人结核杆菌热休克蛋白70和卡介苗α抗原基因启动子序列测定

用Ｔ７ＤＮＡ聚合酶测序系统测定了人结核杆菌热休克蛋白７０（ｈｓｐ７０）基因的启动子序列和卡介苗（ＢＣＧ）α基因的启动子和信号肽序列，并比较了它们与大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）和其它分枝杆菌启动子之间的异同。结果所测的ｈｓｐ７０启动子序列为人结核杆菌ｈｓｐ７０编码基因起始密码（ＡＴＧ）上游１５０个脱氧核苷酸，其中在ＡＴＧ上游－１２￣－８核苷酸处有核糖体结合位点（ＳＤ序列）ＧＧＡＧＧ，在ＲＮＡ聚合酶的结合     

rhG-CSF cDNA高表达质粒的构建及其在COS7细胞中的表达

目的：构建一个能在哺乳动物细胞中高表达人粒细胞集落刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）ｃＤＮＡ的重组质粒。方法：利用化学合成引物，进行ＰＣＲ，对人Ｇ－ＣＳＦｃＤＮＡ５＇ＡＵＧ侧翼序列进行翻译优化突变。测序确证后，重组入表达载体ｐＥＤ，构建成质粒ｐＥＤ－ＧＣＳＦ，用ＤＥＡＥ－Ｄｅｘｔｒａｎ法转染ＣＯＳ７细胞，ＥＬＩＳＡ法定量测定ｒｈＧ－ＣＳＦ表达水平。结果：转染ＣＯＳ７细胞后４８ｈ收集的上清ｒｈＧ－ＣＳＦ表达量为５２ｎｇ／ｍｌ，７２ｈ为２３０ｎｇ／ｍｌ，显示ｒｈＧ－ＣＳＦ获得了暂时性高表达。结论：ｐＥＤ－ＧＣＳＦ是一个能在哺乳动物细胞中高效表达ｒｈＧ－ＣＳＦ的真核表达质粒。     

阻断TGF α—EGFR自泌环对胰腺癌细胞体外生长的影响

目的 研究阻断ＴＧＦα－ＥＧＦＲ自泌环对胰腺癌细胞生长的影响。方法 构建了反义ＥＧＦＲ 表达载体ｐＣＭＶ－ＡＳ－ＥＧＦＲ。转染反应反义ＴＧＦα转化的胰腺癌ＰＣ－７细胞,经Ｇ４１８筛选,获得稳定的双重转化细胞系ＰＣ－７／ＡＳ－ＴＧＦα／ＡＳ－ＥＧＦＲ。经Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ,Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ,＾１２５Ｉ－ＥＧＦ结合试验分析双重转染细胞系基因的整合及表达。ＤＮＡ凝胶电泳,流式细胞术,。原位     

大鼠ACAT的N末端片段(氨基酸1～126)在大肠杆菌中的融合表达及纯化

目的： 重组法制备纯化乙酰辅酶Ａ：胆固醇酰基转移酶（ＡＣＡＴ）Ｎ末端膜外结构域（氨基酸１～１２６）。　方法：经ＰＣＲ扩增得到的ＡＣＡＴ的Ｎ末端膜外结构域（氨基酸１～１２６）用ＥｃｏＲＩ酶解,插入到表达载体ｐＧＥＸ－２ＴＫ中,得到重组表达质粒ｐＧＥＸ－２ＴＫ／ＡＣＡＴ（氨基酸１～１２６）。阳性重组子在大肠杆菌中经ＩＰＴＧ诱导表达ＧＳＴ－Ａ－ＣＡＴ（氨基酸１～１２６）,重组表达菌裂解上清液经ＧＳＨ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ－４Ｂ亲和柱纯化。　结果：ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ 和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ 分析显示得到了纯的ＧＳＴ－ＡＣＡＴ（氨基酸１～１２６）融合蛋白。　结论：ＡＣＡＴ的Ｎ末端膜外结构域（氨基酸１～１２６）的分离纯化为抗ＧＳＴ－ＡＣＡＴ（Ｎ 末端片段）抗体的制备及其ＡＣＡＴ结构和功能关系的进一步研究打下了基础。     

肝细胞癌患者中p53基因的突变研究

为了解肝细胞癌（ＨＣＣ）中ｐ５３基因的突变情况，收集８６例ＨＣＣ手术切除标本，采用聚合酶链反应－单链构象多态性（ＰＣＲ／ＳＳＣＰ）、聚合酶链反应－限制性片段长度多态性（ＰＣＲ／ＲＦＬＰ）和ＤＮＡ序列分析，研究了ｐ５３基因的突变情况。８６例ＨＣＣ中，ｐ５３基因的突变率为３６％，其中，密码子２４９的突变率为３３．７％，１例ＳＳＣＰ和ＲＦＬＰ均提示密码子２４９存在突变者经ＤＮＡ序列分析显示密码子２４９的第三个碱基发生了ＡＧＧ／ＡｒｇＡＧＴ／Ｓｅｒ突变。以上结果提示，ＨＣＣ中，ｐ５３基因的突变主要以点突变为主，主要发生在密码子２４９，其突变率、突变谱和突变方式与启东等ＨＣＣ高度流行区相似     

TNF,IFN,MHCⅠ类分子基因“正反馈”式放大表达的重组腺病毒载体

目的：为使外源性 Ｔ Ｎ Ｆ, Ｉ Ｆ Ｎ 基因和内源性主要组织相容性复合物Ⅰ类（ Ｍ Ｈ ＣⅠ）分子基因表达呈现“正反馈”式放大效 应,构建在 Ｈ Ｌ Ａ Ｂ７ 启动子调控、 Ｉ Ｒ Ｅ Ｓ连接下协同表达 Ｔ Ｎ Ｆα和 Ｉ Ｆ Ｎβ基因的重组腺病毒载体。方法和结果：从ｐ Ｇ Ｌ３ Ｂ７ Ｔ Ｎ Ｆ及ｐ Ｉ Ｒ Ｉ Ｆ中切下 Ｂ７ｐｒｏ Ｔ Ｎ Ｆ和 Ｉ Ｒ Ｅ Ｓ Ｉ Ｆ Ｎβ基因片段,先后插入ｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ｓｋ （＋ ）, 构建成ｐ Ｂ Ｌ Ｂ７ Ｔ Ｎ Ｉ Ｒ Ｉ Ｆ。回收 Ｔ Ｎ Ｆα Ｉ Ｒ Ｅ Ｓ Ｉ Ｆ Ｎβ基因片段,连入 Ａｄ Ｃ Ｍ Ｖ Ｌｉｎｋ１ 中,构建成 Ｃ Ｍ Ｖ 启动子驱动表达的 Ａｄ Ｃ Ｍ Ｖ Ｔ Ｎ Ｉ Ｒ Ｉ Ｆ（＋ ）。回收 Ｂ７ｐｒｏ Ｔ Ｎ Ｆ Ｉ Ｒ Ｅ Ｓ Ｉ Ｆ Ｎβ基因片段,连入缺失 Ｅ１ 和 Ｅ３ 区及启动子的 Ａｄ ＢｇｌⅡ中, 构建成 Ｈ Ｌ Ａ Ｂ７ 启动子驱动表达的 Ａｄ Ｂ７ Ｔ Ｎ Ｉ Ｒ Ｉ Ｆ（－ ）。结论：此两种载体为“正反馈”式放大肿瘤免疫原性提供一条新途径。     

rhG—CSF cDNA表达质粒的构建及其在COS7细胞中的表达

目的：构建一个能在哺乳动物细胞中高表达人粒细胞集落刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）ｃＤＮＡ的重组质粒。方法：利用化学合成引物，进行ＰＣＲ，对人Ｇ－ＣＳＦｃＤＮＡ５ＡＵＧ侧翼序列进行翻译优化突变。测序确证后，重组人表达载体ｐＥＤ，构建成质粒ＰＥＤ－ＧＣＳＦ，用ＤＥＡＥ－Ｄｅｘｔｒａｎ法转染ＣＯＳ７细胞，ＥＬＩＳＡ法定量测定ｒｈＧ－ＣＳＦ表达水平。结果：转染ＣＯＳ７细胞后４８ｈ收集的上清ｒｈＧ－ＣＳＦ表达量为５     

人肝脏再生增强因子cDNA的克隆、表达及纯化

克隆人肝脏再生增强因子（ｈＡＬＲ）ｃＤＲＮＡ,构建重组表达载体并对其诱导表达,纯化。方法：提取胎儿肝组织总ＲＮＡ,利用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增出ｈＡＬＲｃＤＮＡ,克隆于载体ｐＧＥＭ－Ｔ,酶切鉴定后亚克隆至表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－３,测序证实序列正确并转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）,ＩＰＴＧ诱导表达融合蛋白ＧＳＴ－ｈＡＬＲ,表达物通过谷胱甘肽Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析纯化后进行Ｔｈｒｏｍｂｉｎ酶切,     

人转化生长因子基因重组克隆及高效表达

目的　克隆人转化生长因子（ＴＧＦβ１） 基因并且在大肠杆菌中表达。方法　从人的血小板中抽提总ＲＮＡ,经逆转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ） 得到全长ＴＧＦβ１ ｃＤＮＡ,将其克隆于表达质粒ｐＢＬＭＶＬ２ 中,构建了在ＰＬ 启动子控制的含有ＴＧＦβ１ｃＤＮＡ重组子,转化到大肠杆菌ＲＲ１ 菌株中,进行温敏诱导表达。结果　表达产物经ＳＤＳＰＡＧＥ电泳染色后,显示其相对分子质量为１２ ．５ ×１０３ ,计算机灰度扫描分析,表达产物约占全菌蛋白的２０％ 左右,Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ 分析证实,表达产物为ＴＧＦβ１ ,细胞实验显示其具有一定的生物活性。结论　在大肠杆菌中表达出具有活性的人ＴＧＦβ１ 。这为我们下一步研究其功能和临床应用打下了基础。     

细胞因子对人胃癌细胞胃癌相关抗原MG7Ag表达的调节

探讨细胞因子对人胃癌细胞胃癌相关抗原ＭＧ７Ａｇ表达的调节作用。用基因重组干扰素α（ＩＦＮ－α），干扰素γ（ＩＦＮ－γ），白细胞介素２（ＩＬ－２）和肿瘤坏死因子γ（ＴＮＦ－γ）体外诱导三株人胃癌细胞系ＳＧＣ７９０１，ＭＧＣ８０３和ＭＫＮ４５胃癌相关抗原ＭＧ７Ａｇ表达。ＩＦＮ－α和ＩＦＮ－γ对胃癌细胞ＭＧ７Ａｇ有促表达作用。ＩＬ－２对三株细胞ＭＧ７Ａｇ无调节作用；ＴＦＮ－α对细胞ＭＧ７Ａｇ表达调节是随     

阻断TGF α-EGFR自泌环对胰腺癌细胞体外生长的影响

目的研究阻断ＴＧＦα－ＥＧＦＲ自泌环对胰腺癌细胞生长的影响。方法构建了反义ＥＧＦＲ的表达载体ｐＣＭＶ－ＡＳ－ＥＧＦＲ,转染已经反义ＴＧＦα转化的胰腺癌ＰＣ－７细胞,经Ｇ４１８筛选,获得稳定的双重转化细胞系ＰＣ－７／ＡＳ－ＴＧＦα／ＡＳ－ＥＧＦＲ。经Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ、１２５Ｉ－ＥＧＦ结合试验分析双重转染细胞系基因的整合及表达。ＤＮＡ凝胶电泳、流式细胞术、原位凋亡检测细胞凋亡。结果双重转染细胞系有外源ＴＧＦα基因的整合及表达,内源性ＥＧＦＲ及ｃｙｃｌｉｎＤ１ｍＲＮＡ表达下调、细胞表面ＥＧＦＲ受体表达下降,与反义ＴＧＦα单独作用比较,反义ＥＧＦＲ与反义ＴＧＦα的联合作用更强。３Ｈ－ＴｄＲ掺入率由２５％降至１４．５％。生长抑制率由７８．８％提高到８６．０％、软琼脂集落形成能力完全丧失。双重抑制后,细胞更容易发生凋亡。结论对胰腺癌中异常信号传导途径的阻断,能明显地抑制肿瘤恶性生物学行为,使肿瘤细胞恶性表型部分逆转。     

弓形虫主要表面抗原基因克隆及在大肠杆菌中的表达

为在大肠杆菌中表达弓形虫主要表面抗原（ＳＡＧ１）,进一步研究其生物学功能。将ＳＡＧ１基因重组于ｐＧＥＭＥＸ－１融合型表达载体上,转化大肠杆菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）,得到含重组表达质粒ｐＧＥＭＥＸ－１／ＳＡＧ１的工程菌。结果表明ＩＰＴＧ诱导表达后,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测证实含有ＳＡＧ１蛋白。提示ｐＧＥＭＥＸ－１大肠杆菌系统可以表达具有免疫活性的ＳＡＧ１蛋白。     

肝星形细胞表达转化生长因子α与成纤维细胞生长因子

目的 研究肝星形细胞（ＨＳＣ）转化生长因子α（ＦＧＦα）与成纤维细胞生长因子（ａＦＧＦ）的表达。方法 分别从正常与ＣＣＬ４肝纤维化大鼠肝脏分离ＨＳＣ,提取ＲＮＡ,用ＲＴ－ＰＣＲ测定ＴＧＦα和ａＦＧＦｍＲＮＡ。结果 正常ＨＳＣ表达ＴＧＦα和ａＦＧＦ,肝纤维化时ＴＧＦα与ａＦＧＦｍＲＮＡ水平均显著升高（Ｐ〈０．０５）。结论 ＨＳＣ自分泌ＴＧＦα和ａＦＧＦ,对肝纤维化具有重要促进作用。     

弓形虫主要表面抗原基因克隆及在大肠杆菌中的表达

为在大肠菌中表达弓形虫主要表面抗原（ＳＡＧ１）,进一步研究其生物学功能。将ＳＡＧ１基因重组于ｐＧＥＭＥＸ－１事例型表达载体上,转化大肠杆菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）,得到含重组表达质粒ｐＧＥＭＥＸ－１／ＳＡＧ１的工程菌。结果表明ＩＰＴＧ诱导表达后,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测证实含有ＳＡＧ１蛋白。提示ｐＧＥＭＥＸ－１大肠杆菌系统可以表达具有免疫活性的ＳＡＧ１蛋白。     

矢车菊素－３－葡萄糖苷通过降低ＳＴＡＴ３活化抑制ＴＮＦ－α诱导的小鼠血管平滑肌细胞增殖

【目的】 探讨矢车菊素－３－葡萄糖苷（Ｃ３Ｇ）对ＴＮＦ－α诱导的血管平滑肌增殖的影响及可能的机制。【方法】 Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠主动脉平滑肌细胞（ＶＳＭＣ） 购于ＡＴＣＣ,体外培养后以Ｃ３Ｇ对细胞进行预处理后观察ＴＮＦ－α的促细胞增殖作用;Ｄｉｈｙｄｒｏｅｔｈｉｄｉｕｍ （ＤＨＥ）荧光染色检测ＶＳＭＣ在ＴＮＦ－α作用下的活性氧（ＲＯＳ）生成情况;实时定量ＰＣＲ检测细胞内ＮＡＤＰＨ氧化酶活化蛋白１（ＮｏｘＡ１）的ｍＲＮＡ水平;蛋白质印迹法检测细胞内ＮｏｘＡ１、信号转导与转录激活因子３ （ＳＴＡＴ３）、磷酸化ＳＴＡＴ３及β－ａｃｔｉｎ的表达水平。统计学方法采用单因素方差分析。【结果】 Ｃ３Ｇ预处理能够抑制ＴＮＦ－α诱导的ＶＳＭＣ增殖,该作用呈现剂量、时间依赖性。联合应用５０ μｍｏｌ／Ｌ Ｃ３Ｇ及１００ μｍｏｌ／Ｌ ａｐｏｃｙｎｉｎ显著减少ＴＮＦ－α诱导ＲＯＳ的生成。Ｃ３Ｇ联合ａｐｏｃｙｎｉｎ较Ｃ３Ｇ或ａｐｏｃｙｎｉｎ单独孵育更能显著抑制ＴＮＦ－α处理下ＶＳＭＣ内ＮｏｘＡ１基因的表达及ＳＴＡＴ３蛋白的磷酸化。应用ＲＯＳ清除剂触媒（ｃａｔａｌａｓｅ ２ ０００ Ｕ／ｍＬ）能显著抑制ＴＮＦ－α诱导的ＶＳＭＣ增殖及ＳＴＡＴ３蛋白活化。【结论】 Ｃ３Ｇ对抗ＴＮＦ－α诱导ＶＳＭＣ增殖的机制很可能是通过削弱ＮｏｘＡ１导致的ＲＯＳ生成,从而抑制ＳＴＡＴ３蛋白的激活。     

绿色荧光蛋白GFP在转化细胞和肿瘤细胞中的表达

目的：在肿瘤基因治疗研究中建立一个用绿色荧光蛋白（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ,ＧＦＰ）为标记基因的合适条件。方法用带有ＧＦＰ突变体的质粒转染到表达细胞,观察ＧＦＰ瞬时表达的情况：１．直接测定ＧＦＰ在ＣＯＳ－７细胞中的表达并观察表达的稳定性;２比较不同启动子驱动的ｐｃＤＮＡ３－ＥＧＦＰ和ｐＳＶＫ３－Ｓ６５Ｔ两种质粒在不同肿瘤细胞中的转染效率;３用ＬａｃＺ基因与ＧＦＰ基因共转染     

反义N-ras-1基因对成纤维细胞生长因子诱导的血管平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的应用反义Ｎ－ｒａｓ１基因阻断成纤维细胞生长因子（ｂＦＧＦ）的促增殖作用，为防治以血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）增殖为主要特征的血管损伤后再狭窄等心血管疾病提供进一步探索的途径。方法利用构建的含反义Ｎ－ｒａｓ１基因的逆转录病毒质粒（ｆｐＧｖ１－ＭＴ－ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＮ－ｒａｓ１）转染于培养的血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣｓ），ｆｐＧｖ１－ＭＴ逆转录病毒空载质粒及未转染质粒的细胞为对照，观察其对ｂＦＧＦ诱导的ＶＳＭＣ的影响。结果反义Ｎ－ｒａｓ１细胞数为（１６．８±１．３）×１０４（细胞／ｍｌ），空载质粒对照细胞为（３０．１±１．２）×１０４，两者差异有显著意义（Ｐ＜０．００１）；反义Ｎ－ｒａｓ１细胞３Ｈ－ＴｄＲ掺入率为７６４３±６７２（ｃｐｍ），空载质粒对照细胞为１５１３１±１３８（ｃｐｍ），两者差异有非常显著意义（Ｐ＜０．００１），同时应用反义Ｎ－ｒａｓ１基因的细胞ＲａｓｍＲＮＡ表达水平明显降低，其表达蛋白ｐ２１也明显降低。结论反义Ｎ－ｒａｓ１基因对ＶＳＭＣ及ｂＦＧＦ诱导ＶＳＭＣ增殖有抑制作用。     

血管生成抑制素的功能结构域K1-3的融合表达与抗体制备

目的;重组表达ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ的功能结构域Ｋ１－３,并制备抗体,为其作用机理研究打下基础。方法：设计引物,通过ＰＣＲ以人纤溶酶原ｃＤＮＡ为模板扩增出Ｋ１－３基因片段,克隆至ｐＧＥＸ－４Ｔ－１融合表达载体,ＩＰＴＧ诱导,挑出表达克隆,切下基因片,克隆至ｐＵＣ１９进行序列测定,保留序列完全正确的克隆并进行诱导表达,从ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上切下表达的蛋白条带作为抗原免疫家兔,制备多克隆抗体,并以Ｗｅｓ     

急性白血病患者血清及骨髓TGF—γ1及其Ⅰ,Ⅱ型受体水平 …

目的 探讨转化生长因子－β１（ＴＧＦ－β１）及其Ⅰ、Ⅱ型受体（ＴＧＦＲ１,ＴＧＦＲ２）对白血病预后的意义,方法 采用ＳＡＢＣ免疫组织化学方法观察ＴＧＦ－β１及ＴＧＦＲ１,ＴＧＦＲ２在急性白血病患者的表达情况,。并用ＥＬＩＳＡ法测定白血病患者血清及骨髓ＴＧＦ－β１水平。结果 白血病细胞ＴＧＦ－β１表达水平与对照组比较差异无显著性（Ｐ〉０．０５）。初 患者的ＴＧＦＲ１及ＴＧＦＲ２表达水平非常显著低于对     

EXPRESSION OF TGF－β_1，PDGF AND IGF－1 mRNA IN LUNG OF BLEOMYCIN－A_5－INDUCED PULMONARY FIBROSIS IN RATS

ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮＯＦＴＧＦ－β１，ＰＤＧＦＡＮＤＩＧＦ－１ｍＲＮＡＩＮＬＵＮＧＯＦＢＬＥＯＭＹＣＩＮ－Ａ５－ＩＮＤＵＣＥＤＰＵＬＭＯＮＡＲＹＦＩＢＲＯＳＩＳＩＮＲＡＴＳＬｉＨａｉｃｈａｏ李海潮，ＨｅＢｉｎｇ何冰，ＱｕｅＣｈｅｎｇｌｉ阙呈立ａｎｄＷ...