日本脑炎病毒E蛋白在酵母双杂交系统中的表达及其对报告基因激活作用的检测

用日本脑炎病毒(JEV)E蛋白基因片段构建酵母双杂交诱饵载体,并检测其表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用。用RT—PCR从JEV感染的鼠脑中扩增出JEV E蛋白基因片段,克隆入pUCl9质粒,经测序正确后,再亚克隆入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中。将重组质粒导入酵母菌AHl09,检测其表达产物在酵母细胞中对报告基因有无激活作用。成功获得JEV E蛋白基因片段,表达的E蛋白对酵母菌AHl09无毒性,对报告基因亦无激活作用。为利用酵母双杂交GAL4系统3进行JEV细胞受体蛋白的研究奠定了基础。     

人类RhoxF1蛋白的生物信息学分析及其自激活检测

目的：生物信息学分析人类RhoxF1蛋白的氨基酸序列,构建RhoxF1酵母双杂交诱饵载体,并检测其自激活活性。方法：生物信息学分析RhoxF1蛋白保守区域,比较小鼠Rhox5与人RhoxF1的氨基酸序列同源性,PCR扩增RhoxF1基因,与PMD-18-T载体连接,然后把RhoxF1克隆到pGBKT7载体中,醋酸锂法将重组质粒pGBKT7-RhoxF1转入酵母菌AH109,观察pG-BKT7-RhoxF1在AH109中的表达情况,检测诱饵载体有无毒性和自激活作用。结果：RhoxF1蛋白保守区域有大量的DNA结合位点,与Rhox5具有30%的同源性。成功构建诱饵载体pGBKT7-RhoxF1,目的片段可在酵母AH109中表达,并且对酵母菌无毒性,对报告基因无自激活功能。结论：探索了RhoxF1的蛋白特性,成功构建pGBKT7-RhoxF1重组质粒,可以作为酵母双杂交诱饵载体筛选与RhoxF1相互作用的蛋白,进而对其进行功能性研究。     

抗增殖蛋白在酵母双杂交系统中转录激活作用的检测

目的:检测抗增殖蛋白在酵母双杂交系统中是否具有转录自激活作用。方法:采用PCR方法扩增抗增殖蛋白基因全长序列,构建酵母双杂交系统的诱饵载体pGBKT7-PHB,制备酵母菌AH109感受态细胞,将pGBKT7-PHB转化感受态酵母菌AH109后培养于含缺失培养基的平板上,检测β-半乳糖苷酶活性,判定其是否具有转录自激活作用。结果:扩增出抗增殖蛋白基因全长序列,构建了诱饵载体pGBKT7-PHB,转化酵母菌AH109后在双缺和三缺培养基上未能使β-半乳糖苷酶活性滤纸片变蓝,说明报告基因未被激活。结论:抗增殖蛋白没有转录自激活作用,可用于酵母双杂交系统。     

HeLa细胞cDNA文库及酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-CPn0308的构建

旨在利用酵母双杂交系统构建HeLa细胞的cDNA文库,并构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-CPn0308。从HeLa细胞中提取总RNA,应用SMARTTM技术,构建以pGADT7-Rec为载体的HeLa细胞酵母GAL4 AD融合cDNA文库。应用PCR技术扩增目的片段CPn0308,并成功克隆该基因到诱饵载体pGBKT7中,将重组质粒转化酵母菌株AH109后,检测诱饵载体有无自激活和细胞毒性作用。结果显示,文库展现良好的多态性,重组诱饵载体pGBKT7-CPn0308不具有毒性且未自主激活报告基因,说明该文库和诱饵质粒可用于酵母双杂交系统。     

协同激活分子CBP诱饵表达质粒的构建和鉴定

构建协同激活分子CBP（CREB（cAMP response element binding）binding protein）的诱饵表达质粒pGBKT7-CBP并检测其蛋白表达、毒性和自激活作用.PCR扩增小鼠CBP的基因编码序列（CDS（coding sequence）序列）并克隆入诱饵表达载体pGBKT7中,通过酶切和测序鉴定后,把构建好的诱饵表达质粒pGBKT7-CBP转化到酵母AH109细胞中,Western blot检测诱饵蛋白表达情况,同时检测诱饵蛋白的毒性和自激活作用.结果成功扩增了小鼠CBP基因的CDS序列,并成功克隆到酵母诱饵表达载体pGBKT7中,测序结果正确.诱饵表达质粒成功转化到酵母AH109细胞中,Western blot分析结果证实酵母细胞高表达诱饵蛋白CBP,但诱饵蛋白有自激活作用.提示pGBKT7-CBP不能用于酵母双杂交或三杂交系统检测CBP与其他蛋白质或小分子的相互作用,对其他研究CBP生物学功能试验的方法选取具有一定的借鉴意义.     

酵母双杂交系统筛选与组蛋白去乙酰化酶1相互作用的蛋白质

目的：获得组蛋白去乙酰化酶1（HDAC1）的cDNA并构建为酵母双杂交系统中的饵基因,筛选出与其相互作用的蛋白质。方法：利用RT-PCR方法从人HeLa细胞中克隆出1446bp的cDNA片段,重组入载体pGBKT7得到pGBKT7-HDAC1,转化至酵母菌AH109,检测其对酵母细胞无毒性也无自激活报告基因活性,然后将其与已转入HeLa细胞基因组cDNA文库的酵母菌融合,进行筛选和验证工作。结果：筛选出3个阳性克隆,经免疫共沉淀试验进一步验证,发现仅有1个蛋白能与HDAC1发生相互作用,测序结果表明该蛋白为FHL2。结论：应用酵母双杂交方法筛选出HDAC1的相互作用蛋白FHL2,为进一步研究HDAC1的作用提供了新线索。     

核转录因子TR3及其缺失突变体在酵母双杂交系统中转录激活作用的检测

目的:检测TR3及其转录活性域缺失突变体在酵母双杂交系统中的转录自激活作用。方法:采用PCR方法扩增TR3全长序列及其缺失突变体,构建酵母双杂交系统的诱饵载体pGBKT7-TR3和pGBKT7-TR3/Δ1～690,将pGBKT7-TR3转化感受态酵母菌AH109后培养于含缺失培养基的平板上,检测β-半乳糖苷酶活性,判定其是否具有转录自激活作用。结果:构建了包含TR3全长序列和TR3/Δ1～690序列的诱饵载体,转化酵母菌AH109后在双缺和三缺培养基上未能使β-半乳糖苷酶活性滤纸片变蓝,说明β-半乳糖苷酶报告基因未被激活。结论:TR3及其转录活性域缺失突变体没有转录自激活作用,可用于酵母双杂交系统。     

香蕉红素氧还蛋白基因在酵母双杂交系统中的自激活检测

利用PCR方法扩增香蕉红素氧还蛋白基因的保守结构域序列CdRD和开放性阅读框序列FRD,并在其上下游分别引入NdeⅠ和SalⅠ酶切位点,双酶切后与同样经NdeⅠ和SalⅠ双酶切的诱饵质粒载体pGBKT7连接,构建重组诱饵质粒pGBKT7-CdRD和pGBKT7-FRD,并将此两重组诱饵质粒转入酵母菌株AH109中进行营养缺陷型分析检测毒性及自激活。结果表明,成功构建了重组诱饵质粒pGBKT7-CdRD和pGBKT7-FRD,并且其无自激活报告基因作用,对酵母菌株也无毒性作用。这说明此两个重组诱饵质粒可用于酵母双杂交系统,为从香蕉叶片cDNA文库中筛选获得与香蕉红素氧还蛋白基因的保守结构域序列CdRD和开放性阅读框序列FRD相互作用的受体蛋白基因奠定了基础。     

早幼粒细胞白血病基因结构域诱饵载体的构建及鉴定

目的研究早幼粒细胞白血病基因（promyelocytic leukemia,PML）中含环指／B—BOX结构与含coiled—coil结构的两个结构域的功能,构建含其结构域序列的诱饵表达载体,为进一步应用酵母双杂交系统筛选与之相互作用的蛋白建立实验基础。方法PCR扩增PML的两个结构域序列,克隆人诱饵载体pG—BKT7中,经测序鉴定后,将诱饵载体转化到酵母细胞AH109中,检测诱饵蛋白有无毒性,渗漏和自激活作用,同时利用蛋白印迹法分析诱饵蛋白的表达。结果成功扩增了PML两个结构域的基因片段,并正确克隆入pGBKT7中。诱饵载体成功转化到酵母细胞AH109中,其中一个诱饵蛋白BD—PML—B无毒性,但具有渗漏和自激活作用,另一个诱饵蛋白BD—PML—C无毒性,渗漏和自激活作用,蛋白印迹法分析证实酵母细胞表达诱饵蛋白。结论含环指／B—BOX的结构域具有转录因子活性,全长PML的转录活性与之有关;成功构建了含coiled—coil结构的PML结合域的酵母诱饵表达载体,为运用酵母双杂交技术筛选与之作用的蛋白并探讨其功能奠定了基础。     

酵母双杂交筛选心脏cDNA文库中与人热激蛋白70相互作用的蛋白质

目的:利用酵母双杂交系统从人心肌cDNA文库中筛选与热激蛋白70(HSP70)相互作用的蛋白质。方法:从人心脏cDNA文库扩增Hsp70基因,克隆于pGBKT7载体上,酶切鉴定及序列分析,并检测pGBKT7-Hsp70酵母细胞AH109中的自激活活性;将构建的酵母表达诱饵质粒载体pGBKT7-Hsp70转化AH109酵母细胞,与转化有人心脏cDNA文库的酵母Yl87进行交配实验,筛选与HSP70相互作用的蛋白质,通过一对一的回复杂交实验排除假阳性,对阳性克隆进行序列测定和生物信息学分析。结果:构建了"诱饵"质粒栽体pGBKT7-Hsp70,并证明其在酵母双杂交系统中无自激活活性,筛选得到多个与Hsp70相互作用的阳性转化子,并最终得到HSP70的1个相互作用蛋白质HIP。结论:应用酵母双杂交系统筛选出与HSP70相互作用的1个蛋白质,它们的相互作用可能与HSP70发挥细胞分子伴侣作用有关。     

六种藓类植物茎的比较解剖学研究

通过对6种藓类植物,即褶叶青藓(Brachythecium salebrosum(Web.et Mohr.)B.S.G.)、湿地匐灯藓(Plagiomnium acutum(Lindb.)Kop.)、侧枝匐灯藓(Plagiomnium maximoviczii(Lindb.)Kop.)、大凤尾藓(Fissidensnobilis Griff.)、大羽藓(Thuidium cymbifolium(Doz.et Molk.)B.S.G.)和大灰藓(Hypnum plumaeforme Wils.)嫩茎和老茎的石蜡切片和显微观察发现,同一藓类植株的嫩茎和老茎,茎结构稳定,不同种藓类植物茎横切面具有不同特征.植物体茎横切面形状、表层细胞的层数、细胞大小和细胞壁厚薄、皮层细胞大小和形状、中轴的有无以及比例等特征可以作为藓类植物的分科分类依据之一.