SNL细胞作为饲养层细胞培养人胚胎干细胞

目的 为便于人胚胎干细胞(ES细胞)的培养和研究,寻找一种建系细胞作为人ES细胞的饲养层细胞.方法 以小鼠成纤维细胞系SNL细胞作为饲养层细胞培养人ES细胞株hES1.传代17代后,检测hES细胞表面特异性标志,包括碱性磷酸酶(AKP)、Oct-4、阶段特异性胚胎抗原(SSEA)-3和SSEA-4的表达;同时观察细胞的多向分化潜能.结果 hES1细胞在SNL细胞饲养层上能持续生长.经多次传代后持续表达人ES细胞表面特异性标志,其注射于重症联合免疫缺陷小鼠皮下仍能形成畸胎瘤组织.结论 SNL细胞能够作为饲养层细胞用于人ES细胞的培养,且操作更方便;该细胞已转染了耐受新霉素的基因,为将来对人ES细胞基因操作时进行药物筛选提供了可能.     

SNL细胞作为饲养层细胞培养人胚胎干细胞

目的为便于人胚胎干细胞(ES细胞)的培养和研究,寻找一种建系细胞作为人ES细胞的饲养层细胞。方法以小鼠成纤维细胞系SNL细胞作为饲养层细胞培养人ES细胞株hES1。传代17代后,检测hES细胞表面特异性标志,包括碱性磷酸酶(AKP)、Oct-4、阶段特异性胚胎抗原(SSEA)-3和SSEA-4的表达;同时观察细胞的多向分化潜能。结果hES1细胞在SNL细胞饲养层上能持续生长。经多次传代后持续表达人ES细胞表面特异性标志,其注射于重症联合免疫缺陷小鼠皮下仍能形成畸胎瘤组织。结论SNL细胞能够作为饲养层细胞用于人ES细胞的培养,且操作更方便;该细胞已转染了耐受新霉素的基因,为将来对人ES细胞基因操作时进行药物筛选提供了可能。     

肝脏NK/NKT细胞及其生物学意义

对天然杀伤细胞（NK cell）的研究近年受到高度关注。研究发现，肝脏NK/NKT细胞含量在机体天然免疫反应时可增加10倍，可能是机体最大的专职天然免疫的器官，对抵御病理、寄生菌、恶性转化细胞等的侵害具有十分重要的意义。本文就肝脏NK/NKT细胞的功能特点和生物学特性、当前的研究进展及热点问题以及进一步研究的思路和切入点作一述评。     

干细胞来源的胰岛素分泌细胞的研究进展

Ⅰ型糖尿病是由于胰岛β细胞被自身免疫系统攻击、破坏,不能正常释放胰岛素,导致血糖升高.患者需终生注射胰岛素,由于给药过程缺乏理想的血糖感应系统,常导致糖尿病大血管病变、糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、神经病变及糖尿病足等慢性并发症的发生,是糖尿病死亡的主要原因[1].为了有效控制血糖,防止糖尿病并发症的发生,提高糖尿病患者的生存质量,目前主要采用两种治疗策略来改进胰岛素的治疗,一是胰岛素输入方式的改进:临床上广泛应用的胰岛素泵就是通过24 h不停地向患者体内输入微量胰岛素,模拟正常胰岛素分泌模式,控制血糖水平,减少并发症的发生.其次是寻找方法替代被患者自身免疫系统破坏的胰岛素分泌细胞,包括胰腺或胰岛移植、对非β细胞进行基因修饰以及对干细胞的诱导分化.70年代初,Lacy等成功地证明了移植胰岛细胞能够改善糖尿病大鼠的高血糖状态,胰岛细胞移植开始蓬勃开展起来.     

牙周膜干细胞对脐血单个核细胞分化为破骨样细胞的影响

目的研究牙周组织改建过程中,牙周膜干细胞对破骨细胞形成的影响,初步探讨静压力和诱导因子对牙周膜干细胞调控破骨细胞形成的作用机制。方法有限稀释法克隆化培养牙周膜干细胞,密度梯度离心法分离脐血,收集单个核细胞。建立直接共培养和Transwell间接共培养体系。实验分组:A组,对照组(单纯共培养);B组,静压力组,共培养后第2天即对共培养细胞施加120 KPa压力,持续作用1 h后继续培养;C组,诱导因子组,培养液中加入诱导因子1,25二羟基维生素D3(1×10-8mol/L)和前列腺素E2(1×10-6mol/L)。采用倒置相差显微镜及TRAP染色,骨磨片染色等方法检测破骨样细胞(osteoclast-like cells,OLC)的形成及功能。结果各组第3、7天OLC计数比较结果显示,施加静压力后,直接共培养组OLC数量明显多于间接共培养组(P<0.01);而诱导因子组,直接共培养组OLC少于间接共培养组(P<0.01)。结论牙周膜干细胞能够促进脐血单个核细胞分化为破骨样细胞,且在静压力作用下,两种细胞直接接触时,这种调控作用更为明显。     

Periodontal ligament stem cells improve peripheral blood mononuclear cells differentiation into osteoclast-like cells

目的 研究牙周组织改建过程中,牙周膜干细胞对破骨细胞形成的影响,初步探讨静压力和诱导因子对牙周膜干细胞调控破骨细胞形成的作用机制.方法 有限稀释法克隆化培养牙周膜干细胞,密度梯度离心法分离脐血,收集单个核细胞.建立直接共培养和Transwell间接共培养体系.实验分组:A组,对照组(单纯共培养);B组,静压力组,共培养后第2天即对共培养细胞施加120 KPa压力,持续作用1h后继续培养;C组,诱导因子组,培养液中加入诱导因子1,25二羟基维生素D3(1 ×10-8 mol/L)和前列腺素E2(1×10-6 mol/L).采用倒置相差显微镜及TRAP染色,骨磨片染色等方法检测破骨样细胞( osteoclast-like cells,OLC)的形成及功能.结果 各组第3、7天OLC计数比较结果显示,施加静压力后,直接共培养组OLC数量明显多于间接共培养组(P＜0.01);而诱导因子组,直接共培养组OLC少于间接共培养组(P＜0-01).结论 牙周膜干细胞能够促进脐血单个核细胞分化为破骨样细胞,且在静压力作用下,两种细胞直接接触时,这种调控作用更为明显.     

肝干细胞－卵圆细胞的研究进展

卵圆细胞是肝脏干细胞的代表细胞,主要存在于幼肝及成人受损的肝脏中,是一种双潜能的肝脏干细胞,多种因素调节其分化,在此过程中动态表达一系列表面标志物。卵圆细胞的分化异常与肝癌的发生关系密切。在体外大量扩增卵圆细胞并使之分化为成熟的 有功能的肝细胞,为终末期肝病、肝脏的组织工程研究及基因治疗开辟了新的途径。      

Expansive effects of aorta-gonad-mesonephros-derived stromal cells on hematopoietic stem cells from embryonic stem cells

Background Hematopoietic stem cells (HSCs) give rise to all blood and immune cells and are used in clinical transplantation protocols to treat a wide variety of refractory diseases, but the amplification of HSCs has been difficult to achieve in vitro. In the present study, the expansive effects of aorta-gonad-mesonephros (AGM) region derived stromal cells on HSCs were explored, attempting to improve the efficiency of HSC transplantation in clinical practice.Methods The murine stromal cells were isolated from the AGM region of 12 days postcoitum (dpc) murine embryos and bone marrow（BM）of 6 weeks old mice, respectively. After identification with flow cytometry and immunocytochemistry, the stromal cells were co-cultured with ESCs-derived, cytokines-induced HSCs. The maintenance and expansion of ESCs-derived HSCs were evaluated by detecting the population of CD34+ and CD34+Sca-1+cells with flow cytometry and the blast colony-forming cells (BL-CFCs), high proliferative potential colony-forming cells (HPP-CFCs) by using semi-solid medium colonial culture. Finally, the homing and hematopoietic reconstruction abilities of HSCs were evaluated using a murine model of HSC transplantation in vivo.Results AGM and BM-derived stromal cells were morphologically and phenotypically similar, and had the features of stromal cells. When co-cultured with AGM or BM stromal cells, more primitive progenitor cells (HPP-CFCs ) could be detected in ESCs derived hematopoietic precursor cells, but BL-CFC’s expansion could be detected only when co-cultured with AGM-derived stromal cells. The population of CD34+ hematopoietic stem/progenitor cells were expanded 3 times,but no significant expansion in the population of CD34+Sca-1+ cells was noted when co-cultured with BM stromal cells. While both CD34+ hematopoietic stem/progenitor cells and CD34+Sca-1+ cells were expanded 4 to 5 times respectively when co-cultured with AGM stromal cells. AGM region-derived stromal cells, like BM-derived stromal cells, could promote hematopoietic reconstruction and HSCs’ homing to BM in vivo.Conclusions AGM-derived stromal cells in comparison with the BM-derived stromal cells could not only support the expansion of HSCs but also maintain the self-renewal and multi-lineage differentiation more effectively. They are promising in HSC transplantation. Chin Med J 2005; 118(23):1979-1986     

缺氧诱导胶质瘤细胞肿瘤干样细胞形成体外初步研究

目的 通过体外研究初步探讨缺氧可以诱导胶质瘤细胞逆分化形成肿瘤干样细胞.方法 ①采用CD133+细胞免疫磁珠分选法分离胶质瘤细胞得到CD133-细胞群.②缺氧处理CD133-细胞48 h后行免疫荧光染色鉴定肿瘤干细胞样标记蛋白(SOX2,OCT-4,KLF-4,Nanog,CD133)表达情况,并分别缺氧处理0、3、6、9、12、24 h及0、12、24、48、72 h行qRT-PCR及Western blot检测.流式细胞术检测胶质瘤细胞缺氧培养后CD133+细胞比例变化,检测时间为缺氧培养1、3、5、7d.③缺氧处理胶质瘤细胞1、3、5、7d后流式分析细胞周期及凋亡改变.结果 ①荧光检测结果表明,肿瘤干细胞样标记蛋白在CD133-胶质瘤细胞缺氧处理48 h后高表达;qRT-PCR及Western blot检测结果表明,缺氧处理胶质瘤细胞可以明显上调肿瘤干细胞样蛋白表达(P＜0.05),其中qRT-PCR显示SOX-2,OCT-4及Nanog最高表达在缺氧后9h,KLF-4及CD133在缺氧后12h表达最高.Westem blot蛋白检测显示OCT-4最高表达在缺氧后12 h,CD133表达最高在缺氧24h后,KLF-4及Nanog最高表达则在缺氧48 h后,SOX-2在缺氧72 h后表达量最高.另外随着缺氧时间的延长,CD133+细胞数比例逐渐升高(P＜0.05).②细胞周期结果提示缺氧处理肿瘤细胞后,Go/G1期延长,G2/M+S缩短(P＜0.05);凋亡结果提示常氧培养组更易凋亡(P＜0.05).结论 缺氧可以诱导CD133-胶质瘤细胞肿瘤干样细胞形成.     

M蛋白致敏树突状细胞诱导的抗骨髓瘤细胞效应

目的:探讨M蛋白致敏树突状细胞(DC)诱导激活的自体T细胞对骨髓瘤细胞特异性免疫杀伤效应.方法:取多发性骨髓瘤(MM)患者外周血单核细胞经GM-CSF、IL-4和TNF-α体外联合诱导生成DC,用DEAE-纤维素提取法自MM患者血清中分离、纯化M蛋白.以M蛋白冲击致敏DC(同时设未致敏的DC为对照),流式细胞术分析DC免疫表型,并与自体T淋巴细胞进行混合淋巴细胞反应.51Cr释放法测定T细胞对不同靶细胞(患者骨髓瘤细胞、U266细胞)的杀伤活性.结果:经M蛋白致敏的DC激发自体T细胞增殖的能力明显强于未致敏的DC(P＜0.05);同时负载M蛋白DC激活的T细胞杀伤活性也明显强于对照组(P＜0.01),而两组T细胞对U266细胞均无明显杀伤活性.结论:M蛋白致敏DC能有效诱导自体T细胞对骨髓瘤细胞的特异性杀伤作用.     

大鼠骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化的初步研究

目的体外分离培养骨髓间充质干细胞,并探索表皮细胞生长因子诱导MSCs分化的潜能及条件.方法采用直接贴壁法,分离培养大鼠股骨和胫骨骨髓间充质干细胞,应用免疫细胞化学法检测细胞CD44、CD106、CD29、CD90、CD34等,对分离的细胞进行鉴定.以10～40 ng/ml的表皮生长因子处理第3代MSCs,观察细胞角蛋白的表达.用Western blot方法摸索integrin β1的表达与MSCs分化状态的关系.结果原代培养的骨髓间充质细胞CD44、CD106、CD29、CD90免疫细胞化学染色为阳性,CD34为阴性,符合骨髓间充质干细胞特征.MSCs经不同浓度的EGF体外诱导7 d后,免疫细胞化学结果显示,EGF浓度为30 ng/ml和40 ng/ml时,细胞角蛋白出现阳性表达;体外诱导14 d,呈角蛋白染色阳性的细胞比例进一步增加,同时integrin β1表达量下降.结论体外培养的MSCs在EGF诱导下,具有分化为表皮细胞的倾向,同时integrin β1可能在MSCs分化中具有一定的作用.     

NK细胞上清液提高CTL细胞对肿瘤细胞杀伤力及机制的研究

目的研究从白细胞介素2(IL-2)、IL-2+IL-12、IL-2+IL-18、IL-2+IL-12+IL-18活化的NK细胞提取的上清液是否能提高细胞毒性T细胞(CTL)对黑色素瘤细胞的杀伤率及其机制。方法提取NK细胞,IL-2 6 000IU/mL、IL-2 6 000IU/mL+IL-12 10ng/mL,IL-2 6 000IU/mL+IL-18 100ng/mL,IL-2 6 000IU/mL+IL-12 10ng/mL+IL-18 100ng/mL活化,3d后提取上清液,与M05细胞培养过夜,流式细胞仪检测肿瘤细胞表面Ⅰ类组织相容性抗原(MHCⅠ)表达,以其为靶细胞检测CTL细胞对M05细胞杀伤率。结果 NK细胞上清液提高M05细胞表面MHCⅠ分子表达及CTL细胞对M05细胞杀伤率。结论 NK细胞上清液能够增强CTL对肿瘤细胞的杀伤作用。     

鼠胶质瘤细胞上清液诱导人骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的分化

目的：分离培养人骨髓间充质干细胞(MSCs),探讨鼠胶质瘤细胞上清液对其向神经元样细胞的诱导分化。方法：利用Percoll梯度分离法,培养人MSCs。采用鼠胶质瘤细胞上清液对MSCs进行诱导分化。观察人MSCs经诱导后细胞的形态变化,采用免疫细胞化学方法检测神经元烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。 结果：诱导24 h后,细胞胞体收缩呈锥形或球形,有突起长出,细胞间突起相互连接,交错成网,为典型的神经元样形态。免疫细胞化学结果显示,经诱导培养后的神经元样细胞的胞体及部分突起NSE和NF染色呈强阳性表达,而GFAP 染色呈阴性。诱导组出现NSE阳性的细胞率为(79.5±3.2)%,而对照组出现NSE阳性的细胞率为(12.1±2.0)%,两组之间比较差异有显著性 (P<0.01)。诱导组出现NF阳性的细胞率为(41.2±2.4)%,而对照组为阴性。结论：鼠胶质瘤细胞上清液可以诱导MSCs向神经元样细胞分化。     

抗原致敏的树突状细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞对肝癌细胞杀伤活性的研究

目的：观察肝癌细胞抗原致敏的树突状细胞（Dendritic cells,DC）与细胞因子诱导的杀伤细胞（Cytokine-induced killer cells,CIK）共培养后的细胞增殖活性、表型的变化及其对肝癌细胞HepG2的杀伤活性。方法：采集健康供者的外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells,PBMNC）,常规诱导出DC、CIK,用肝癌细胞HepG2抗原冲击DC（Ag-DC）,并将其与CIK共培养（Ag-DC-CIK）,观察CIK和Ag-DC-CIK的细胞表型及增殖活性,并以肝癌细胞HepG2作为靶细胞,用MTT法检测CIK和Ag-DC-CIK的杀伤活性。结果：肝癌细胞抗原致敏的DC与CIK细胞共培养后,Ag-DC-CIK细胞群增殖活性明显增强,且高表达CD3+CD8+、CD3+CD56+双阳性细胞,其增殖活性和杀伤活性较单纯的CIK细胞更高（P<0.05）。结论：肿瘤抗原致敏的DC与CIK共培养获得的Ag-DC-CIK增殖活性和对肝癌细胞的杀伤活性显著高于CIK细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞向成肌细胞诱导分化的研究

目的研究5-氮杂胞苷诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成肌细胞方向分化的最佳诱导浓度及诱导后细胞的活性,以得到稳定分化的成肌细胞.方法应用不同浓度的5-氮杂胞苷进行定向诱导分化,3H-TdR掺入试验检测诱导后细胞的活性状况,筛选出最佳的时相-浓度结合点,通过免疫组化鉴定分化结果.结果在10μmol/L5-氮杂胞苷诱导培养后15d细胞活性较好,免疫组化技术鉴定其已向成肌细胞方向分化.结论10μmol/L5-氮杂胞苷可成功诱导其向成肌细胞分化.为临床上以细胞注射治疗女性压力性尿失禁提供实验依据.     

肿瘤干细胞与肝癌干细胞相关研究进展

随着干细胞研究领域发展的日趋成熟,科学家们发现干细胞的这一特性和癌细胞之间有惊人的相似性.肿瘤可能起源于正常干细胞的转化,相似的信号通路可能既调节干细胞也调节癌细胞的自我更新,且癌细胞中可能含有"肿瘤干细胞".本文阐述了目前研究较少的肝癌干细胞的最新研究进展.     

Differentiation of Bone Marrow Mesenchymal Cells to Neural Cells

Summary： To explore the possibility and condition of differentiation of bone marrow mesenchymal ceils （BMSCs） to neural ceils in vitro, BMSCs from whole bone marrow of rats were cultured. The BMSCs of passage 3 were identified with immunocytochemical staining of CD44 （ ＋ ）, CD71 （ ＋ ） and CD45（-）, There were type I and type H ceils in BMSCs. Type I BMSCs were spindlehaped and strong positive in immunocytochemical staining of CD44 and CD71, whereas flat and big type H BMSCs were lightly stained. The BMSCs of same passage were induced to differentiate into neural ceils by β-mercaptoethanol （BME）. After induction by BME, the type I BMSCs withdrew to form neuron-like round soma and axon-like and dendrite-like processes, and were stained positively for neurofilament （NF）. The type H BMSCs did not change in the BME medium and were negatively or slightly stained of NF.     

肝干细胞--肝卵圆细胞的研究进展

对于肝卵圆细胞的研究已有一定时间，但近几年才明确其属于干细胞范畴，笔者简要综述了肝卵圆细胞的特征、来源、调控分化及与肝病的关系。