域特异性核苷酸序列674 bp,经鉴定均为基因Ⅰ型。与国内外部分GⅠ型的相关序列比较,核苷酸同源性为91.5%~100%,氨基酸同源性为94.9%~100%,其中与四川省SC09-X08株同源性最高。结论实时荧光RT-PCR法能快速检测三带喙库蚊中的JEV,成都地区存在基因Ⅰ型JEV流行。