人类白细胞抗原HLA-DPA1和HLA-DPB1基因高通量测序分型的研究

目的 建立可靠的人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)基因HLA-DPA1和HLA-DPB1同步测序分型方法,研究南方汉族人群HLA-DPA1和HLA-DPB1基因的多态性.方法 根据HLA-DPA1和HLA-DPBI等位基因的全长序列,分别采用位点特异性引物扩增HLA-DPA1和HLA-DPBI目的基因片段,涵盖完整的第2外显子.PCR产物经磁珠纯化,用自行设计的测序引物及优化的测序反应体系对HLA-DPA1和HLA-DPB1第2外显子进行双向测序.纯化的测序反应产物经ABI 3730测序仪测序,用Assign 3.5 SBT软件分析结果.结果 PCR扩增获得了清晰的HLA-DPA1和HLA-DPB1基因目的片段,对HLA-DPA1和HLA-DPB1基因的第2外显子进行的双向测序结果中,序列无背景信号和杂峰.在176名南方汉族健康无关个体中,共检出了4种HLA-DPA1等位基因,其频率分布依次为:DPAI* 02:02(0.589)＞DPAl* 01:03(0.284)＞ DPAI* 02:01(0.096)＞ DPAl* 04:01(0.031).HLA-DPB1检出了14种等位基因,其中频率大于5％的4种等位基因为:DPBl* 05:01、DPBl* 02:01、DPBl* 04:01和DPBl* 02:02,频率介于1％～5％的7种,其余3种等位基因的频率均为1％以下.HLA-DPB1测序分型的结果与用AtriaAlleleSEQR商品化测序分型试剂盒检测的结果一致.结论 建立了HLA-DPA1及HLA-DPB1测序分型的方法,在群体遗传学及疾病关联研究等领域具有广泛的实用价值.     

五例样本HLA-C基因测序分型中等位基因丢失及其原因分析

目的 探讨HLA-C基因测序分型时等位基因漏检和丢失的原因,以提高HLA测序分型的成功率和准确性.方法 620份随机选择的深圳健康捐血者血样,采用AlleleSEQR HLA-C plus测序分型试剂盒进行检测,对无完全匹配、分型结果"异常"的标本,采用分子克隆和测序方法进行全长单倍体序列分析;对未检出新的碱基点突变的样本,进一步采用自行设计的PCR引物和AlleleSEQR试剂盒中的测序引物进行再测序,分析测序分型结果"异常"的原因.结果 620份经AlleleSEQR HLA-C测序分型的样本中,发现5例样本无完全匹配的基因型,与之最接近的多种等位基因型均存在单个碱基的不匹配;并且在第4外显子出现碱基杂合,但第2和第3外显子区域内无杂合碱基.经分子克隆和单倍体测序,以及采用自行设计的PCR引物和AlleleSEQR试剂盒中的测序引物再测序,证实了5例标本均存在Cw * 0706等位基因漏检和丢失现象,未发现新的碱基点突变.结论 HLA-C基因测序分型时,因PCR引物与模板DNA不匹配会导致等位基因的漏检和丢失.根据中国人群HLA-C分子全长序列特点,开发适合于中国人群的测序分型试剂十分必要.     

HLA-Cw基因全长序列分子克隆及测序方法的建立

目的 建立可靠的HLA-Cw基因全长序列的分子克隆和测序技术.方法 设计合成HLA-Cw基因全长序列PCR引物和探索PCR反应体系,采用长距离PCR技术,扩增HLA-Cw基因非翻泽区(untranslated region,5'-UTR)区、8个外显子、7个内含子和3'-UTR区,全长约4.5 kb.PCR产物纯化后进行分子克隆,筛选阳性克隆,提取质粒DNA,采用自行设计的测序引物进行全长双向测序.12份已经AlleleSEQR HLA-Cw测序分型试剂盒进行PCR产物直接测序、基因型已知的样本,分别用TaKaRa LATaq酶和Stratagene Pfu Taq DNA聚合酶进行HLA-Cw基因全长扩增,以及PCR产物分子克隆和序列测定,克隆测序结果分别与PCR产物直接测序结果进行对比分析.结果 PCR扩增获得了特异性目的 片段,测序获得了HLA-Cw基因-962～3576位碱基全长序列.克隆测序结果的对比表明,Pfu酶保真性高于LA Taq酶.比较本文测定的Cw*010201与Cw*07020101等位基因序列,在5'上游-962～-284位碱基区域存在11个单核苷酸多态(single nucleotide polymorphisms,SNPs)和2个插入(或)缺失多态性位点;3'-UTR下游3067～3576位碱基区域存在11个SNPs和1个插入(或)缺失.结论 建立了HLA-Cw基因全长序列分子克隆及测序方法,在HLA-Cw基因全长序列分子多态性及表达调控等研究领域,具有广泛应用前景.     

HLA-Cw基因全长序列分子克隆及测序方法的建立

目的 建立可靠的HLA-Cw基因全长序列的分子克隆和测序技术.方法 设计合成HLA-Cw基因全长序列PCR引物和探索PCR反应体系,采用长距离PCR技术,扩增HLA-Cw基因非翻泽区(untranslated region,5'-UTR)区、8个外显子、7个内含子和3'-UTR区,全长约4.5 kb.PCR产物纯化后进行分子克隆,筛选阳性克隆,提取质粒DNA,采用自行设计的测序引物进行全长双向测序.12份已经AlleleSEQR HLA-Cw测序分型试剂盒进行PCR产物直接测序、基因型已知的样本,分别用TaKaRa LATaq酶和Stratagene Pfu Taq DNA聚合酶进行HLA-Cw基因全长扩增,以及PCR产物分子克隆和序列测定,克隆测序结果分别与PCR产物直接测序结果进行对比分析.结果 PCR扩增获得了特异性目的 片段,测序获得了HLA-Cw基因-962～3576位碱基全长序列.克隆测序结果的对比表明,Pfu酶保真性高于LA Taq酶.比较本文测定的Cw*010201与Cw*07020101等位基因序列,在5'上游-962～-284位碱基区域存在11个单核苷酸多态(single nucleotide polymorphisms,SNPs)和2个插入(或)缺失多态性位点;3'-UTR下游3067～3576位碱基区域存在11个SNPs和1个插入(或)缺失.结论 建立了HLA-Cw基因全长序列分子克隆及测序方法,在HLA-Cw基因全长序列分子多态性及表达调控等研究领域,具有广泛应用前景.     

HLA-Cw基因全长序列分子克隆及测序方法的建立

目的 建立可靠的HLA-Cw基因全长序列的分子克隆和测序技术.方法 设计合成HLA-Cw基因全长序列PCR引物和探索PCR反应体系,采用长距离PCR技术,扩增HLA-Cw基因非翻泽区(untranslated region,5'-UTR)区、8个外显子、7个内含子和3'-UTR区,全长约4.5 kb.PCR产物纯化后进行分子克隆,筛选阳性克隆,提取质粒DNA,采用自行设计的测序引物进行全长双向测序.12份已经AlleleSEQR HLA-Cw测序分型试剂盒进行PCR产物直接测序、基因型已知的样本,分别用TaKaRa LATaq酶和Stratagene Pfu Taq DNA聚合酶进行HLA-Cw基因全长扩增,以及PCR产物分子克隆和序列测定,克隆测序结果分别与PCR产物直接测序结果进行对比分析.结果 PCR扩增获得了特异性目的 片段,测序获得了HLA-Cw基因-962～3576位碱基全长序列.克隆测序结果的对比表明,Pfu酶保真性高于LA Taq酶.比较本文测定的Cw*010201与Cw*07020101等位基因序列,在5'上游-962～-284位碱基区域存在11个单核苷酸多态(single nucleotide polymorphisms,SNPs)和2个插入(或)缺失多态性位点;3'-UTR下游3067～3576位碱基区域存在11个SNPs和1个插入(或)缺失.结论 建立了HLA-Cw基因全长序列分子克隆及测序方法,在HLA-Cw基因全长序列分子多态性及表达调控等研究领域,具有广泛应用前景.     

HLA-Cw基因全长序列分子克隆及测序方法的建立

目的 建立可靠的HLA-Cw基因全长序列的分子克隆和测序技术.方法 设计合成HLA-Cw基因全长序列PCR引物和探索PCR反应体系,采用长距离PCR技术,扩增HLA-Cw基因非翻泽区(untranslated region,5'-UTR)区、8个外显子、7个内含子和3'-UTR区,全长约4.5 kb.PCR产物纯化后进行分子克隆,筛选阳性克隆,提取质粒DNA,采用自行设计的测序引物进行全长双向测序.12份已经AlleleSEQR HLA-Cw测序分型试剂盒进行PCR产物直接测序、基因型已知的样本,分别用TaKaRa LATaq酶和Stratagene Pfu Taq DNA聚合酶进行HLA-Cw基因全长扩增,以及PCR产物分子克隆和序列测定,克隆测序结果分别与PCR产物直接测序结果进行对比分析.结果 PCR扩增获得了特异性目的 片段,测序获得了HLA-Cw基因-962～3576位碱基全长序列.克隆测序结果的对比表明,Pfu酶保真性高于LA Taq酶.比较本文测定的Cw*010201与Cw*07020101等位基因序列,在5'上游-962～-284位碱基区域存在11个单核苷酸多态(single nucleotide polymorphisms,SNPs)和2个插入(或)缺失多态性位点;3'-UTR下游3067～3576位碱基区域存在11个SNPs和1个插入(或)缺失.结论 建立了HLA-Cw基因全长序列分子克隆及测序方法,在HLA-Cw基因全长序列分子多态性及表达调控等研究领域,具有广泛应用前景.     

HLA-Cw基因全长序列分子克隆及测序方法的建立

目的 建立可靠的HLA-Cw基因全长序列的分子克隆和测序技术.方法 设计合成HLA-Cw基因全长序列PCR引物和探索PCR反应体系,采用长距离PCR技术,扩增HLA-Cw基因非翻泽区(untranslated region,5'-UTR)区、8个外显子、7个内含子和3'-UTR区,全长约4.5 kb.PCR产物纯化后进行分子克隆,筛选阳性克隆,提取质粒DNA,采用自行设计的测序引物进行全长双向测序.12份已经AlleleSEQR HLA-Cw测序分型试剂盒进行PCR产物直接测序、基因型已知的样本,分别用TaKaRa LATaq酶和Stratagene Pfu Taq DNA聚合酶进行HLA-Cw基因全长扩增,以及PCR产物分子克隆和序列测定,克隆测序结果分别与PCR产物直接测序结果进行对比分析.结果 PCR扩增获得了特异性目的 片段,测序获得了HLA-Cw基因-962～3576位碱基全长序列.克隆测序结果的对比表明,Pfu酶保真性高于LA Taq酶.比较本文测定的Cw*010201与Cw*07020101等位基因序列,在5'上游-962～-284位碱基区域存在11个单核苷酸多态(single nucleotide polymorphisms,SNPs)和2个插入(或)缺失多态性位点;3'-UTR下游3067～3576位碱基区域存在11个SNPs和1个插入(或)缺失.结论 建立了HLA-Cw基因全长序列分子克隆及测序方法,在HLA-Cw基因全长序列分子多态性及表达调控等研究领域,具有广泛应用前景.     

HLA-Cw基因全长序列分子克隆及测序方法的建立

目的 建立可靠的HLA-Cw基因全长序列的分子克隆和测序技术.方法 设计合成HLA-Cw基因全长序列PCR引物和探索PCR反应体系,采用长距离PCR技术,扩增HLA-Cw基因非翻泽区(untranslated region,5'-UTR)区、8个外显子、7个内含子和3'-UTR区,全长约4.5 kb.PCR产物纯化后进行分子克隆,筛选阳性克隆,提取质粒DNA,采用自行设计的测序引物进行全长双向测序.12份已经AlleleSEQR HLA-Cw测序分型试剂盒进行PCR产物直接测序、基因型已知的样本,分别用TaKaRa LATaq酶和Stratagene Pfu Taq DNA聚合酶进行HLA-Cw基因全长扩增,以及PCR产物分子克隆和序列测定,克隆测序结果分别与PCR产物直接测序结果进行对比分析.结果 PCR扩增获得了特异性目的 片段,测序获得了HLA-Cw基因-962～3576位碱基全长序列.克隆测序结果的对比表明,Pfu酶保真性高于LA Taq酶.比较本文测定的Cw*010201与Cw*07020101等位基因序列,在5'上游-962～-284位碱基区域存在11个单核苷酸多态(single nucleotide polymorphisms,SNPs)和2个插入(或)缺失多态性位点;3'-UTR下游3067～3576位碱基区域存在11个SNPs和1个插入(或)缺失.结论 建立了HLA-Cw基因全长序列分子克隆及测序方法,在HLA-Cw基因全长序列分子多态性及表达调控等研究领域,具有广泛应用前景.     

HLA-Cw基因全长序列分子克隆及测序方法的建立

目的 建立可靠的HLA-Cw基因全长序列的分子克隆和测序技术.方法 设计合成HLA-Cw基因全长序列PCR引物和探索PCR反应体系,采用长距离PCR技术,扩增HLA-Cw基因非翻泽区(untranslated region,5'-UTR)区、8个外显子、7个内含子和3'-UTR区,全长约4.5 kb.PCR产物纯化后进行分子克隆,筛选阳性克隆,提取质粒DNA,采用自行设计的测序引物进行全长双向测序.12份已经AlleleSEQR HLA-Cw测序分型试剂盒进行PCR产物直接测序、基因型已知的样本,分别用TaKaRa LATaq酶和Stratagene Pfu Taq DNA聚合酶进行HLA-Cw基因全长扩增,以及PCR产物分子克隆和序列测定,克隆测序结果分别与PCR产物直接测序结果进行对比分析.结果 PCR扩增获得了特异性目的 片段,测序获得了HLA-Cw基因-962～3576位碱基全长序列.克隆测序结果的对比表明,Pfu酶保真性高于LA Taq酶.比较本文测定的Cw*010201与Cw*07020101等位基因序列,在5'上游-962～-284位碱基区域存在11个单核苷酸多态(single nucleotide polymorphisms,SNPs)和2个插入(或)缺失多态性位点;3'-UTR下游3067～3576位碱基区域存在11个SNPs和1个插入(或)缺失.结论 建立了HLA-Cw基因全长序列分子克隆及测序方法,在HLA-Cw基因全长序列分子多态性及表达调控等研究领域,具有广泛应用前景.     

HLA-Cw基因全长序列分子克隆及测序方法的建立

目的 建立可靠的HLA-Cw基因全长序列的分子克隆和测序技术.方法 设计合成HLA-Cw基因全长序列PCR引物和探索PCR反应体系,采用长距离PCR技术,扩增HLA-Cw基因非翻泽区(untranslated region,5'-UTR)区、8个外显子、7个内含子和3'-UTR区,全长约4.5 kb.PCR产物纯化后进行分子克隆,筛选阳性克隆,提取质粒DNA,采用自行设计的测序引物进行全长双向测序.12份已经AlleleSEQR HLA-Cw测序分型试剂盒进行PCR产物直接测序、基因型已知的样本,分别用TaKaRa LATaq酶和Stratagene Pfu Taq DNA聚合酶进行HLA-Cw基因全长扩增,以及PCR产物分子克隆和序列测定,克隆测序结果分别与PCR产物直接测序结果进行对比分析.结果 PCR扩增获得了特异性目的 片段,测序获得了HLA-Cw基因-962～3576位碱基全长序列.克隆测序结果的对比表明,Pfu酶保真性高于LA Taq酶.比较本文测定的Cw*010201与Cw*07020101等位基因序列,在5'上游-962～-284位碱基区域存在11个单核苷酸多态(single nucleotide polymorphisms,SNPs)和2个插入(或)缺失多态性位点;3'-UTR下游3067～3576位碱基区域存在11个SNPs和1个插入(或)缺失.结论 建立了HLA-Cw基因全长序列分子克隆及测序方法,在HLA-Cw基因全长序列分子多态性及表达调控等研究领域,具有广泛应用前景.     

HLA-Cw基因全长序列分子克隆及测序方法的建立

目的 建立可靠的HLA-Cw基因全长序列的分子克隆和测序技术.方法 设计合成HLA-Cw基因全长序列PCR引物和探索PCR反应体系,采用长距离PCR技术,扩增HLA-Cw基因非翻泽区(untranslated region,5'-UTR)区、8个外显子、7个内含子和3'-UTR区,全长约4.5 kb.PCR产物纯化后进行分子克隆,筛选阳性克隆,提取质粒DNA,采用自行设计的测序引物进行全长双向测序.12份已经AlleleSEQR HLA-Cw测序分型试剂盒进行PCR产物直接测序、基因型已知的样本,分别用TaKaRa LATaq酶和Stratagene Pfu Taq DNA聚合酶进行HLA-Cw基因全长扩增,以及PCR产物分子克隆和序列测定,克隆测序结果分别与PCR产物直接测序结果进行对比分析.结果 PCR扩增获得了特异性目的 片段,测序获得了HLA-Cw基因-962～3576位碱基全长序列.克隆测序结果的对比表明,Pfu酶保真性高于LA Taq酶.比较本文测定的Cw*010201与Cw*07020101等位基因序列,在5'上游-962～-284位碱基区域存在11个单核苷酸多态(single nucleotide polymorphisms,SNPs)和2个插入(或)缺失多态性位点;3'-UTR下游3067～3576位碱基区域存在11个SNPs和1个插入(或)缺失.结论 建立了HLA-Cw基因全长序列分子克隆及测序方法,在HLA-Cw基因全长序列分子多态性及表达调控等研究领域,具有广泛应用前景.     

HLA-Cw基因全长序列分子克隆及测序方法的建立

目的 建立可靠的HLA-Cw基因全长序列的分子克隆和测序技术.方法 设计合成HLA-Cw基因全长序列PCR引物和探索PCR反应体系,采用长距离PCR技术,扩增HLA-Cw基因非翻泽区(untranslated region,5'-UTR)区、8个外显子、7个内含子和3'-UTR区,全长约4.5 kb.PCR产物纯化后进行分子克隆,筛选阳性克隆,提取质粒DNA,采用自行设计的测序引物进行全长双向测序.12份已经AlleleSEQR HLA-Cw测序分型试剂盒进行PCR产物直接测序、基因型已知的样本,分别用TaKaRa LATaq酶和Stratagene Pfu Taq DNA聚合酶进行HLA-Cw基因全长扩增,以及PCR产物分子克隆和序列测定,克隆测序结果分别与PCR产物直接测序结果进行对比分析.结果 PCR扩增获得了特异性目的 片段,测序获得了HLA-Cw基因-962～3576位碱基全长序列.克隆测序结果的对比表明,Pfu酶保真性高于LA Taq酶.比较本文测定的Cw*010201与Cw*07020101等位基因序列,在5'上游-962～-284位碱基区域存在11个单核苷酸多态(single nucleotide polymorphisms,SNPs)和2个插入(或)缺失多态性位点;3'-UTR下游3067～3576位碱基区域存在11个SNPs和1个插入(或)缺失.结论 建立了HLA-Cw基因全长序列分子克隆及测序方法,在HLA-Cw基因全长序列分子多态性及表达调控等研究领域,具有广泛应用前景.     

HLA-Cw基因全长序列分子克隆及测序方法的建立

目的 建立可靠的HLA-Cw基因全长序列的分子克隆和测序技术.方法 设计合成HLA-Cw基因全长序列PCR引物和探索PCR反应体系,采用长距离PCR技术,扩增HLA-Cw基因非翻泽区(untranslated region,5'-UTR)区、8个外显子、7个内含子和3'-UTR区,全长约4.5 kb.PCR产物纯化后进行分子克隆,筛选阳性克隆,提取质粒DNA,采用自行设计的测序引物进行全长双向测序.12份已经AlleleSEQR HLA-Cw测序分型试剂盒进行PCR产物直接测序、基因型已知的样本,分别用TaKaRa LATaq酶和Stratagene Pfu Taq DNA聚合酶进行HLA-Cw基因全长扩增,以及PCR产物分子克隆和序列测定,克隆测序结果分别与PCR产物直接测序结果进行对比分析.结果 PCR扩增获得了特异性目的 片段,测序获得了HLA-Cw基因-962～3576位碱基全长序列.克隆测序结果的对比表明,Pfu酶保真性高于LA Taq酶.比较本文测定的Cw*010201与Cw*07020101等位基因序列,在5'上游-962～-284位碱基区域存在11个单核苷酸多态(single nucleotide polymorphisms,SNPs)和2个插入(或)缺失多态性位点;3'-UTR下游3067～3576位碱基区域存在11个SNPs和1个插入(或)缺失.结论 建立了HLA-Cw基因全长序列分子克隆及测序方法,在HLA-Cw基因全长序列分子多态性及表达调控等研究领域,具有广泛应用前景.     

浙江汉族人群KIR2DL3基因遗传多态性

目的探讨浙江汉族人群KIR2DL3基因的多态性分布情况。方法采用PCR测序分型方法进行KIR2DL3等位基因分型。首先合成引物特异性扩增KIR2DL3基因的两个片段,然后对KIR2DL3基因第4、5、7、8和9外显子进行测序分析,根据多态性位点格局判断样本的KIR2DL3等位基因情况。结果样本中共检测到两种等位基因,其中KIR2DL3*001等位基因占77%。结论PCR测序分型方法可有效检测KIR2DL3等位基因。     

MICA基因第2～4外显子大规模双向测序及分子克隆检测平台的建立

目的 建立稳定的、大规模的MICA基因第2～4外显子双向测序分型检测技术平台,并分析其单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP).方法 自行设计MICA基因第2～5外显子扩增引物及测序引物,探索PCR扩增及测序的最佳反应条件.用商品化的MICA基因单向测序分型试剂盒作为平行对照,对4个包含MICA* 010等位基因的样本采用自行设计引物扩增,并进行分子克隆和单倍体测序.结果 采用自行建立的MICA基因双向测序分型方法验证了100人份平行对照组单向测序分型结果.应用本研究建立的方法获得了中国人群MICA基因第2～4外显子22个SNP位点.两个新等位基因MICA* 065、MICA* 066获得了世界卫生组织的正式命名.首次发现了MICA等位基因第3内含子新的SNP位点,序列已提交IMGT/H LA数据库.结论 建立的MICA基因双向测序方法可大规模应用于中国人群的MICA基因多态性、组织器官移植配型和疾病研究.     

dystrophin基因第45～54外显子缺失连接片段的克隆和测序

目的通过对dystrophin基因第45-54外显子缺失后连接片段的克隆和测序分析，探讨dystrophin基因缺失的发生机理。方法先以外显子PCR反应检测证实1例杜氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy，DMD）患者第45～54外显子缺失，然后在第44和第54内含子上用PCR步移方法寻找断裂位点，最后用靠近断裂位点处设计的引物，以PCR法直接扩增dystrophin基因的缺失连接片段并测序，测序结果和正常内含子序列作对比分析。结果对扩增连接片段的PCR产物测序获得2716bp有效序列。本例基因缺失片段长达402kb。5’端断裂点位于第44内含子长散在元件（long interspersed elements，LINE）L1序列内，邻近基质附着区（matrix attachment region，MAR），3’端断裂位点在第54内含子较可能形成MAR的一个次级区域内，附近有拓扑异构酶Ⅱ识别位点，断裂点两旁存在6bp的回文序列。连接片段通过4bp的微小同源序列AGAG连接断裂点两端。结论由L1重复序列、断裂点附近拓扑异构酶Ⅱ酶切位点、MARs以及微小同源序列的非同源末端连接修复等综合因素引起的非同源基因重组可能是导致此一大片段基因缺失的重要原因。     

Dystrophin基因常见易缺失外显子片段的克隆

目的对Dystrophin基因18个常见易缺失外显子片段进行克隆、鉴定,以克隆产物作为核苷酸探针为研制Dystrophin基因缺失检测微阵列作准备。方法以人类基因组DNA为模板,应用18对引物,对Dystrophin基因常见易缺失外显子片段进行PCR扩增。将扩增产物与pGEM-T Easy载体连接,转化E．coli JM109感受态细胞。通过平板培养,挑选阳性克隆。提取重组质粒,Not I酶切,获得完整的探针片段,并作测序鉴定。通过核酸序列数据库相似性检索工具验证序列的来源及其与GeneBank收录序列的相似性。结果PCR扩增出18个片段,与Dystrophin基因预期扩增片段大小相一致。重组克隆的酶切产物与PCR产物大小相近,与预期相一致。经测序获得18个克隆片段全序列,其核苷酸数量与预期基本一致,序列相似性检索分析证实了这些克隆片段与GeneBank收录的Dystrophin基因片段具有极高的同源性。结论克隆产物确为Dystrophin基因常见易缺失外显子片段。     

异基因骨髓移植中PCR-SSP和RFLP对HLA-DRB、DPB1分型的应用

目的:探讨序列特异性引物聚合酶链反应（PCR-SSP）和聚合酶链反应限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）对HLA-DRB、DPB1分型在异基因骨髓移植中应用的可行性。方法:应用19对不同的DRB抗原所对应等位基因序列特异性的引物,PCR扩增供受者各20个样本DRB,产物直接琼脂糖凝胶电泳分析;同时用另一对引物PCR扩增DPB1第二外显子,产物10种限制性内切酶酶切分析。结果:各DRB带清晰可辨,直接确定为该型;DPB1的多态性片段编码转换后确定其基因型;4例找到供者。结论:它们是异基因骨髓植前快速、精确和可靠的基因分型手段。     

dystrophin基因常见易缺失外显子片段的克隆和鉴定(英文)

背景:dystrophin基因是人类常见的X染色体连锁隐性遗传的神经-肌肉系统疾病,dystrophin基因缺失集中在两个热点区域即外显子2～20和44～53,其主要缺失可以通过对一系列外显子的检测来发现。然而对dystrophin基因缺失的18个常见易缺失外显子片段的系统检测却鲜有报道。目的:拟对dystrophin基因18个常见易缺失外显子片段进行克隆、鉴定。方法:以人类基因组DNA为模板,应用18对引物对dystrophin基因常见易缺失外显子片段进行PCR扩增。将扩增产物与pGEM-TEasy载体连接,转化E.coliJM109感受态细胞。通过平板培养,挑选阳性克隆。提取重组质粒,NotI酶切,获得完整的探针片段,并作测序鉴定。通过核酸序列数据库相似性检索工具验证序列的来源及其与GeneBank收录序列的相似性。结果与结论:PCR扩增出18个片段,与dystrophin基因预期扩增片段大小相一致。重组克隆质粒的酶切产物与PCR产物大小相近,与预期相一致。经测序获得18个克隆片段全序列,其核苷酸数量与预期基本一致,序列相似性检索分析证实了这些克隆片段与GeneBank收录的dystrophin基因片段具有极高的同源性。克隆产物确为dystrophin基因常见易缺失外显子片段。     

一例ABO血型cisAB06亚型的基因序列分析

目的 探讨1例ABO亚型cisAB06的血清学和分子遗传特征.方法 应用单克隆抗体检测1例ABO正反定型不符的患者红细胞ABO抗原,标准A、B、O红细胞检测血清中ABO抗体.用序列特异性引物-聚合酶链反应进行ABO基因分型.用PCR技术特异性扩增A、B基因第6～7外显子,PCR产物纯化后直接测序分析.结果 患者红细胞有A、B抗原,同时血清中存在抗A抗体.聚合酶链反应-序列特异性引物基因分型结果为B/O02型,直接测序结果为cisAB06型,与B101基因序列比对仅在第526位发生G＞C的突变(c.526G＞C),该位点的突变导致176位甘氨酸变成精氨酸(p.R176G).结论 B等位基因c.526G＞C突变形成cisAB06等位基因,其血清学表现为AB型.