载体表达siRNA抑制HBV复制与基因表达

用载体表达siRNA的方法并通过RNA干扰达到抑制乙型肝炎病毒（HBV）的复制及其基因的表达．针对HBV的S基因选取4个靶位点，并将目的基因与荧光素酶报道基因构成快速筛选系统，从4个位点中筛选到一个有效的作用位点．用半定量RT-PCR、ELISA、Western blot和荧光定量PCR等方法对筛选到的有效位点进行了验证，结果表明，siRNA成功降解了HBVS基因的mRNA，降低了S蛋白的表达水平，有效地抑制了HBV的复制．     

RNA药物抗乙型肝炎病毒的研究进展

乙型肝炎病毒(hepatitis Bvirus,HBV)导致的慢性感染已经成为威胁全球健康的主要问题之一.传统的抗乙肝药物如以拉米夫定和阿德福韦为代表的核苷类似物以及干扰素类药物在临床上都存在一定的局限性,因此寻找新的抗乙肝药物已经成为当务之急.本文主要从小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)、微小RNA(microRNA,miRNA)和配体指数富集的系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)筛选的RNA适配子这3个方面来分别阐述用小分子RNA药物抗HBV的研究进展和展望.     

盐生杜氏藻RNAi应用中的电激转化条件

采用了两种电激模式-高电场强度低电容模式下3～7kV／cm和低电场强度高电容模式下300-500V／cm转化质粒pBl221-cat；PCR扩增检测cat基因部分序列及组织化学染色法GUS检测也同时证明质粒pBl221-cat在盐生杜氏藻中瞬时表达。在此基础之上，插入pds基因的正反向重复序列，构建RNAi表达载体pBIRNAI-Dsa，电激方法转入杜氏盐藻细胞，荧光定量PCR结果表明，转入干涉载体pBIRNAI-Dsa的实验组的pds基因表达显著下降，最低达对照组的28％，表明表达受到抑制。     

HBx介导的促肝癌作用

乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）感染是诱发原发性肝癌的主要原因之一.HBV存在4个相互重叠的开放读码框：S,C,P和X区.其中X基因表达的蛋白HBx被认为是诱导肝癌发生的一种多功能致癌蛋白,它可以作用于众多信号通路及细胞因子从而诱发肝癌.本文根据最新的研究,选择其中p53和NF-κB两条信号通路及HBx与表观遗传修饰的相关性进行了探讨,目的在于部分揭示HBV感染诱发肝癌的发病机理.     

Taura 综合征病毒主要结构蛋白的表达与纯化

根据Taura综合征病毒(TSV)基因组,设计特异性引物,从感染病毒组织中提取组织总RNA后扩增,分别将3个主要结构蛋白基因VP1、VP2和VP3克隆到pGEM TEasyVector.与表达载体连接后,导入大肠杆菌中诱导表达,并纯化目的蛋白.诱导表达的融合蛋白分子量分别为54.2×103、43×103和57.1×103,在变性条件下过柱纯化VP1和VP2,一次可以纯化10mg以上纯度较高的蛋白.     

基于基因序列的乙型肝炎病毒基因分型方法的比较

采用3种不同的生物信息分析法对HBV S基因序列进行分析以鉴定HBV基因型,并比较分析各方法的优缺点。采集10例HBV慢性感染者血清,抽提HBV DNA,PCR扩增HBV S基因并测序。分别采用Clustal X软件和Bioedit软件计算S基因核苷酸和氨基酸同源性;DNAstart软件、Clustal X软件和Mega 4软件绘制S基因遗传进化树;以及在线Genotyping软件,将10例S基因序列与不同型及亚型HBV S序列比较以鉴定基因型及亚型。S基因核苷酸和氨基酸同源性计算结果显示1,3,4,5,7,8,9,10号标本与B2AF121243同源性最高,核苷酸同源性分别是98.0%,99.0%,98.8%,99.1%,99.2%,99.5%,99.5%,99.6%,而2号标本与C2 M38636同源性最高,核苷酸同源性为97.7%,6号标本与C4GQ377630同源性最高,核苷酸同源性为97.3%;构建系统树法鉴定结果为1,3,4,5,7,8,9,10号标本与B2AF121243进化距离最近,而2号标本与C2M38636进化距离最近,6号标本与C4GQ377630进化距离最近;Genotyping比对发现1,3,4,5,7,8,9,10号标本属于B基因型,2,6号标本属于C基因型。结论S基因核苷酸及氨基酸同源性的计算法可有效用于乙型肝炎病毒基因分型,是对现有分型方法系统树构建法以及在线Genotyping法的补充。     

华游蛇PLIγ的毕赤酵母表达及其抗蛇毒sPLA_2活性

抗蛇毒血清作为抗蛇伤中毒特效药,其生产和临床应用上的局限导致很多伤者得不到及时救治。PLI(phospholipase A_2 inhibitors)是蛇自身表达的解毒蛋白,它可以抑制蛇毒主要毒素PLA_2进行自我保护。我们实验室前期在华游蛇中分离到一个PLIγ,它对蛇毒PLA_2酶活性和出血毒均有强抑制效果。本研究通过酵母对华游蛇PLIγ进行表达。将PLIγ连接到pPICZαA表达载体,重组质粒通过电转化方式导入毕赤酵母GS115。在30℃、250r·min-1条件下,使用终浓度0.5%甲醇对筛选的转化子进行诱导,连续培养120h,每隔24h收集发酵液上清,用Western Bolt检测PLIγ表达水平,确定72h为最佳诱导时间。采用镍柱亲和层析分离纯化PLIγ,SDSPAGE检测纯度。活性实验表明:重组PLIγ对五步蛇蛇毒PLA2酶活的抑制效率为84%,并可以有效抑制其出血毒性。体外免疫共沉淀表明重组PLIγ与蛇毒sPLA_2IB和IIA型均存在直接相互作用。     

HBV X蛋白与宿主APOBEC3G蛋白之间的相互作用

将原核重组质粒双酶切后释放的χ基因与真核表达载体连接，构建真核重组质粒pcDNA3.1-X，然后与真核重组质粒pcDNA3.1-APOBEC3G共转染HepG2细胞，提取蛋白进行免疫共沉淀并用Western blot分析结果。免疫共沉淀后，HA-APOBEC3G融合蛋白能够在抗HBx的免疫沉淀物中检测出来，在抗HA标签的免疫沉淀物中也能检测到HBx。揭示了这两种蛋白能在受体细胞内形成复合物。结果表明乙肝病毒X蛋白与APOBEC3G蛋白在细胞内能发生相互作用，提示APOBEC3G抗HBV作用可能与乙肝病毒X蛋白有关。     

HCVNS2基因表达载体的构建及在E.coli中表达

PCR人含有丙肝病毒全长非结构蛋白的载体pBlueBac25中扩增出全长的NS2基因DNA片段,分别克隆到表达载体pQE30和转座载体pFasBacHTb的多隆位点（MCS）,PFastNS2通过转座插入穿梭载体Bacmid的表达盒;pQENS2转化JM109菌株,诱导表达出N端含有6个His的全长His的全长NS2蛋白,用Ni-NTA-agarose柱层纯化,获得提纯的全长NS2蛋白。     

海滨锦葵早期盐胁迫应答基因表达

利用cDNA扩增片段长度多态性(cDNA amplified fragment length polymorphism,cDNA-AFLP)对盐胁迫下海滨锦葵早期根和叶片的基因差异表达进行了分析.结果表明,海滨锦葵早期盐胁迫应答基因的表达模式可以分为4类:抑制表达、重新诱导、上调表达和下调表达.对38个差异表达的盐胁迫应答基因片段进行了回收测序和BLASTX比对,其中34个差异表达片段与其他物种有高度同源性,4个差异表达片段为新基因片段.进一步对其中的6个差异表达基因的转录水平进行的实时RT-PCR相对定量分析,Avp1,Nhx1和Oat在根和叶中都上调表达;Gapdh和Pmp在根中下调表达而在叶中却上调表达;Chx1在根中上调表达而在叶中却下调表达.盐生植物海滨锦葵在盐胁迫的早期阶段可能通过细胞离子区域化以调节离子平衡外,还可能在整株水平上把钠离子区域化到根部.     

小鼠B7-1cDNA克隆、测序、表达及其抗瘤效应的初步探讨

用反转录ＰＣＲ的方法,从ＢＡＬＢ／ｃ小鼠脾细胞中扩增出Ｂ７－１ｃＤＮＡ后,插入ｐｃＤＮＡ３质粒中构建成小鼠Ｂ７－１ｃＤＮＡ的真核表达载体ｐＣＤ－ｍＢ７．１,经酶切鉴定和序列分析证实此表达载体中插入的Ｂ７－１ｃＤＮＡ的序列与文献报道一致．通过脂质体介导将ｐＣＤ－ｍＢ７．１导入Ｂ７－１的小鼠黑色素瘤细胞系Ｂ１６（Ｆ０）中,经ＲＴ－ＰＣＲ和ＲＮＡ斑点杂交初步证实Ｂ７－１在肿瘤细胞中获得了稳定有效的表达．同源小鼠脾淋巴细胞与肿瘤细胞混合培养后采用ＬＤＨ释放改良法测定淋巴细胞特异杀伤活性,结果显示,与野生型和模拟转染的Ｂ１６细胞相比,Ｂ７－１基因转染的Ｂ１６细胞能较有效诱导淋巴细胞产生针对野生型Ｂ１６细胞的特异杀伤活性（ｐ＜０．０２）．这说明,将Ｂ７－１基因导入肿瘤细胞表达能提高其免疫原性,诱导有效的抗肿瘤免疫反应     

与HBV X蛋白相互作用的细胞蛋白的筛选及其鉴定

参考GenBank核苷酸序列库中的HBV的核苷酸序列设计合成了一对对应于HBx基因的引物，从原发性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)患者的血清中提取HBV基因组DNA作为模板，扩增HBx编码区并测定了核苷酸序列．将该编码区克隆到酵母双杂交系统的诱饵蛋白表达载体pGBKT7中，转入酵母细胞AH109，进行表型鉴定．然后通过Mating实验从已制备好用于酵母双杂交系统的肝cDNA表达文库中筛选与HBx相互作用的细胞蛋白，并用体外免疫共沉淀实验进一步验证．研究表明，分离得到的与HBx基因编码的蛋白相互作用的4种新的细胞蛋白，分别是醛缩酶B、C8α亚基、一种丝氨酸蛋白酶Hepsin和一种未知蛋白．     

新型双功能谷胱甘肽合成酶的真核和原核表达

通过裂解无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)菌体细胞得到基因组DNA。根据GenBank上已发表的无乳链球菌(菌种编号ATCC13813)新型双功能谷胱甘肽合成酶基因(gshF)的核酸序列与2种不同表达载体多克隆位点序列,分别设计引物F₁、R₁和F₂、R₂,再以总DNA为模板,经过特异性PCR扩增出长度约为2 200 bp的目的基因。随后分别对目的基因gshF和2种表达载体进行双酶切、连接等操作,得到表达载体pPIC9K-gshF与pET-gshF。用Sal I线性化表达载体pPIC9K-gshF后电转至毕赤酵母GS115中。经MD平板筛选重组子、菌落PCR鉴定阳性菌株、G418抗性梯度平板筛选多拷贝菌株,最终在4.0 mg·mL^-1 G418抗性平板上筛选出阳性菌株。用甲醇终浓度为2%的BMMY培养基诱导该阳性菌株表达,每隔12 h取样并添加甲醇,96 h后离心收集发酵上清,经SDS-PAGE蛋白电泳显示：在85 kDa处出现1条明显蛋白带,大小与预期GshF蛋白一致。重组菌BL21-pET-gshF用IPTG诱导表达,先在37 ℃下培养90 min,再加入IPTG至1 mmol·L^-1后诱导7 h,离心收集表达产物并对重组菌进行超声破碎处理后,进行SDS-PAGE蛋白电泳,同样在85 kDa处有1条蛋白带。采用Bradford法测定2种表达产物上清的蛋白量,其中重组酵母表达上清中蛋白量为0.46 mg·mL^-1,重组大肠杆菌表达产物破壁后的蛋白量为1.46 mg·mL^-1。测定并比较2种不同表达方式所得酶活,发现GshF在毕赤酵母表达中的比酶活仅为14.15 U·mL^-1,经原核表达后比酶活可达62.15 U·mL^-1。     

伪狂犬病毒糖蛋白H基因片段的克隆、序列测定和分析

对伪狂犬病毒湖北地方株(PRVHB株)糖蛋白H基因片段进行了扩增、克隆、序列测定和分析,比较了该序列与PRVKa株及NIA-3株三者之间的同源性.结果显示,克隆片段长1396bp,G+c含量75.6%,包括糖蛋白H(gH)N端283个氨基酸编码区及上游调控序列和胸苷激酶(TK)C端136个氨基酸编码区.gH基因ORF上游调控区存在有TATA框和CAT框的真核启动子特征结构.PRVHB株gH基因片段序列与PRVKa株和N1A-3株相应序列的核苷酸同源性相同,为99.6%.推导的gH多肽N端第1～30位氨基酸组成的肽段富含疏水性氨基酸,具有真核信号肽的序列特征.     

新型双功能谷胱甘肽合成酶的真核和原核表达

通过裂解无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)菌体细胞得到基因组DNA。根据GenBank上已发表的无乳链球菌(菌种编号ATCC13813)新型双功能谷胱甘肽合成酶基因(gshF)的核酸序列与2种不同表达载体多克隆位点序列,分别设计引物F₁、R₁和F₂、R₂,再以总DNA为模板,经过特异性PCR扩增出长度约为2 200 bp的目的基因。随后分别对目的基因gshF和2种表达载体进行双酶切、连接等操作,得到表达载体pPIC9K-gshF与pET-gshF。用Sal I线性化表达载体pPIC9K-gshF后电转至毕赤酵母GS115中。经MD平板筛选重组子、菌落PCR鉴定阳性菌株、G418抗性梯度平板筛选多拷贝菌株,最终在4.0 mg·mL^-1 G418抗性平板上筛选出阳性菌株。用甲醇终浓度为2%的BMMY培养基诱导该阳性菌株表达,每隔12 h取样并添加甲醇,96 h后离心收集发酵上清,经SDS-PAGE蛋白电泳显示：在85 kDa处出现1条明显蛋白带,大小与预期GshF蛋白一致。重组菌BL21-pET-gshF用IPTG诱导表达,先在37 ℃下培养90 min,再加入IPTG至1 mmol·L^-1后诱导7 h,离心收集表达产物并对重组菌进行超声破碎处理后,进行SDS-PAGE蛋白电泳,同样在85 kDa处有1条蛋白带。采用Bradford法测定2种表达产物上清的蛋白量,其中重组酵母表达上清中蛋白量为0.46 mg·mL^-1,重组大肠杆菌表达产物破壁后的蛋白量为1.46 mg·mL^-1。测定并比较2种不同表达方式所得酶活,发现GshF在毕赤酵母表达中的比酶活仅为14.15 U·mL^-1,经原核表达后比酶活可达62.15 U·mL^-1。     

小菜蛾颗粒体病毒DNA限制性酶切分析及基因组DNA片段克隆

小菜蛾颗粒体病毒ＤＮＡ用ＢａｍＨＩ和ＸｈｏＩ酶切，经０．７５％琼脂糖凝胶电泳，分别得到１２条带和８条带，平均分子量为１１３．０ｋｂ．用Ｓｕｐｅｒｃｏｓ１Ｃｏｓｍｉｄ作载体，将Ｓａｕ３ＡＩ部分消化的ＰｘＧＶ－ＤＮＡ随机片段插入该载体的ＢａｍＨＩ酶切位点，转化于ＸＬ１－Ｂｌｕｅ受体菌，经Ａｍｐ平板筛选转化子，挑出２５６个Ａｍｐ＋菌落，以３２Ｐ－ｄＣＴＰ标记的ＰｘＧＶ－ＤＮＡ为探针，斑点杂交筛选得到５９个阳性重组体，再经电泳检测，得到了５９个不同大小的ＰｘＧＶ－ＤＮＡ片段克隆．     

pEGFP-MEK1/Q56P重组质粒的构建及融合基因在293T细胞中的表达

构建第56位氨基酸发生突变的MEK1基因(MEK1／Q56P)与增强绿色荧光蛋白(EGFP)报道基因融合表达的真核重组质粒pEGFP-MEK1／Q56P，经限制性酶切及测序鉴定后，将其导入293T细胞中，用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达，同时进行Western blot检测。酶切鉴定及测序结果表明构建的pEGFP-MEK1／Q56P与预期结果一致，荧光观察及Western blot结果表明MEK1／Q56P和EGFP在293T细胞中能以融合蛋白的形式表达，且MEK1／Q56P能特异性活化ERK1／2，本研究成功构建了含有MEK1／Q56P的绿色荧光蛋白真核表达质粒，便于对Raf／MEK1／ERK1／2信号传导通路做进一步研究。     

猪瘟病毒RT-PCR产物的T载体克隆、测序及同源比较

利用ＴａｑＤＮＡ聚合酶的无模板延伸活性制备了可直接克隆ＰＣＲ产物的Ｔ载体，并成功地对猪瘟病毒ＨＣＬＶ株的ＲＴ－ＰＣＲ产物进行了克隆．ＤＮＡ序列测定和同源性分析表明该ＲＴ－ＰＣＲ产物是猪瘟病毒特异的，与已知序列的猪瘟病毒毒株的序列同源性均高达９６．７％～９８．７％．ＨＣＬＶ株与Ｃ株具有相同的起源，但序列比较发现它们既有共同的点突变，也有序列上的差异，表明这两株病毒在各自独立的传代过程中已发生了各不相同的遗传性变异，值得进一步比较研究．