Optimization of L-tryptophan fermentation conditions from recombinant Escherichia coil

为了提高重组大肠杆菌FB-04/pSV-04发酵生产L-色氨酸的产量,减少代谢副产物乙酸的生成,考察了比生长速率和无机盐对重组大肠杆菌发酵生产L-色氨酸的影响.在确定了合适的比生长速率和无机盐浓度之后,乙酸积累很少,L-色氨酸的产量为53.4 g/L,比优化前提高了141.6％.经30 L发酵罐初步放大,L-色氨酸的产量达53.6 g/L,发酵结果稳定,具有工业化应用前景.     

代谢副产物乙酸对L-色氨酸发酵的影响

分析了重组大肠杆菌(E.coli TRTH/pSV-709)发酵生产L-色氨酸的发酵过程,检测结果表明发酵液中有大量代谢副产物乙酸的积累。利用外源添加试验研究了乙酸对L-色氨酸发酵的影响,结果表明乙酸浓度高于2g/L时对L-色氨酸生产菌的生长和产酸均有抑制作用。分析了乙酸的产生机制,并采取了调节溶氧水平、确定合适初始葡萄糖浓度、限制葡萄糖流加及控制菌体比生长速率等措施来减少乙酸的生成。在优化条件下,乙酸含量与原工艺相比降低了51.35%,菌体生物量和L-色氨酸产量分别提高了51.07%和46.54%,实现了高密度发酵培养的目的。     

温度对大肠杆菌L-色氨酸发酵过程的影响

目的：研究变温控制对大肠杆菌TRTH L-色氨酸补料分批发酵过程中生物量、色氨酸产量、比生长速率及质粒稳定性的影响。方法：利用5L自控发酵罐对L-色氨酸补料分批发酵过程进行温度控制,对不同温度下相关参数进行分析比较,确定优化的温度控制方案。结果：以30-36％顺序升温的工艺进行发酵得到理想结果,与单一温度控制策略相比,L-色氨酸产量提高了15．4％;色氨酸的比合成速率提高了21．6％;质粒稳定性增加,未出现质粒丢失现象,质粒拷贝数保持在恒定水平。结论：温度对大肠杆菌L-色氨酸发酵有重要影响。     

3-羟基丙酸分批发酵过程中的pH控制策略研究

本文利用重组大肠杆菌以甘油为底物发酵合成3．羟基丙酸,考察了不同pH对3．羟基丙酸产量及菌体生长的影响,发现在pH6．5条件下,细胞比生长速率达到最大值,延迟期也相对较短;而pH7．0有利于3-羟基丙酸的合成,控制pH7．0可以使3-羟基丙酸产量达到7．39g／L。基于不同pH条件下对细胞比生长速率和3-羟基丙酸比生成速率的分析,提出3．羟基丙酸分批发酵过程中的pH控制策略,即在发酵过程前5h将pH控制在6．5,5h～15h控制pH为7．0,此时有利于细胞生长;而后在15h-25h控制pH为7．5,25h后控制pH为7．0,从而使细胞具有较高的3．羟基丙酸比合成速率。在此控制策略下经过34h发酵3-羟基丙酸的终产量达到8．76g／L,比pH7．0条件下的3-羟基丙酸产量提高了18．54％。     

过量表达自身hemA基因的重组大肠杆菌发酵生产5-氨基乙酰丙酸的研究

研究了优化重组大肠杆菌产5-氨基乙酰丙酸（ALA）的条件,提高大肠杆菌发酵生产AL气的产量。在测定重组大肠杆菌GT48的生长曲线的基础上,确定诱导时间,优化摇瓶发酵条件。然后,进一步在5L发酵罐上进行间歇和流加发酵研究。摇瓶实验表明,细胞培养最佳初始pH为6．5,最佳诱导时间为稳定期前期,最佳接种量为2％,过高的葡萄糖浓度对细胞生长和产物合成均有一定的抑制作用。在5L发酵罐间歇发酵中,重组菌产ALA能力达到47．8mg／L。采用流加发酵可以进一步将产物产量提高到63．8mg／L。构建的过量表达自身的hemA基因的大肠杆菌具有较高的产ALA能力,通过发酵条件优化和采用流加发酵可以提高AL气产量。     

重组大肠杆菌高密度发酵产甲羟戊酸动力学

为提高甲羟戊酸产量,探究其发酵生产规律,以重组大肠杆菌YJM16为供试菌株,进行5 L发酵罐匀速补料的高密度发酵实验,最终细胞产量达到54.48 g/L,甲羟戊酸产量达到40.43 g/L,产率为20.2%。然后根据Logistic方程、Luedeking-Piret方程和类似Luedeking-Piret方程,拟合出重组大肠杆菌高密度发酵过程中菌体生长、甲羟戊酸合成、基质消耗的动力学模型及模型参数。结果表明,甲羟戊酸的合成与重组大肠杆菌的生长速率及菌体积累量均有关。菌体生长、底物消耗模型和产物形成模型拟合度R2分别达到了0.931 9、0.957 8和0.975 1,可用于描述利用重组大肠杆菌高密度发酵生产甲羟戊酸过程。     

基因重组大肠杆菌表达类人胶原蛋白诱导条件优化研究

为了提高重组大肠杆菌BL21高密度发酵生产类人胶原蛋白的产量,分别研究了诱导时机、乙酸浓度、诱导强度以及补氮方式对外源基因表达的影响,并对各因素进行了优化。采用补料-分批式发酵,初始装液体积为6L。最终细胞密度可达到84.3g／L,类人胶原蛋白的表达量为14.6g/L。结果表明:在对数生长的中后期进行诱导,尽量减少乙酸的积累量,42℃诱导3h后降温至39℃继续诱导,并采用每隔10min补36ml补料氮溶液的周期操作方式,有利于细胞的生长和外源蛋白的表达。     

大肠杆菌色氨酸转运系统多基因敲除对色氨酸生产的影响

大肠杆菌中色氨酸向胞内的转运主要是由mtr、tnaB和aroP 3个基因编码的通透酶进行调控.利用Red重组技术,在mtr单基因敲除菌的基础上,成功构建了mtr.tnaB和mtr.aroP双基因敲除菌以及mtr.tnaB.aroP三基因敲除菌,并通过发酵实验首次考察了色氨酸转运系统多基因缺失对大肠杆菌合成色氨酸的影响.发酵结果表明,mtr.tnaB和mtr.aroP双基因缺失后,色氨酸产量分别达到1.38 g/L和1.27 g/L,与出发菌株相比分别提高了17％和9％,而mtr.tnaB.aroP三基因缺失后,菌体生长受到了明显抑制,发酵后色氨酸产量仅为0.63 g/L.在补料分批发酵实验中,mtr.tnaB双基因敲除菌的色氨酸产量进一步提高至12.2 g/L,与出发菌株相比色氨酸产量提高了27％.     

利用三阶段葡萄糖添加策略减少乙酸合成并促进重组大肠杆菌生产L-苯丙氨酸

为了降低副产物乙酸的积累和提高L-苯丙氨酸的产量,分别优化了L-苯丙氨酸发酵的初始葡萄糖浓度和葡萄糖的指数流加策略.结果表明,20 g/L的初始葡萄糖浓度可以控制细胞的比生长速率低于临界值0.3 h-1,显著地降低了乙酸的积累,提高了L-苯丙氨酸的产量.采用预设比生长速率μ3* =0.4(h-1)进行葡萄糖的指数流加取得了实际最大比生长速率0.29 h-1,使细胞的比生长速率低于临界值,促进了L-苯丙氨酸的合成,最终获得L-苯丙氨酸的产量达48.45 g/L,比本实验室原有水平提高了37％.     

丙酮酸钠对E．coli CCTCCM208088发酵生产聚唾液酸的影响

研究了丙酮酸钠对E．coliCCTCCM208088发酵生产聚唾液酸的影响。首先在摇瓶水平上优化了丙酮酸钠的添加策略：发酵初始培养基中添加6g／L丙酮酸钠,聚唾液酸的产量达到最高水平3．47g／L,相比空白相比提高了73％,聚唾液酸产率（YP／（x．s））提高了125％。在30L发酵罐中,添加丙酮酸钠使聚唾液酸产量达到了6．6g／L,相对照提高了53．5％。通过有机酸分析,添加丙酮酸钠增强了菌体内三羧酸循环．可能导致胞内能荷水平的提高．从而促进了聚唾液酸的合成。     

Relieving effects of glycine and methionine from acetic acid inhibition in Escherichia coli fermentation

Among amino acids screened for their potential to relieve wild and recombinant Escherichia coli from the negative effects of acetic acid, glycine, and methionine showed a sparing effect. In the presence of 2 g/L of acetic acid, addition of 0.5 g/L of glycine or methionine resulted in either a complete recovery or a further enhancement in the specific growth rate, while the enhancement was significant but not fully complete in the presence of 4 g/L of acetic acid. The addition of 0.5 g/L of methionine alleviated the negative effect of acetic acid on recombinant E. Coli growth to produce more beta-lactamase, which was encoded by plasmid pUC18. In continuous fermentation the methionine effect on recombinant. E. coli metabolism depended on dilution rate; at high dilution rates, above 0.4 h(-1), the methionine addition enhanced beta-lactamase production and reduced acetic acid formation, while at low dilution rates, below 0.3 h (-1), the effect was reversed. In def-batch fermentation with wild-type E. Coli, cell growth rate and cell yield from glucose were enhanced with methionine addition, while the acetic acid concentration reached over 4 g/L. (c) 1993 John Wiley & Sons, Inc.     

响应面分析优化L-色氨酸清液发酵培养基

L-色氨酸是八种必需氨基酸之一,随着L-色氨酸应用市场的不断扩大,进行发酵法生产L-色氨酸的研究具有重要的现实意义。为了提高L-色氨酸产量,本文利用响应面分析法对L-色氨酸清液发酵培养基进行优化。利用优化培养基进行发酵,考察清液发酵对L-色氨酸发酵过程中生物量、L-色氨酸产量、副产物生成量的影响。结果表明:在优化条件下利用清液发酵培养基发酵,乙酸含量与原工艺相比降低了(6.75±1.26)%,L-色氨酸产量提高了(16.54±1.15)%,实验值与响应面分析预测值基本相符。     

重组大肠杆菌利用蔗糖及糖蜜发酵生产丁二酸

富含蔗糖的甘蔗糖蜜可作为制备丁二酸的廉价原料。然而生产丁二酸的潜力菌株大肠杆菌Escherichia coli AFP111不能代谢蔗糖。为了使其具有蔗糖代谢能力,将E.coli W中非PTS蔗糖利用系统蔗糖通透酶的编码基因csc B,果糖激酶的编码基因csc K和蔗糖水解酶的编码基因csc A克隆并表达到AFP111中,获得重组菌株AFP111/p MD19T-csc BKA。经厌氧发酵验证,重组菌株72 h消耗20 g/L蔗糖,丁二酸产量达到12 g/L。在3L发酵罐中采用有氧阶段培养菌体、厌氧阶段发酵的两阶段发酵方式,厌氧发酵30 h,重组菌株以蔗糖和糖蜜为碳源丁二酸产量分别为34 g/L和30 g/L。结果表明,通过外源引入非PTS蔗糖利用系统,重组菌株具有较强的代谢蔗糖生长及合成丁二酸的能力,并且能够利用廉价糖蜜发酵制备丁二酸。     

A balanced DO-stat and its application to the control of acetic acid excretion by recombinant Escherichia coli

During fed-batch cultivation of a recombinant Escherichia coli AT2471 harboring plasmid pSY130-14 for phenylalanine production, a large amount of acetic acid was excreted by the cells and accumulated in the culture medium. Acetic acid concentration reached 30-35 g/L at the end of a process conducted without special precautions for the reduction of this excretion. Cell growth stopped when acetic acid concentration was about 15 g/L, resulting in poor growth, 16 g/L cell concentration, and poor production - 8 g/L phenylalanine. A novel control strategy, called a balanced DO-stat. was developed to prevent acetic acid excretion. It represents a model-independent two-loop control structure, which is simple, reliable, and convenient for computer application. Using the balanced DO-stat, implemented in a computer control system, acetic acid concentration was kept at zero during the entire cultivation period. As a result, the cell concentration increased to 36 g/L and phenylalanine concentration reached 24 g/L. Aside from the phenylalanine fermentation, the proposed control approach might be applied to cultivation of other bacterial and yeast strains which have similar mechanism of the excretion of fermentative by-products.     

过量表达苹果酸脱氢酶对大肠杆菌NZN111产丁二酸的影响

大肠杆菌NZN111是敲除了乳酸脱氢酶的编码基因 (ldhA) 和丙酮酸-甲酸裂解酶的编码基因 (pflB) 的工程菌,厌氧条件下由于辅酶NAD(H) 的不平衡导致其丧失了代谢葡萄糖的能力。构建了苹果酸脱氢酶的重组菌大肠杆菌NZN111/pTrc99a-mdh,在厌氧摇瓶发酵过程中通过0.3 mmol/L的IPTG诱导后重组菌的苹果酸脱氢酶 (Malate dehydrogenase,MDH) 酶活较出发菌株提高了14.8倍,NADH/NAD+的比例从0.64下降到0.26,同时NAD+和NADH浓度分别     

产琥珀酸重组大肠杆菌的发酵性能研究

研究了重组大肠杆菌JM001(△ppc)/pTrc99a-pck发酵产琥珀酸的性能,结果表明厌氧条件下其耗糖能力和产酸能力分别为对照菌株JM001的4.2倍和15.3倍。进一步优化发酵条件表明：采用接入菌泥的发酵方式比按照10%接种量转接厌氧发酵的效果要好,琥珀酸的对葡萄糖的质量收率提高了约10%,且副产物乙酸的量进一步降低。初始葡萄糖浓度高于60g/L时会对菌株的生长和产酸产生抑制,且浓度越高,抑制作用越明显。7L发酵罐放大实验中,整个厌氧发酵阶段葡萄糖的消耗速率为0.42g/(L.h),琥珀酸对葡萄糖的质量收率为67.75%,琥珀酸的生产强度为0.28g/(L.h)。     

丙氨酸转氨酶修饰对大肠杆菌L-色氨酸合成的影响

探究大肠杆菌细胞内负责L-丙氨酸合成的转氨酶对菌株代谢及L-色氨酸合成的影响。运用Red重组技术分别对编码L-丙氨酸转氨酶的基因alaA、alaC和avtA进行敲除。通过摇瓶和50 L罐中探究其对L-色氨酸积累、L-丙氨酸代谢及菌体生长变化情况。结果显示,除3种L-丙氨酸转氨酶全部缺失的工程菌L-丙氨酸合成受阻、菌体生长受到较强抑制外,其它各任意一种或两种丙氨酸转氨酶缺失菌株的生长并未有较大差异,但色氨酸的合成变化显著。其中alaA和alaC双基因缺失的E.coli FS-T4工程菌,摇瓶发酵L-色氨酸产量达6.08 g/L,L-丙氨酸含量仅0.16 g/L,较出发菌株分别提高了26.7%和降低了91.0%。在50 L罐中E.coli FS-T4工程菌L-色氨酸产量最高可达41.9 g/L,糖酸转化率达20.5%,分别较出发菌株提高了13.8%和5.1%。转氨酶AlaA和AlaC的同时缺失,既可以满足细胞整体氨基酸池的需要,而且有利于减少杂酸的积累,使得更多的碳源流向L-色氨酸的合成。