小鼠热休克蛋白gp96羧基端片段的克隆、表达及纯化

热休克蛋白(Heat shock protein)gp96(Grp94)是近年来新发现的一类糖蛋白,除了分子伴侣的功能外,现有越来越多的献报道了它在先天性免疫和获得性免疫中的重要作用。gp96可以促进抗原呈递细胞的成熟以及细胞因子的分泌。热休克蛋白抗原肽复合体可以引起特异性的细胞毒T淋巴细胞效应,应用这个特点可以设计抗病毒及抗肿瘤药物。但是gp96全长分子量大,蛋白在大肠杆菌中表达量低,不稳定,难纯化。组织提取的gp96又受组织来源和样品量的限制。对gp96的结构和功能的研究带来困难。克隆并表达了小鼠热休克蛋白gp96的羧基端560．751aa约四分之一长的功能片段,该段包含gp96的一个肽结合区和二聚化位点。将该功能片段在大肠杆菌中进行融合表达,纯化后将融合的片段切掉,并对目的片段进行了分析,结果表明该段可能是形成二聚体密切相关的片段,为进一步研究其结构和功能打下基础。     

小鼠热休克蛋白 gp96羧基端片段的克隆、表达及纯化

休克蛋白（Heat shock protein）gp96(Grp94)是近年来新发现的一类糖蛋白,除了分子伴侣的功能外,现有越来越多的文献报道了它在先天性免疫和获得性免疫中的重要作用。Gp96可以促进抗原呈递细胞的成熟以及细胞因子的分泌。热休克蛋白抗原肽复合体可以引起特异性的细胞毒T淋巴细胞效应,应用这个特点可以设计抗病毒及抗肿瘤药物^［１］。但是gp96全长分子量大,蛋白在大肠杆菌中表达量低,不稳定,难纯化。组织提取的gp96又受组织来源和样品量的限制。对gp96的结构和功能的研究带来困难。克隆并表达了小鼠热休克蛋白gp96的羧基端560751aa约四分之一长的功能片段,该段包含gp96的一个肽结合区和二聚化位点^［２］。将该功能片段在大肠杆菌中进行融合表达,纯化后将融合的片段切掉,并对目的片段进行了分析,结果表明该段可能是形成二聚体密切相关的片段,为进一步研究其结构和功能打下基础。     

热休克蛋白-多肽复合物在肿瘤和传染性疾病免疫中的作用

热休克蛋白家族中的许多成员如gp96\,HSP90\,HSP70等具有排斥和治疗肿瘤及传染性疾病的免疫原性,进一步研究发现热休克蛋白作为分子伴侣可结合细胞中的肽库,它本身没有抗原性,抗原性由结合的短肽所决定。热休克蛋白将结合的短肽呈递给I类MHC分子,进而激活特异性CTL和记忆性T细胞,引发机体细胞免疫反应。据最新发现gp96还可能有与MHC一样的功能,可直接将结合的多肽抗原呈递给T细胞。近年来对哺乳动物的二种主要热休克蛋白gp96和HSP70的免疫机制和作为治疗性疫苗的优越性进行了详细研究,这为乙型肝炎和乙肝继发性肝癌的免疫治疗提供了新思路。     

热休克蛋白gp96作为抗原载体的研究进展

gp96是存在于真核生物细胞内质网中的分子量约为96kD的热休克蛋白(又称GRP94)。它属于HSP90家族,是胞质HSP90的旁系同源蛋白。研究证实从小鼠肿瘤组织中分离的gp96注射小鼠后,可使小鼠获得针对该肿瘤细胞的特异细胞免疫力。随后发现这种特异性免疫不是由gp96引起,而是由其结合的小肽诱发。gp96受体的发现给这种现象的解释提供了线索。人们提出了多种假说来解释这种现象,其中一些得到了广泛的支持。另外,gp96还参与免疫调节过程。完全了解gp96在免疫系统中的作用机制对开发新型药物如肿瘤和病毒感染治疗性疫苗具有重要意义 。     

热休克蛋白gp96在恶性肿瘤中的研究进展

热休克蛋白90B1又称为糖蛋白96 (gp96). gp96属于热休克蛋白90家族,是一种高度保守且普遍存在的糖蛋白.作为一种内质网蛋白,gp96在维持内质网稳态、内质网应激、钙稳态等方面起着重要的调控作用,这些调控网络在肿瘤的发生发展过程中起着重要的作用. gp96作为分子伴侣在稳定和激活客户蛋白等方面有众多报道,其中包括HER2、整合素和Toll样受体等多个客户蛋白.大量研究表明,gp96在肝癌、乳腺癌、胃癌等不同类型的肿瘤中高表达,并在肿瘤的生长、侵袭和转移等方面起着重要的作用.本文从gp96的基本结构和功能及其在肿瘤发生发展中的作用等方面进行综述,并着重阐述细胞膜gp96相关的研究进展.最后,重点介绍基于胞膜gp96结构所设计的选择性小分子抑制剂、抗体和多肽等药物在肿瘤靶向治疗中的潜在应用.     

N-糖基化修饰对热休克蛋白gp96免疫学功能的影响

文中旨在以N-糖基化位点突变的重组热休克蛋白gp96为对象,研究N-糖基化修饰对其免疫功能的影响。首先利用昆虫表达系统表达野生型和突变型gp96蛋白,并检测其糖基化水平。进一步通过体外和体内实验,利用流式细胞术和酶联免疫吸附试验 (Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA) 检测小鼠CD8+IFN-γ+ T细胞亚群和IFN-γ的分泌,查明糖基化对gp96抗原呈递功能的影响,进一步用ATPase试剂盒检测gp96的ATPase活性。最后通过小鼠免疫实验探究糖基化对gp96疫苗佐剂功能和活化流感疫苗特异性T细胞的影响。结果显示,N-糖基化修饰位点突变后,重组gp96蛋白总含糖量下降了27.8%。与野生型重组蛋白相比,突变gp96的抗原呈递能力减弱,同时ATPase活性明显降低。同时与野生型重组gp96相比,突变gp96佐剂活化流感疫苗特异性T细胞水平也明显减少。这些结果表明,N-糖基化修饰参与调节gp96的ATPase活性和抗原呈递功能,进而影响其疫苗佐剂功能,为开发基于gp96的佐剂疫苗提供了依据。     

联合使用低剂量环磷酰胺有效增强热休克蛋白gp96免疫佐剂功能

前期研究发现热休克蛋白gp96作为分子伴侣,能特异结合乙肝病毒(HBV)表位肽,并将结合的多肽交叉呈递给MHCⅠ类分子,从而激活病毒特异性CD8+ T细胞(CTL).在此基础上,研究BALB/c小鼠模型联合低剂量环磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)对热休克蛋白gp96免疫佐剂功能的影响.以gp96或其N端片段(N355)与H-2Kd限制的乙肝病毒核心蛋白表位HBcAg87-95作为佐剂联合低剂量CTX免疫BALB/c小鼠.联合使用低剂量CTX的试验组CD8+T细胞、IFN-γ+CD8+T细胞、乙肝抗原特异T细胞比例显著高于未使用CTX的对照组(P＜0.05),且联合使用CTX的试验组CD4+CD25+调节性T细胞(T Regulatory Cells ,Treg)比例显著低于单独使用gp96和N355试验组(P＜0.05),说明低剂量的CTX能特异性抑制Treg从而导致T细胞的增加.以上研究表明联合使用低剂量的环磷酰胺能有效增强gp96免疫佐剂功能,这为进一步优化gp96佐剂疫苗的使用提供了依据.     

热休克蛋白gp96 3′UTR作为ceRNA通过 miR-642a调控DOHH的表达

热休克蛋白gp96在肝脏等多种肿瘤中过量表达,与肿瘤的恶性程度和患者不良预后呈显著相关性,其在肿瘤发生发展中作用机制有待深入探讨.通过生物信息学技术预测、荧光素酶报告基因检测、免疫印迹分析、实时定量PCR、RNA干扰,研究gp96 3′UTR作为ceRNA(competing endogenous RNA)对miR-642a和脱氧羟腐氨酸羟化酶(deoxyhypusine hydroxylase,DOHH)表达的影响.研究结果显示,miR-642a特异性靶向的野生型gp96 3′UTR,而不是miR-642a结合位点突变的gp96 3′UTR,可吸附下调miR-642a并同时上调miR-642a靶基因DOHH的表达,进一步研究发现gp96 3′UTR对DOHH的调控依赖于miR-642a.实验还发现DOHH并不影响gp96的表达.Gp96通过ceRNA上调DOHH的表达,为研究gp96促进肝癌等肿瘤的发生发展提供了新思路.     

热激蛋白gp96免疫学功能及在主动免疫治疗肿瘤和传染病中的应用

热激蛋白gp96可特异性结合来源于肿瘤和病毒的抗原肽,与抗原呈递细胞表面CD91等受体作用进入胞内,并在内质网中将结合的抗原通过抗原呈递链呈递给MHCI类分子,激活特异性T细胞。同时,与细胞表面Toll样受体(TLR)TLR2、TLR4等相互作用,激活天然免疫。近期研究发现调节性T细胞(Treg)对gp96免疫功能有显著抑制作用,随着对影响gp96免疫功能的免疫抑制机制的深入了解,以及利用汉逊酵母表达有免疫活性的全长gp96蛋白体系的建立,gp96将在治疗肿瘤及传染性疾病中发挥更大的作用。     

IFN-α对gp96的上调降低其抗HBV的效率

[目的]探讨IFN-α上调热休克蛋白gp96对其抗HBV作用的影响.[方法]首先通过RT-PCR、荧光报告基因和Western blot在转录和蛋白水平上研究IFN-α对gp96上调的时间、剂量依赖性.其次,利用RT-PCR、ELISA分别研究转染表达gp96、RNA干扰gp96对HBV复制的影响.最后,通过ELISA、RT-PCR研究RNA干扰gp96后IFN-α抗HBV的作用.[结果]发现IFN-α对gp96的上调具有时间、剂量依赖性.而gp96的上调促进了HBV的复制,消除IFN-α对gp96的上调显著增强IFN-α抗HBV的效率.[结论]IFN-α上调gp96对其抗乙肝病毒功能起负面影响,抑制gp96上调可增强IFN-α的抗病毒效果.     

Co-expression of gene 31 and 23 products of bacteriophage T4

Folding of the major capsid protein of bacteriophage T4 encoded by gene 23 is aided by Escherichia coli GroEL chaperonin and phage co-chaperonin gp31. In the absence of gene product (gp) 31, aggregates of recombinant gp23 accumulate in the cell similar to inclusion bodies. These aggregates can be solubilized with 6 M urea. However, the protein cannot form regular structures in solution. A system of co-expression of gp31 and gp23 under the control of phage T7 promoter in E. coli cells has been constructed. Folding of entire-length gp23 (534 amino acid residues) in this system results in the correctly folded recombinant gp23, which forms long regular structures (polyheads) in the cell.     

Induction of complement-dependent and -independent neutralizing antibodies by recombinant-derived human cytomegalovirus gp55-116 (gB).

The human cytomegalovirus (HCMV) envelope glycoprotein complex gp55-116 was expressed in both Escherichia coli and cells infected with a recombinant vaccinia virus. E. coli produced a single protein of Mr 100,000 which approximated the size of the nonglycosylated gp55-116 precursor found in HCMV-infected cells. Cells infected with the recombinant vaccinia virus contained three intracellular forms of Mr 160,000, 150,000, and 55,000 which were detected by a monoclonal antibody reactive with gp55. Comparison of the immunological properties of these recombinant proteins indicated that several of the HCMV gp55-116 monoclonal antibodies and sera from patients infected with HCMV reacted with the vaccinia virus-derived proteins whereas a more restricted group of monoclonal antibodies recognized the E. coli-produced protein. Immunization of mice with either E. coli or vaccinia virus recombinant HCMV gp55-116 resulted in production of virus-neutralizing antibodies. In contrast to the almost exclusive production of complement-dependent neutralizing antibodies following immunization with recombinant vaccinia virus, the E. coli-derived protein induced complement-independent neutralizing antibodies.     

噬菌体gp17基因2种重组产物的抗菌效应比较

通过重组技术获得大肠埃希菌噬菌体内溶素纯化蛋白和表面展示噬菌体,并观察产物的生物效应。将肠侵袭性大肠埃希菌EIEC 8401噬菌体LSB-1内溶素基因gp17构建到质粒pET300中,并在大肠埃希菌BL21中诱导表达,通过Ni柱纯化系统纯化产物;利用噬菌体展示技术构建T7-LSB-gp17重组噬菌体,通过双层琼脂法纯化噬菌体,并观察2种产物的抗菌效应。2 139 bp的gp17基因通过重组技术表达出78.3 ku的可溶性蛋白,纯化后浓度为2.38 mg/mL,其对EIEC8401有良好的抑菌活性,但对其他试验菌无抗性;通过噬菌体展示技术构建的重组噬菌体T7-LSB-gp17通过SDS-PAGE电泳显示在78 ku处有表达增强,对EIEC8401无感染、裂解作用,但对EIEC8401及其他试验菌有明显溶菌作用,宿主谱增加。通过重组技术获得的噬菌体LSB-1内溶素基因gp17的产物对LSB-1噬菌体原宿主具有明显的抑制效应。其中gp17表达的纯化蛋白具有明显的宿主专一性,重组噬菌体悬液有较宽种类的抗菌作用。这可能是因为gp17蛋白与噬菌体表面复杂空间结构的相互作用产生的生物效应。     

HIV—1 P24截短体与gp41截短体的融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化和鉴定

用基因重组技术将截短的HIV－1 p24基因和gp41基因连接成嵌合基因,插入质粒pGEX-4T3,构建成重组表达质粒pGEX-F。将pGEX-F转化大肠杆菌BL21。经IPTG诱导表达,pGEX-F在大肠杆菌BL21中获得了高效表达。融合蛋白P24－gp41经Glutathione-Sepharose4B亲和层析纯化后,用间接ELISA和免疫印迹检测HIV抗体阳性血清和正常人血清,P24－gp41只与HIV抗体阳性血清反应,证明获得的融合蛋白P24－gp41有很强的抗原特异性和免疫反应性,具有较高的应用价值。     

Renaturation and stabilization of the telomere-binding activity of Saccharomyces Cdc13(451-693)p by L-arginine.

Production of recombinant proteins can be valuable in studying their biological functions. However, recombinant proteins expressed in Escherichia coli sometimes form undesirable insoluble aggregates. Solubilization and renaturation of these aggregates becomes a problem that one needs to solve. Here we used recombinant Cdc13(451-693)p as example to show the presence of l-arginine during renaturation greatly enhanced the renaturation efficiency. Cdc13p is the single-stranded telomere-binding protein of yeast Saccharomyces cerevisiae. The telomere-binding domain has been mapped within amino acids 451-693 of Cdc13p, Cdc13(451-693)p. Recombinant Cdc13(451-693)p was expressed in E. coli as insoluble protein aggregates. Purification of insoluble Cdc13(451-693)p was achieved by denaturing the protein with 6 M guanidine-HCl and followed by Ni-nitrilotriacetic acid agarose column chromatography. Renaturation of Cdc13(451-693)p to the active form was achieved by dialyzing denatured protein in the presence of l-arginine. Moreover, the presence of l-arginine was also helped in maintaining the telomere-binding activity of Cdc13(451-693)p. Taking together, l-arginine might have a general application in renaturation of insoluble aggregates.     

Epstein-Barr病毒包膜糖蛋白gp85的原核表达

目的:利用大肠杆菌BL21诱导表达GST-gp85融合蛋白,进行动物免疫制备多克隆抗体。方法:通过PCR反应从EB病毒转染的绒猴淋巴细胞系B95-8细胞中获得了gp85BXLF2基因,将此基因克隆到大肠杆菌表达载体pGEX-5T,得到阳性克隆pGEX5T-85。转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达重组蛋白,表达产物经SDS-PAGE分析、尿素变性、复性和亲和层析纯化,并用初步纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠。结果:SDS-PAGE可见在相对分子质量约100000处有蛋白条带,Western印迹表明该蛋白可与免疫的BALB/c小鼠血清及鼻咽癌血清起特异性反应。结论:在大肠杆菌细胞中成功表达了GST-gp85融合蛋白,该蛋白具有较好的抗原性和免疫原性。     

Biophysical analysis of the endoplasmic reticulum-resident chaperone/heat shock protein gp96/GRP94 and its complex with peptide antigen

Animals vaccinated with heat shock protein (HSP)--peptide complexes develop specific protective immunity against cancers from which the HSPs were originally isolated. This autologous specific immunity has been demonstrated using a number of HSP--peptide antigen complexes. A prototypical HSP-based cancer vaccine is the gp96--peptide antigen complex, which is currently undergoing human clinical trials. Here, we analyzed the structure of a recombinant wild-type and a mutant gp96 protein and their peptide complexes using a number of biophysical techniques. Gel filtration chromatography, dynamic light scattering, and equilibrium analytical ultracentrifugation demonstrated that both a wild-type gp96 and a gp96 mutant lacking a dimerization domain formed higher order structures. More detailed analysis using scanning transmission electron microscopy indicated that both the wild-type and dimerization deletion mutant gp96 protein were organized, unexpectedly, into large aggregates. Size distributions ranged from dimers to octamers and higher. Circular dichroism and intrinsic Trp fluorescence suggested that the gp96 dimerization domain deletion mutant protein was more compact than the wild-type gp96. A fluorescent peptide antigen was synthesized, and the peptide-binding properties of wild-type and the dimerization domain deletion mutant gp96 were studied. Fluorescence lifetime and anisotropy decay showed that the bound antigenic peptide was located in a hydrophobic pocket, with considerable free space for the rotation of the probe. Deletion of the dimerization domain affected the peptide-binding microenvironment, although peptide-binding affinity was reduced by only a small extent. Peptide--gp96 complexes were extremely stable, persisting for many days in the cold. The extraordinary stability of peptide--gp96 complexes and the plasticity of the peptide-binding pocket support the proposed relay of diverse peptides to MHC and/or other molecules via molecular recognition.     

禽网状内皮组织增生病病毒gp90全长蛋白的原核表达、纯化及其免疫原性分析

摘要：【目的】原核表达免疫原性良好的禽网状内皮组织增生病病毒（( Reticuloendotheliosis virus, REV )gp90蛋白,并制备抗gp90蛋白高效价多克隆血清。【方法】利用PCR技术,以pMD18T-env为模板,扩增得到REV的gp90蛋白编码基因,将其克隆入表达载体pET-28a(+)中,将构建的原核表达质粒pET28-gp90,转化大肠杆菌（Escherichia coli ) BL21 (DE3) 感受态细胞,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导后进行gp90蛋