单胚胎玻璃化冷冻对小鼠胚胎体外发育的影响

目的:比较单胚胎玻璃化冷冻与慢速冷冻对小鼠分裂期胚胎损伤和体外发育的影响,探讨使用玻璃化冷冻保存大量胚胎的可行性。方法:选择8-细胞胚胎随机进行改良的玻璃化和慢速冷冻,复苏后培养至囊胚孵出,计数胚胎复苏率、卵裂球死亡率、囊胚形成率、细胞团数、孵出率,并进行组间比较分析。结果:玻璃化冷冻组复苏率、卵裂球死亡率、囊胚形成率、孵出率、细胞团数分别为100%、12.7%、75.7%、66.4%、112,慢速冷冻组分别为87.1%、31.0%、35.5%、58.7%、78,除囊胚孵出率其余各指标两组间差异均具有统计学意义。结论:单胚胎玻璃化法冻存小鼠分裂期胚胎复苏后细胞成活率高,结构完整,更好的保持了胚胎的发育潜能。     

改良程序化慢冻提高活检人胚胎的冻存率

[目的]探讨及Jericho改良方案用于冷冻活检后胚胎的效能.[方法]将92个质量相对较好的废弃人胚胎随机分配到单纯冷冻组(n=30),胚胎活检后标准程序化慢冻组(n=32)及胚胎活检后Jericho改良程序化慢冻组(n=30).将活检后的胚胎继续培养6～10 h,3组胚胎同时进行冷冻.观察各组胚胎冷冻解冻后的冻存率及囊胚形成率.[结果]活检胚胎采用Jericho改良方案冷冻后,胚胎存活率、完整率及囊胚率分别为73%,40%和23%,较活检后标准冷冻组(16%,13%和3%)显著提高(P值分别<0.001,0.05,0.05),达到单纯冷冻组的水平(P均>0.05).[结论]采用Jericho改良方案冷冻活检人胚胎优于目前的标准化慢冻方案,Jericho方案冷冻后的胚胎具备良好的发育潜能.     

应用两种麦管系统对小鼠囊胚的玻璃化冷冻

目的比较两种麦管系统对小鼠囊胚的玻璃化冷冻比较,以期建立一种有效的囊胚冷冻方法。方法分别应用开放麦管系统和传统麦管系统对小鼠扩张囊胚进行玻璃化冷冻,比较冷冻复苏以后囊胚的存活率和孵出率。结果应用开放麦管系统冷冻的小鼠囊胚复苏后的存活率(82.3%)显著高于应用传统麦管系统者(68.6%, P<0.01)。前者冷冻的小鼠囊胚复苏后的囊胚孵出率(70.3%),也明显高于应用传统麦管系统者(57.1%, P<0.05)。结论应用开放性麦管系统进行小鼠囊胚的玻璃化冷冻是一种行之有效的冷冻方法。     

不同浓度冷冻保护剂乙二醇在人扩张囊胚玻璃化冷冻中的应用

目的研究不同浓度冷冻保护剂乙二醇(ethlene glycol,EG)在人扩张囊胚玻璃化冷冻中的应用。方法不同浓度EG 15%,30%,40%,联合15%二甲基亚砜(dimethylsulphoxide,DMSO),0.5 mol/L蔗糖(sucrose),采用两步法,利用改制半麦管为冷冻载体,玻璃化冷冻人扩张囊胚。比较解冻后囊胚存活率,扩张率及孵出率;并比较微吸管吹吸、辅助孵化针刺破胞膜辅助脱水及未辅助脱水对冷冻扩张囊胚的影响。结果由1原核(pronucleus, PN)发育而来的扩张囊胚玻璃化冷冻解冻后囊胚存活率15%EG组明显高于30%及40%EG组(P<0.05)。由2PN 发育成的扩张囊胚玻璃化冷冻解冻后囊胚孵出率15%EG组明显高于30%及40%EG组(P<0.05)。在冷冻过程中给予人工辅助脱水组解冻后囊胚孵出率明显高于未辅助脱水组(P<0.05)。微吸管吹吸组与辅助孵化针刺破胞膜辅助脱水组囊胚孵出率差异无显著性(P>0.05)。结论15%EG为人扩张囊胚玻璃化冷冻中有效和合适浓度。玻璃化冷冻中给予人工辅助脱水,能提高解冻后囊胚的发育潜能。     

抗冷冻蛋白Ⅲ对小鼠胚胎冷冻保护的作用

目的将抗冷冻蛋白III(AFPIII)应用于小鼠2-细胞期胚胎玻璃化冷冻保存,观察其对细胞微丝骨架结构和冷冻复苏后发育潜能是否有保护作用。方法收集小鼠2-细胞期胚胎1 200枚,随机分为新鲜对照组、玻璃化冷冻组和添加AFPIII玻璃化冷冻组(AFPIII终浓度为500 ng/mL),每组400枚,其中200枚胚胎进行复苏后囊胚培养,200枚进行细胞微丝的免疫荧光染色,比较各冷冻组胚胎复苏存活率和其后的囊胚形成率以及各组微丝完整胚胎比率。结果添加AFPIII玻璃化冷冻组胚胎复苏率高于玻璃化冷冻组,差异有统计学意义(P<0.05)。新鲜对照组和添加AFPIII玻璃化冷冻组囊胚形成率、微丝完整胚胎比率均高于玻璃化冷冻组,差异有统计学意义(P<0.05);新鲜对照组和添加AFPIII玻璃化冷冻组之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论 AFPIII对小鼠2-细胞期胚胎玻璃化冷冻有保护作用。     

慢速程序冷冻对透明带显微操作后人类胚胎冻存率及发育的影响

[目的]探讨慢速程序冷冻对透明带显微操作后胚胎冻存率及继续发育的影响.[方法]将96个Ⅱ级以上人类多精受精胚胎随机分为单纯透明带打孔组(n=24),胚胎活检组(n=40)及对照组(n=32).为模拟临床种植前诊断活检后胚胎冷冻过程,将透明带显微操作后胚胎继续培养6～10 h再进行慢速程序冷冻,观察各组胚胎冷冻解冻后的冻存率及胚胎继续发育能力.[结果]活检及透明带打孔后冻融胚胎中发生裂解的卵裂球多位于透明带破口附近.活检组胚胎完整率、胚胎存活率及卵裂球存活率分别为10%,25.0%和29.0%,较对照组(43.7%,66.0%和62.4%)明显降低(P<0.01).虽然单纯透明带打孔组冷冻后胚胎完整率及胚胎存活率与活检组无明显差异,但卵裂球存活率较胚胎活检组高(分别为40.9%和29.0%)(P<0.01),以上各组存活胚胎继续发育率差异无显著性(P>0.05).[结论]以丙二醇和蔗糖为冷冻保护剂的人类分裂期胚胎慢速冷冻程序并不适用于化学法透明带打孔活检胚胎的冷冻保存,有关人类活检后胚胎的冷冻保存方法值得进一步探讨.     

囊胚解冻过夜培养后移植对妊娠结局的影响

【目的】 比较行囊胚移植的复苏周期中,解冻后经2 ~ 3 h培养或过夜培养后移植对妊娠结局的影响?【方法】 回顾性分析本中心2010年9月至2012年10月进行复苏周期囊胚移植的523个周期资料,按照解冻后至移植前时间不同分为2组:解冻2 ~ 3 h后当天移植(0TET,n = 247)?提前1 d解冻过夜培养后移植(1TET,n = 276),对其妊娠结局进行比较?【结果】1TET组与0TET组相比移植了较少的胚胎个数(1.6 vs. 1.8,P < 0.001),获得较高的妊娠率(57.6% vs. 56.3%)?种植率(46.3% vs. 44.1%)和较低的流产率(9.4% vs. 12.2%)?多胎率(28.3%vs. 36.7%)?但除移植胚胎个数外,其他各妊娠结局指标的差异无统计学意义?人工周期(HRT)作内膜准备获得较高的妊娠率(62.8% vs. 53.0%,P = 0.027)?单囊胚移植周期分析发现,第5天发育为囊胚的胚胎比第6天的囊胚具有较高的种植率 (57.6% vs. 36.1%, P = 0.004)【结论】 提前1 d解冻囊胚过夜培养后再移植不会影响主要妊娠结局?影响妊娠率的因素有内膜准备方法和发育为囊胚的天数?降低多胎率可考虑D5单囊胚移植?     

激光法活检对小鼠体外受精胚胎后期发育的影响

目的探讨激光法活检技术对胚胎早期发育的影响。方法对促排卵获取的小鼠卵母细胞进行体外受精和培养,然后用激光法活检收集的4细胞和8细胞胚胎,最后观察活检后胚胎的发育情况。结果共获卵母细胞360枚,受精率和卵裂率分别为92.0%和94.3%。4-细胞胚胎活检组的囊胚形成率及孵出囊胚率分别为76.6%和65.6%,8-细胞胚胎活检组的囊胚形成率及孵出囊胚率为70.4%和59.3%,分别与未活检对照组相比,差异无显著性(P>0.05);4-细胞活检组和8-细胞活检组的囊胚形成率及孵出囊胚率间相比较,差异也无显著性(P>0.05)。结论激光法对小鼠4细胞或8细胞胚胎进行单卵裂球活检,不影响胚胎的后期发育,是一项有效的胚胎卵裂球活检方法。     

自制载体冷冻小鼠原核期胚胎效果分析

目的 探讨自制冷冻载体冷冻保存昆明小鼠体内原核期胚胎的可行性.方法 首先,比较了两种流行的商业化载体:开放式拉长麦管(open pulled straw,OPS)和冷冻帽(cryotop)开展小鼠原核胚玻璃化冷冻保存效果.其次,以cryotop为对照,利用自制简易载体(cryotip)开展小鼠原核期胚胎的玻璃化冷冻保存.之后,利用ANOVA对各组胚胎在复苏后的体外培养卵裂率、囊胚率进行统计分析.结果 OPS和cryotop两组之间,胚胎在玻璃化冷冻/复苏后发育的2-细胞率、4-细胞率和囊胚率差异均无显著性(P＞0.05),但cryotop冷冻效果更接近对照组;cryotip玻璃化冷冻载体与cryotop相比,胚胎复苏后各组差异均无显著性(P＞0.05),数值上除了2-细胞发育率外,cryotip其他几项结果都稍微高于cryotop组.结论 OPS,cryotop,cryotip冷冻保存昆明小鼠体内原核期胚胎均是可行的;cryotop在冷冻效果上要优于OPS,笔者自制的cryotip因其成本低,制作简单,操作安全可靠,在实验中替代昂贵的商业化载体OPS和cryotop是可行的.     

小鼠胚胎成纤维细胞与人胚共培养对胚胎体外发育影响

[目的]评价小鼠胚胎成纤维细胞共培养是否促进d3质量差的人胚胎的囊胚发育。[方法]使用小鼠胚胎成纤维细胞与受精后第3天(d 3)质量差的胚胎共培养,对照组使用Quins囊胚培养液进行序贯培养,观察各阶段囊胚形成率,检测囊胚总细胞数。[结果]d5共培养组12.3％胚胎开始出现早期囊腔化,d 6 7.4％胚胎出现囊腔扩张,4.2％的胚胎d 7孵出。而序贯培养组d 5仅4.2％胚胎开始早期囊腔化,d 6仅1.5％胚胎出现囊腔扩张,d 7仅0.6％的胚胎孵出,表明共培养组囊胚形成率更高,囊胚发育速度快于对照组。此外,共培养组囊胚总细胞数更多,d 6扩张囊胚总细胞数为62.6±13.4,而未扩张囊胚总细胞数26.1±8.9,分别高于序贯培养组。[结论]小鼠胚胎成纤维细胞共培养与 Quins囊胚培养液序贯培养比较,前者更能促进d 3质量差的人胚胎体外发育。     

细胞松弛素B和解冻方法对玻璃化冷冻小鼠卵母细胞的影响

【目的】探讨细胞松弛素B和解冻程序对玻璃微细管法（GMP）玻璃化冷冻小鼠卵母细胞的影响。【方法】以小鼠MII期卵母细胞为模型，研究冷冻前细胞松弛素B预处理、不同解冻程序对小鼠卵母细胞冷冻效果的影响；随后对经GMP玻璃化冷冻的卵母细胞直接进行培养以检测冷冻是否诱发孤雌发育。【结果】与对照组相比．细胞松弛素B预处理的卵母细胞存活率、受精率、卵裂率及囊胚率没有显著差异（89．3％vs91．3％．44．0％vs40．4％，30．0％vs27．7％，4．0％vs6．4％；P〉0．05）；采用连续浓度梯度递减解冻法的受精率明显高于间断浓度梯度递减解冻法（57．4％vs40．4％；P〈0．05），且前者的卵裂率和囊胚发育率也相对较高f40，2％vs27，7％，14．5％vs6．4％；P〉0．05）。冷冻复苏后卵母细胞的孤雌发育率稍高于未经冷冻的卵母细胞（17．1％vs3．2％；P〉0．05）。【结论】细胞松弛素B预处理对MII期小鼠卵母细胞的GMP玻璃化冷冻保存效果没有影响：采用连续浓度梯度递减解冻法能明显提高复苏后卵母细胞的体外发育能力。     

细胞松弛素B和解冻方法对玻璃化冷冻小鼠卵母细胞的影响

 【目的】探讨细胞松弛素B和解冻程序对玻璃微细管法（GMP）玻璃化冷冻小鼠卵母细胞的影响。【方法】以小鼠MII期卵母细胞为模型，研究冷冻前细胞松弛素B预处理、不同解冻程序对小鼠卵母细胞冷冻效果的影响；随后对经GMP玻璃化冷冻的卵母细胞直接进行培养以检测冷冻是否诱发孤雌发育。【结果】与对照组相比．细胞松弛素B预处理的卵母细胞存活率、受精率、卵裂率及囊胚率没有显著差异（89．3％vs91．3％．44．0％vs40．4％，30．0％vs27．7％，4．0％vs6．4％；P〉0．05）；采用连续浓度梯度递减解冻法的受精率明显高于间断浓度梯度递减解冻法（57．4％vs40．4％；P〈0．05），且前者的卵裂率和囊胚发育率也相对较高f40，2％vs27，7％，14．5％vs6．4％；P〉0．05）。冷冻复苏后卵母细胞的孤雌发育率稍高于未经冷冻的卵母细胞（17．1％vs3．2％；P〉0．05）。【结论】细胞松弛素B预处理对MII期小鼠卵母细胞的GMP玻璃化冷冻保存效果没有影响：采用连续浓度梯度递减解冻法能明显提高复苏后卵母细胞的体外发育能力。     

囊胚期冷冻胚胎移植的临床应用探讨

目的探讨囊胚期冷冻胚胎移植的临床应用价值.方法对2002年10月～2003年12月在湘雅医院生殖医学中心接受囊胚培养并行囊胚期冷冻胚胎移植的病例进行分析,了解囊胚期与卵裂期冷冻胚胎解冻后的胚胎成活率、植入率及妊娠率.结果冷冻囊胚解冻后胚胎数、胚胎成活率、植入率和妊娠率与卵裂期冷冻胚胎无显著差别(P＞0.05),囊胚解冻后经15 h过夜培养,42枚中有22枚成活,其中8枚Ⅰ,Ⅱ级继续发育或囊胚腔扩张,3例获得妊娠,妊娠率为37.5%.结论囊胚期冷冻胚胎移植同样能达到卵裂期冷冻胚胎移植的临床效果,同时增加解冻与移植间隔时间可更好地选择冻融囊胚移植,对提高妊娠率可能有一定意义.     

冷冻治疗对G422胶质瘤细胞凋亡的影响

目的 研究局部冷冻对G422胶质瘤细胞凋亡及其调控机制的影响。方法 建立小鼠脑胶质瘤动物模型,于冷冻治疗后6、12、24、48、72 h留取标本,用光镜、末端标记法(TUNEL)、DNA凝胶电泳检测细胞凋亡,用免疫组化技术检测凋亡相关基因bcl-2、bax的表达产物。结果G422胶质瘤经冷冻治疗后,冷冻灶中心区呈坏死改变,冷冻周边区出现凋亡的形态学改变,DNA呈“梯状”降解,冷冻后各时间点凋亡细胞数目均明显多于对照组(P<0.01)。bax表达阳性细胞数也多于对照组(P<0.05),而冷冻对bcl-2表达无明显影响。结论 除坏死外,诱导细胞凋亡可能是冷冻杀伤胶质瘤细胞的另一重要机制;这种细胞凋亡可能是通过上调bax基因的表达来实现。     

冷冻胚胎解冻移植264个周期临床分析

 【目的】探讨影响冷冻胚胎解冻移植妊娠率的因素。【方法】收集2001年11月到2006年1月264位病人在本中心进行冷冻胚胎解冻移植264个周期的资料,进行回顾分析。【结果】264个周期中有67个周期妊娠,周期妊娠率25.38%。妊娠组平均每次移植胚胎个数多于非妊娠组(2.84±0.57 vs 2.45±0.82,P<0.05),移植1个、2个、3个及以上冷冻解冻胚胎的妊娠率分别为9.38%、18.67%、38.22%,其中移植3个及以上胚胎者的妊娠率高于移植1个和2个胚胎者的妊娠率(P<0.05)。胚胎解冻后体外培养24h平均细胞数增长率≥50%者的妊娠率(34.43%)高于增长率<50%者(17.28%),P<0.05,至少移植一个胚胎细胞数在6细胞及以上的周期妊娠率明显高于移植胚胎细胞数小于6细胞的周期(35.85% vs 16.67%,P<0.05);移植Ⅰ级胚胎与Ⅱ级胚胎的妊娠率分别为35.26%、17.58%,P<0.05。新鲜移植周期妊娠者其冻融周期妊娠率为42.86%,而在新鲜移植周期未妊娠者其冻融周期妊娠率为28.31%,差异有显著性,P<0.05。自然周期、激素替代周期妊娠率分别为28.21%、21.30%，无统计学差异。LH峰日内膜厚度及类型无统计学差异。【结论】移植胚胎的个数、质量、发育潜能、原新鲜周期的结局影响冷冻胚胎移植能否妊娠。     

解冻复苏囊胚行植入前遗传学检测临床结局分析

目的 分析二次冷冻、二次活检(DFDB)囊胚和二次冷冻、一次活检(DFSB)囊胚行植入前遗传学检测(PGT)的临床结局相关资料，旨在扩大现有数据，为冻融胚胎PGT的临床价值和安全性问题提供一定的指导。方法 回顾性分析38例行解冻复苏囊胚患者的PGT周期临床资料，依据囊胚活检次数的不同，分为DFDB组和DFSB组。冷冻方法均为玻璃化冷冻。结果 DFDB组共24例患者，上个PGT周期未获诊断的囊胚共34枚，解冻后存活32枚，解冻囊胚存活率为94.12%。这32枚囊胚二次活检后，行遗传学检测，正常囊胚15枚(46.88%),异常囊胚数17枚(53.13%)。DFSB组共14例患者，共解冻复苏上个单精子胞浆内显微注射(ICSI)周期剩余的50枚囊胚，50枚囊胚解冻后均存活。活检这50枚囊胚，再进行遗传学分析，47枚囊胚诊断明确，其中正常囊胚9枚(18%),异常囊胚28枚(56.00%),嵌合体囊胚为10枚(20.00%),未获诊断的囊胚数为3枚(6.00%)。DFDB组和DFSB组分别有8例患者和5例患者解冻移植，解冻后囊胚均存活，分别临床妊娠5例和3例，各活产1例，活产婴儿均健康。结论 DF...     

叶酸在玻璃化冷冻中对小鼠卵母细胞的影响

目的探讨叶酸对小鼠卵母细胞玻璃化冷冻的影响。方法将卵母细胞随机分为新鲜组、玻璃化冷冻组、叶酸低、中、高剂量(50、100和200mg/L)组。比较各组卵母细胞内还原型谷胱甘肽(GSH)含量、活性氧(ROS)水平以及卵母细胞存活率、受精率、卵裂率、囊胚形成率。结果低、中、高剂量的叶酸均可增加卵母细胞内GSH含量(F=23.814,P<0.01),降低卵母细胞内ROS水平(F=11.209,P<0.01),提高卵母细胞存活率、受精率、卵裂率、囊胚形成率(χ2=124.815、21.117、15.172和9.834,P<0.05)。结论叶酸对玻璃化冷冻卵母细胞具有保护作用,可能与其抗氧化作用相关。     

加味芍药甘草汤对人子宫腺肌病病灶细胞超微结构及细胞凋亡的影响

【目的】观察加味芍药甘草汤对人子宫腺肌病病灶细胞超微结构及凋亡率的影响。【方法】采用胶原酶消化法培养人子宫腺肌病病灶细胞,采用免疫细胞化学方法鉴定子宫腺肌病病灶细胞,将加味芍药甘草汤分为高、中、低浓度组(浓度分别为40、20、10 mg/mL),另设空白对照组及米非司酮组(浓度为1×10-5mol/L),各组药物作用于子宫腺肌病病灶细胞24、48 h后,采用透射电镜观察细胞超微结构,流式细胞术检测细胞凋亡率。【结果】电镜下加味芍药甘草汤及米非司酮干预后的细胞出现细胞核形态改变,胞浆中溶酶体增多,线粒体及内质网扩张等细胞凋亡早期特点。各组药物干预24、48 h后细胞凋亡率显著升高,与空白对照组比较差异均有统计学意义(P0.05);米非司酮组、加味芍药甘草汤高浓度组细胞凋亡率与加味芍药甘草汤中、低浓度组比较差异均有统计学意义(P0.05);加味芍药甘草汤各浓度组干预后24 h与48 h比较,差异均有统计学意义(P0.05),具有一定的量效与时效关系。【结论】加味芍药甘草汤治疗子宫腺肌病的作用机制可能与改变人子宫腺肌病病灶细胞超微结构以提高细胞凋亡率有关。     

KSOM培养基营养成分调整对小鼠植入前期胚体外发育的影响

目的囊胚发育率低和发育迟缓是继““2-细胞阻滞““解决后小鼠胚胎体外培养中面临的两大问题.本实验通过对 KSOM培养基营养成分的调整,观察对胚胎发育的影响,优化培养基的构成.方法采用微滴培养法培养昆明小鼠单细胞胚胎,以胚胎发育到囊胚的比例、孵出比例以及注射hCG后120 h囊胚全细胞数作为判断培养效果的标准,比较 KSOM在葡萄糖、牛血清白蛋白、氨基酸3种营养物质不同浓度下对小鼠植入前胚体外培养的效果.结果在未加氨基酸时葡萄糖、牛血清白蛋白的变化对注射hCG后120 h囊胚形成率、囊胚全细胞数影响不大,添加氨基酸后,囊胚发育速度提高,部分孵出和全部孵出比例提高,囊胚全细胞数增大明显,且葡萄糖、牛血清白蛋白与氨基酸对囊胚的发育有共同促进的作用.结论通过添加适量的氨基酸、葡萄糖、BSA改良KSOM培养基能很好的促进小鼠植入前胚体外发育.     

新鲜周期和复苏周期囊胚培养及移植的临床结局分析

目的:比较新鲜周期和复苏周期囊胚培养及移植的临床结局,探讨囊胚移植的最佳方案。方法:回顾分析2012年1月至2014年8月在郑州大学第三附属医院生殖中心行常规体外受精/卵胞质内单精子注射-胚胎移植(IVF/ICSI-ET)患者的临床资料。根据培养方式分为A组(新鲜胚胎行囊胚培养后移植,58个周期)、B组(新鲜胚胎行囊胚培养冷冻复苏后移植,285个周期)和C组(冷冻胚胎复苏后行囊胚培养再移植,84个周期)。比较新鲜胚胎和冷冻胚胎复苏后的囊胚形成率及可利用囊胚形成率以及3组患者的囊胚种植率、生化妊娠率、临床妊娠率、多胎率和早期流产率等指标。结果:新鲜胚胎的囊胚形成率及可利用囊胚形成率均高于冷冻胚胎(χ2=8.561和4.037,P<0.05);3组患者的生化妊娠率、临床妊娠率及早期流产率比较差异有统计学意义(χ2=44.376、6.255和9.167,P<0.05),B组患者的生化妊娠率及临床妊娠率均高于A组,早期流产率低于A组;3组间囊胚种植率和多胎率比较差异无统计学意义(χ2=4.234、1.172,P>0.05)。结论:新鲜胚胎较冷冻胚胎有较高的囊胚形成率,新鲜囊胚冷冻后择期复苏移植能提高患者的妊娠率,是目前最佳的囊胚培养和移植方案。