HEK293细胞上表达的人类超极化激活环核苷酸门控钾通道亚型2和亚型4的电生理

目的将人类超极化激活环核苷酸门控钾通道亚型2（hHCN2）和亚型4（hHCN4）的基因表达于HEK293细胞系上,观察其表达的通道的电生理特点。方法包含目的基因hHCN2或hHCN4的cNDA亚克隆到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,穿梭载体和病毒骨架载体pAdEasy-1在大肠杆菌重组,病毒经过包装和扩增后分别转染HEK293细胞。利用全细胞膜片钳技术,记录分别转染了hHCN2和hHCN4的HEK293细胞上的超极化激活钾电流（If）。结果转染hHCN2和hHCN4的HEK293细胞上产生超极化激活的内向电流。两种通道的半数最大激活电压分别为-114．8mV±3．3mV和-125．9mV±2．9mV,反向曲线斜率分别为11．1mV±1．2mV和13．7mV±1．3mV。两者的激活动力学明显不同,刺激电压为一110mV时,通道的激活时间常数分别为0．99s±0．21s和8．47s±2．85s。两种通道对钠离子和钾离子的相对通透性分别为0．40和0．34。两种电流均可被2mmol／L的氯化铯（CsCI）阻断。结论目的基因hHCN2和hHCN4在HEK293细胞上成功表达,形成的两种通道具有明显不同的激活动力学。     

MiRP1对异源转染的CHO细胞上HCN1和HCN2通道电生理特性的调节

目的 评价Mink相关肽1(MiRP1)对异源转染的CHO细胞上的HCN1、HCN2通道电生理特性的影响.方法 将MiRP1质粒DNA分别和HCN1、HCN2质粒DNA共转染CHO-K1细胞,用全细胞膜片钳记录细胞膜上的HCN通道电流.结果 MiRP1显著增加HCN2 [(37.8±4.8) pA/pF(n=11) vs (25.9±1.7) pA/pF(n=10); -140 mV, P<0 05]的电流密度,但是对HCN1的电流大小没有影响[(41.3±10.9) pA/pF(n=13) vs (34.9±7.8) pA/pF(n=11); P>0 05];MiRP1可加快HCN1[时间常数:(180.9±8.6) ms vs (306.1±45.6) ms; -80 mV, P<0 05]和HCN2 [时间常数:(391.8±33.6) ms vs (763.5±106.1) ms; -80 mV, P<0 05]激活动力学;MiRP1对HCN1及HCN2通道激活的电压依赖性没有影响.结论 MiRP1可加快HCN1和HCN2通道激活,且增加HCN2的电流表达.     

环磷酸核苷对重组mHCN4通道的调控作用

目的 观察环磷酸核苷对重组mHCN4通道动力学特性的影响.方法 用免疫磁珠法分选、纯化2月大昆明小鼠的骨髓间充质干细胞.以pUC18、pcDNA3-mHCN4、pIRES2-EGFP、pMSCV-puro等质粒载体为架构,构建pMSCV-mHCN4-EGFP逆转录病毒载体并转染纯化的mMSCs,采用常规膜片钳技术,观察环磷酸核苷对阳性转染细胞mHCN4通道的调控作用.结果 (1)mHCN4基因转染组细胞有超极化激活的内向电流,该电流对细胞外Cs 高度敏感.mHCN4通道电流的半数最大激活电压为(-99.0±5.8)mV,反转电位是(-22.5±5.2)mV,在-140mV电压时的激活时间常数为(451±61)ms.(2)当细胞内液加入cAMP后,阳性转染细胞超极化激活的内向电流明显变大,通道的激活曲线向右移位,半数最大激活电压绝对值变小,反转电位负值加大,在不同指令电压下的激活时间常数变小.cGMP的调控作用与cAMP相似,但作用略弱于后者.结论 环磷酸核苷对重建的HCN4通道有类生理性的调控作用,mHCN4基因修饰后的mMSCs有可能成为一种有效的生物起搏种子细胞.     

HEK293细胞内源性电压门控钾离子通道电生理学特性研究

目的探讨人胚胎肾细胞(HEK293细胞)内源性电压门控钾通道的电生理特性,避免HEK293细胞上内源性离子通道对外源性离子通道表达时的干扰。方法利用全细胞膜片钳技术分析了HEK293细胞内源性电压门控钾通道的电生理特性。结果在HEK293细胞上去极化电压从-80 mV开始可触发1个外向电流。在+100 mV时电流为(422.78±68.87)pA,电流密度为(21.91±3.20)pA/pF。钾通道阻断剂四乙胺(tetraethylammonium,TEA)、4-氨基吡啶(4-aminopyri-dine,4-AP),在将细胞外液钾浓度由4 mmol/L提高到40 mmol/L时,对外向电流有影响。结论正常培养的HEK293细胞本身有内源性的钾通道。该外向电流可能包括了IK、IK1、IKur和Ito。     

表达心脏SCN5A基因的人胚肾细胞钠电流特性及其对钠通道阻滞剂的反应性

目的 利用人胚肾293细胞表达心脏钠通道SCN5A基因并研究其钠电流特性和对钠通道阻滞剂的反应性.方法 野生型SCN5A基因和SCN1B基因共表达于人胚肾293细胞,应用全细胞膜片钳技术记录给药(氟卡尼与利多卡因)前后的钠电流.结果 SCN5A基因转染效率约为60%;测试电压为-40 mV时记录到钠电流峰值大小约为-8 nA;100 μmol/L的氟卡尼轻度抑制钠电流,使钠电流峰值减少(21.1±4.6)%[(-435.8±30.5) pA/pF vs.(-343.9±27.1) pA/pF,P＜0.01];氟卡尼使钠通道激活曲线和失活曲线均呈负向移动,改变的幅值分别是-6.08 mV[(-51.88±1.20) mV vs.(-57.96±0.79) mV,P＜0.05]和-9.08 mV[(-94.12±0.13) mV vs.(-103.20±0.11) mV,P＜0.05];1 Hz和10 Hz频率刺激时,氟卡尼使钠电流分别减少(64.5±10.7)%和(83.5±12.2)%(P＜0.01);30 μmol/L利多卡因使钠通道失活后快恢复时间常数和慢恢复时间常数分别延长2倍和3倍.结论 表达心脏钠通道SCN5A基因的人胚肾293细胞模型可用于基因特异性的钠通道阻滞剂安全性与药效学筛查.     

人肠系膜血管平滑肌细胞BKCa通道在HEK293细胞上的表达方法研究

目的:本研究旨在HEK 293细胞系上成功表达人肠系膜血管平滑肌细胞大电导钙激活钾通道(large-conductance calcium-activated potassium channels,BKCa),建立一种稳定高效表达人肠系膜血管平滑肌细胞BKCa的HEK 293细胞系方法,进一步揭示在工具细胞表达上的BKCa的基本特性,为以后的诸多实验提供参考价值.方法:应用基因工程技术构建人肠系膜血管平滑肌细胞BKCa通道基因表达载体,用脂质体转染法转染HEK 293细胞,建立了稳定高效表达BKCa通道的HEK 293细胞系的方法.结果:在HEK 293细胞系上表达的BKCa单通道电流的电导值为229.56±4.62 pS,具有电压依赖性,钙离子敏感性等特性;在HEK 293细胞系表达的BKCa全细胞宏观电流具有明显的电压依赖性和外向整流特性.结论:成功建立了一种在HEK293细胞系上表达的BKCa通道的实验方法,并成功记录到BKCa通道的单通道电流和全细胞宏观电流,且与天然细胞上BKCa通道电流特性基本一致.     

人心房肌Kv1.5钾通道稳定表达细胞系的建立

目的:建立稳定表达人心房肌细胞Kv1.5钾通道的细胞系. 方法:将编码人心房Kv1.5钾通道的hKv1.5基因转染HEK 293细胞,用1 g/L G418筛选2 wk后采用膜片钳方法筛选具有抗G418抗性的细胞克隆,电流记录模式为全细胞记录. 结果:hKv1.5通道基因被成功转入HEK 293细胞并稳定表达;稳定表达的hKv1.5电流是具有明显电压依赖性和超快激活特点的外向电流,其电流大小为(3.20±0.60)nA,其激活电压在-30 mV左右. 结论:成功构建稳定表达人心房Kv1.5钾通道蛋白的HEK 293细胞系,其电流特性与人心房肌IKur相似,可以作为体外研究人心房IKur的细胞模型.     

HCN4与生物心脏起搏的基础研究现状

HCN4作为超极化激活环核苷酸门控阳离子通道(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channel,HCN)基因家族亚型,被认为是心脏起搏细胞产生自动节律重要基础,其中超极化激活电流(funny current,If)是重要的起搏调控部分,HCN家族基因参与编码If电流,由于HCN4与心脏起搏的产生和调节关系密切,所以被称为起搏基因.     

腺病毒介导超极化激活环核苷酸门控阳离子通道基因亚型4过度表达对乳鼠心肌细胞电生理特性的影响

目的观察过度表达超极化激活环核苷酸门控阳离子通道基因亚型(HCN)4对乳鼠心肌细胞电生理特性的影响。方法酶解法分离20只乳鼠的原代心肌细胞并进行培养,用含HCN4基因的重组腺病毒AdHCN4感染心肌细胞,以未感染细胞作为对照组,通过RT-PCR及细胞免疫荧光方法检测心肌细胞中HCN4基因在mRNA和蛋白质水平的表达,用全细胞膜片钳方法测定转染HCN4基因的心肌细胞的动作电位和起搏电流If。结果AdHCN4感染组心肌细胞中HCN4mRNA和蛋白质的表达水平明显高于对照组细胞;感染组心肌细胞自发搏动的频率为(92·5±7·4)次/分,明显高于对照组心肌细胞的(68·9±6·2)次/分(P<0·05);动作电位出现明显的4相自动除极化,其最大舒张电位(-52·8±4·2)mV明显高于对照组细胞(-62·1±2·6)mV(P<0·05);动作电位复极50%和90%的时间两者比较差异无统计学意义;在感染组细胞中,起搏电流If的电流密度为(115·7±7·8)pA/pF,也明显高于对照组细胞的(7·2±0·6)pA/pF(P<0·05)。结论过度表达起搏通道基因HCN4能够明显增强乳鼠心肌细胞的自律性,从而增加心肌细胞自发搏动的频率,这提示HCN4基因有可能成为治疗缓慢性心律失常疾病的目的基因。     

TRPM7通道过表达细胞株的建立、鉴定及其功能的初步研究

通过瞬时转染TRPM7-eGFP质粒至人胚胎肾细胞HEK293T细胞建立瞬时受体电位Melastatin的7型通道(TRPM7通道)过表达体系并利用此体系对通道特性进行研究。经荧光显微镜观察,转染率可达30%~40%,RT-PCR及Western印迹结果显示转染后的细胞在相应的基因及蛋白水平上均有明显的表达。膜片钳结果显示转染后全细胞电流可达2800pA,pH7.4至pH4.0时通道内向电流显著增加,200μmol/L二苯硼酸-2-氨基乙酯（2-APB）显著抑制通道外向电流。结果表明瞬时转染HEK293T细胞的TRPM7过表达体系成功构建,细胞外酸性条件及TRPM7通道抑制剂2-APB对通道电流有不同影响,提示该通道功能可受到多种因素的影响。     

心肌细胞上的KCNK通道

KCNK通道是一类新型的钾离子通道,具有4个跨膜片断和2个膜孔区。它广泛分布于兴奋和非兴奋组织中,在心肌细胞上主要为TWIK、TASK和TREK。此类通道对经典的钾通道阻断剂并不敏感,机械刺激、不饱和脂肪酸、pH、吸入性麻醉剂等因素则可影响其活动。KCNK通道可能作为背景钾通道,在调节心肌细胞动作电位平台期的时程、幅度及静息电位维持等方面有重要作用。     

Koch三角心肌细胞瞬间外向钾电流电生理学特征研究

目的 探讨Koch三角区心肌细胞瞬时外向钾电流(Ito)电生理学特征.方法 采用单细胞膜片钳技术研究家兔Koch三角区心肌细胞Ito电流-电压及电流密度-电压关系曲线、稳态激活以及稳态失活特征.结果 ①起搏细胞(PC)、过渡细胞α(TCα)、过渡细胞β(TCβ)、心房肌细胞(AC)和浦肯野样细胞(PL) +20 mV时的最大峰值电流(pA)幅值及峰值电流密度(pA/pF)任意两类细胞间差异均有统计学意义(P<0.05);除TCα、TCβ与PL相比外(P>0.05),各类细胞两两比较电流密度(pA/pF)差异均有统计学意义(P<0.05).②五种细胞稳态激活曲线之半数激活电压(VmIto1/2,mV)在各组细胞间差异均有统计学意义(P<0.05).但TCα与PC以及TCβ与AC和PL相比差异无统计学意义(P>0.05).③五种细胞稳态失活曲线之半数失活电压(VhIto1/2,mV)TCα、TCβ与PC和PL分别相比以及PC、AC、PL间相比差异均有统计学意义(P<0.05);TCα与TCβ、TCβ与PC、AC和PL以及PC与PL之间相比差异均有统计学意义(P<0.05),但TCα与PC、AC相比差异无统计学意义(P>0.05).结论 家兔Koch三角区各种心肌细胞之Ito存在异质性;不同心肌细胞间又具有相对特殊性及Ito梯度.     

乳鼠心肌细胞培养及纯化方法的改良

目的:改良乳鼠心肌细胞培养的方法,提高心肌细胞的单细胞收获率、存活率及搏动率。方法:在Simpson培养法的基础上探讨一种新的改良法,并将两种方法进行比较。结果:单细胞收获率1.60×10~6个/心脏;分离、消化后即刻、第5日及第8日的细胞存活率分别平均为(76.08±25.48)％、(93.32±28.67)％及(91.89±26.94)％;第5日及第8日的细胞搏动率分别平均是(91.63±25.33)％及(90.69±20.61)％,上述各项指标均高于Simpson法。结论:用改良法培养乳鼠心肌细胞时,单细胞收获率高、细胞存活率、心肌细胞和非心肌细胞分离彻底、心肌细胞纯度高。     

多非力特对豚鼠心室肌细胞的电生理作用

目的探讨多非力特对心肌细胞电生理作用的特点。方法（1）应用膜片钳全细胞技术记录单个豚鼠心室肌细胞膜延迟整流性钾流（IK）,观察不同浓度多非力特对IK的影响,并探讨IK的快速激活成分（IKr）的电生理特性。（2）标准微电极技术记录豚鼠右室乳头肌细胞动作电位,观察不同浓度多非力特灌流前后动作电位各参数的变化。结果（1）多非力特0.01～0.5μmol/L呈浓度依赖性抑制IK的时间依赖性外向钾流（IK.time）和尾电流（IK.tail）,但浓度再增大至1μmol/L后,此抑制作用趋于最大。对-20mV钳制电压下IK.time、IK.tail的抑制程度比＋50mV时更明显（P〈0.05或0.01）。（2）通道动力学分析发现,多非力特1μmol/L使IK.tail快失活过程消失,慢失活时间常数无明显变化（P〉0.05）。（3）多非力特敏感的电流成分在-40mV开始呈电压依赖性快速激活,峰值电压为0,开始出现内向整流,其IK.tail也呈电压依赖,无内向整流,但膜电位达＋20mV后达饱和,以上均符合IKr的特点。（4）多非力特对动作电位的影响：0.5和1.0μmol/L浓度下可使动作电位时程（APD30、APD90）均明显延长（P〈0.05或〈0.01）,且呈反转频率依赖性。结论多非力特对IK的作用符合特异性IKr阻滞剂的特点,并呈反转频率依赖性延长APD,是其抗心律失常作用的电生理基础。     

成年大鼠心肌细胞培养方法的建立和形态学观察

为探索稳定的成年大鼠心肌细胞的分离和培养方法 ,应用生物酶 ( 5g/L胰蛋白酶及 1 g/L胶原酶 )灌注法分离成年大鼠心肌细胞 ,用形态学及台盼蓝染色法鉴定分离的心肌细胞 ,并在光镜和电镜下观察和摄像记录。结果 :心肌细胞的存活率为 91 .7% ;存活的心肌细胞静止地贴在培养板底上 ,细胞完整 ,呈杆状 ,长宽比约为 4～ 6∶1。结果提示 :该方法是比较理想的心肌细胞培养法。     

醛固酮对新生大鼠心肌细胞凋亡的影响

目的 观察醛固酮对新生大鼠心肌细胞凋亡影响并探讨其机制.方法 取新生大鼠心肌细胞培养36 h后,加入不同浓度醛固酮(0.01～10.0 μrmol/L).分别用吖啶橙(AO)荧光染色法和流式细胞术检测心肌细胞凋亡.用免疫组化法测定心肌细胞Bcl-2和Bax蛋白的表达.结果 醛固酮加入细胞24 h后,随着其浓度的增高,凋亡细胞所占比例逐渐增加,Bax表达逐渐增强,Bcl-2表达减弱,Bcl-2/Bax比值下降,与对照组相比,差异有显著性意义(P＜0.05).结论 醛固酮明显促进心肌细胞的凋亡,且具有浓度依赖性,这可能与醛固酮能下调Bcl-2蛋白表达及上调Bax蛋白表达有关.     

缬沙坦对心房肌细胞钾电流的影响

目的:从心肌细胞电生理的角度探讨血管紧张素II受体阻断剂(ARB)类药物抗房颤的可能机制.方法:采用全细胞膜片钳技术的电压钳方法记录心房肌细胞的延迟整流钾电流(Ik).观察ARB类药物缬沙坦对豚鼠心房肌细胞离子通道电流的影响.结果:缬沙坦100μM明显抑制心房肌细胞IK的峰值电流,从(5.33±0.13)pA/pF减小至(4.49±0.48)pA/pF,P<0.05,并呈电压依赖性.结论:缬沙坦抑制心房肌细胞延迟外向钾电流,可能是引起其动作电位时程延长的一个重要因素.缬沙坦延长心房肌动作电位时程,可能在房颤的转复及房颤转复后窦性心律的维持中有价值.     

豚鼠心室肌细胞的分离及其基本电生理特性的观察

目的 分离豚鼠单个心室肌细胞,并观察其基本电生理特性.方法 Langendorff灌流,胶原酶法分离心室肌细胞;应用膜片钳全细胞模式记录心室肌细胞的动作电位和L型钙通道电流.结果 酶法分离得到存活杆状细胞达50%以上.全细胞电流钳模式下记录,细胞静息电位为(-69.9±3.4)mV,复位到95%时的动作电位时程(APD95)为(313.1±38.9)ms.全细胞电压钳模式下记录到典型L型钙通道电流.结论 该方法能够简单有效地获得性能稳定的心室肌细胞,尤其适用于膜片钳心电生理学的研究.     

人心肌细胞中NLRP3融合蛋白表达的鉴定

目的：构建人NLRP3真核表达载体并证实NLRP3融合蛋白在人心肌细胞中表达。方法以人胎脑cDNA文库为模版,PCR扩增NLRP3全长编码基因,亚克隆至pCDNA3．1-myc-his A表达载体中。将构建的重组质粒测序并转染到人心肌细胞中,提取细胞蛋白进行Western blot检测。利用流式细胞仪观察Myc-NLRP3在人心肌细胞内的作用。结果 NLRP3全长基因序列克隆到了真核表达载体 pCDNA3．1-myc-his A中,酶切鉴定片段大小为3111 bp。 Western blot检测到了融合蛋白Myc-NLRP3表达,分子量约为114 KD。 Myc-NLRP3在人心肌细胞中过表达,能够促进细胞凋亡。结论成功构建了Myc-NLRP3全长基因真核表达载体,过表达Myc-NLRP3能够促进心肌细胞凋亡。     

急性胰腺炎后心肌细胞快钠通道的变化

目的探讨急性胰腺炎后心肌细胞快钠通道的变化.方法以开腹胰管内注射牛磺胆酸钠的方法制备大白鼠急性胰腺炎实验模型,24～48 h后处死动物分离单个心室肌细胞,采用全细胞膜片钳记录技术观察心肌细胞快钠通道电流(INa)的变化,同时设假手术对照组.结果急性胰腺炎大鼠心室肌细胞的快钠电流受到抑制,电流密度-电压关系曲线上移,其峰值电流密度:对照组为(-13.55±5.33)pA/pF,急性胰腺炎组为(-6.80±2.03)pA/pF,较对照组下降了49.82%,P＜0.001;其失活曲线左移,半数最大失活电位对照组为(-105±21)mV;急性胰腺炎组为(-121±26)mV,与对照组比较显著减小,P＜0.01,失活速度加快;急性胰腺炎组INa恢复速度明显减慢,恢复时程延长,和对照组比较P＜0.01.结论急性胰腺炎后心室肌细胞的快钠通道受抑制,细胞兴奋性及传导速度下降,可能为急性胰腺炎后发生心律失常的机制之一.