大鼠胚胎脑皮层神经干细胞的分离和培养

目的探讨分离、培养、纯化大鼠胚胎神经干细胞(neuralstem cell,NSCs)的最佳条件,以获得充足的神经干细胞来源,用于中枢神经系统疾病的治疗.方法分离孕13～15 d胎鼠大脑皮层,在无血清含神经生长因子N2培养液中培养,利用有限稀释法单克隆培养和改良法连续传代纯化并扩增NSCs,免疫组织化学法对NSCs及分化细胞进行鉴定.结果可以通过体外培养获得大量神经源性干细胞,在体外经多次传代后仍具有很强的增殖能力和多向分化潜能.结论NSCs的存活和分裂依赖于神经生长因子和N2添加剂的浓度,胚胎脑组织和神经球分离方法影响NSCs的形成速度和数量.掌握NSCs的体外纯化培养和鉴定手段可为进一步研究NSCs生物学特性及神经系统损伤的治疗提供新方法.     

神经干细胞增殖和分化相关信号通路的研究进展

神经干细胞（neuralstemcells,NSCs）是一类来源于中枢神经系统的干细胞,具有自我更新能力及分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的潜能,为中枢神经系统损伤和退行性疾病的治疗提供了新的治疗选择。但如何让NSCs在复杂的信号网络调控中实现有序的增殖、分化,修复受损的神经组织,目前研究还未完全清楚。本文对涉及NSCs增殖和分化相关信号通路的最新进展做一综述。     

神经干细胞免疫调节作用的研究进展

由多种免疫细胞及细胞因子参与介导的免疫应答在神经损伤修复中意义重大。神经干细胞(NSCs)移植可发挥免疫调节作用改善微环境,促进神经修复。为进一步阐明NSCs的免疫调节作用,本文就近年来对NSCs与免疫细胞,NSCs与细胞因子间相互作用的研究进行综述。     

国际动态

体内和体外调控成人骨髓源性神经干细胞的增殖和分化近期研究表明神经干细胞(neural stem cells,NSCs)可以通过许多途径培养获得,包括胚胎、胎儿、成人骨髓以及脑组织等。美国希达西奈医学中心Maxine DunitZ神经外科研究所的研究人员之前曾报道了成体大鼠骨髓源性NSCs球的形成,它们在形态和表型上类似于源于脑NSCs的神经细胞球。目前,该研究小组利用成人骨髓源性NSCs,成功地在体外诱导培养出类似于脑源性NSCs的球型细胞团。研究人员掌握了几个加速骨髓源性NSCs生长的基因,可以在体外诱导干细胞的生长与分化。非增殖型重组腺病毒编码cDNA序列类高血糖素免疫反应物(Gli)、重组腺病毒-类高血糖素免疫反应物-1(rADV-Gli-1)、音猬因子(sonic     

胎鼠神经干细胞移植对大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡及凋亡抑制基因Bcl-2表达的影响

目的研究胎鼠神经干细胞(NSCs)移植对大鼠脊髓损伤(SCI)后神经细胞凋亡及凋亡抑制基因Bcl-2表达的影响。方法 40只SD大鼠随机分为正常对照组(Normal组),脊髓损伤组(SCI组),神经干细胞组(NSC组),神经干细胞标记组(BrdU+NSCs组)。采用电控脊髓损伤打击装置制作模型,5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Br-dU)法标记处于对数生长期的NSCs,SCI后即刻进行NSCs移植。免疫组化法观察BrdU标记NSCs的存活、迁移及凋亡抑制基因Bcl-2的表达,TUNEL法标记凋亡细胞(免疫组化及免疫荧光显色),改良Rivlin法观察大鼠后肢运动功能的恢复情况。结果 BrdU+NSCs组在损伤脊髓区域可检测到BrdU标记的阳性NSCs。BrdU+NSC组与NSC组各时间点凋亡阳性细胞数均比SCI组减少(P<0.01),Bcl-2免疫阳性细胞光密度值比SCI组明显增加(P<0.01),且Bcl-2表达高峰延长至伤后7d;移植后7d、14d、28d后肢运动功能评分较SCI组明显升高(P<0.01)。Br-dU+NSC组与NSC组之间比较无明显差异(P>0.05)。结论体外培养的胚胎大鼠NSCs可在脊髓损伤区域存活、迁移,并能通过上调Bcl-2的表达来抑制大鼠脊髓损伤后神经细胞的凋亡,从而促进大鼠瘫痪肢体功能的恢复。     

表皮生长因子促进室管膜下区神经干细胞向梗死灶迁徙和分化

成年动物脑室管膜下区 (subventricularzone,SVZ)内的神经干细胞 (neuralstemcells,NSCs)对脑梗死有增殖和迁徙反应 ,但神经元分化比例太小而不能重建神经功能 ,如何调控内源性NSCs使其向神经元分化是目前卒中后神经可塑性研究的热点之一。众多研究已发现 ,表皮生长因子 (epi dermalgrowthfactor,EGF)在体外促使NSCs增殖 ,而脑室内注入EGF甚至可促使SVZ内NSCs离开脑室壁到达脑实质 ,表明EGF可作为正常成年脑SVZ内NSCs的调控因素之一。本研究评估大鼠实验性脑梗死后 ,脑室内注入EGF对SVZ内NSCs增殖、迁徙和分化的作用 ,以及…     

神经干细胞在wistar大鼠体内、外追踪胶质瘤细胞的特性

目的 观察在胶质瘤细胞存在这一病理状态下,神经干细胞(neural stem cells,NSCs)在体内、外的迁移特点;了解导入NSCs的外源基因在迁移过程中的表达情况。方法 分离、培养NSCs,脂质体介导pIRES2-EGFP质粒转染NSCs,BrdU标记NSCs;共同培养胶质瘤细胞和NSCs,观察NSCs在体外的迁移特点;制作大鼠颅内胶质瘤模型,用转染EGFP基因和BrdU标记的NSCs接种颅内胶质瘤,免疫组织化学检测,观察NSCs在体内的迁移特点,了解导入NSCs的外源基因在颅内的表达情况。结果 培养成功了Wistar胎鼠大脑NSCs,成功将EGFP基因导入NSCs,NSCs在体内、外显示了对胶质瘤细胞强烈的追踪特性,同时表达外源基因的产物。结论 NSCs在体内、外具有追踪胶质瘤细胞的特性,同时能够表达外源基因的产物。     

miRNAs与胶质瘤干细胞耐药性研究进展

<正>脑胶质瘤是最常见的颅内肿瘤,其预后差,死亡率高,极大地威胁着患者的生命。研究表明恶性胶质瘤患者在接受常规综合治疗(手术、放疗、化疗)后,中位生存期也仅一年左右[1,2]。2003年Singh等[3]基于肿瘤细胞和干细胞自我更新能力、无限增殖能力和多向分化潜能的相似性,以CD133为标志物,采用免疫磁珠法从胶质瘤标本中分离出与神经干细胞(neural stem cells,NSCs)相似的脑肿瘤干细胞(brain tumor     

成体神经干细胞和微环境

神经干细胞(neural stem cells,NSCs)是一种终身具有自我更新能力和多向分化能力的细胞,能分化产生神经系统的各类细胞。它具有以下特征:(1)可生成神经组织或来源于神经系统;(2)具有自我更新能力;(3)可通过不对称细胞分裂产生新的细胞[1]。目前已从胚胎及成年脑组织中分离、纯化出NSCs[2]。NSCs移植治疗能促进神经元的再生及脑组织的修复,重建神经网络,恢复已丧失的功能。然而,NSCs移植后,只有1%~3%的细胞长期存活。如果将这种现象简单归因于免疫排斥是不全面的,因为即使采用各种免疫移植药物,也不能显著延长细胞移植物的存活。同时,移…     

神经干细胞的体外培养与鉴定

神经干细胞(neural stem cells,NSCs)是具有自我更新能力和多向分化潜能的祖细胞,近年来,NSCs选择性培养法及NSCs的永生化的发展,使得体外长期大量扩增NSCs成为可能。Nestin和Musashil是目前常用的鉴定NSCs的特异性标记物。另外骨髓基质细胞、脐血干细胞来源的NSCs为中枢神经系统细胞移植提供了新的细胞来源。现就中枢神经系统干细胞的体外培养及鉴定进行综述。     

脑源性神经营养因子基因修饰的神经干细胞对脑卒中大鼠认知功能的机制研究

目的 探究脑源性神经营养因子(BDNF)基因修饰神经干细胞对脑卒中大鼠认知功能的机制。方法 体外分离并培养神经干细胞(NSCs),Nestin染色鉴定NSCs;BDNF修饰NSCs,并采用蛋白印迹法检测BDNF蛋白表达。将40只大鼠随机分为4组,即假手术组(sham组)、卒中组(MCAO组)、卒中大鼠给予NSCs组(NSCs组),卒中大鼠给予BDNF-NSCs组(BDNF-NSCs组),每组10只。对大鼠进行神经功能缺损评分,采用Morris水迷宫实验检测大鼠认知功能;苏木精-伊红染色法检测神经元损伤;TTC检测脑组织梗死面积;蛋白印迹法检测脑组织中胞内磷脂酰肌醇激酶、人磷酸化磷脂肌醇3激酶、苏氨酸蛋白激酶、磷酸化蛋白激酶蛋白表达。结果 免疫荧光细胞化学染色鉴定NSCs,培养的NSCs中巢蛋白和溴脱氧尿苷均呈阳性表达,提示所提取的NSCs为神经干细胞且具有增殖能力。和未转染组和阴性对照组相比,转染BDNF组BDNF蛋白表达明显增加(P<0.05)。和sham组相比,MCAO组大鼠神经功能评分、逃避潜伏期、脑梗死面积明显增加,穿越平台次数和脑组织中PI3K、p-PI3K、Akt、p...     

神经干细胞分化的神经元离子型谷氨酸受体NMDA亚单位的mRNA和蛋白表达

目的在体外研究由大鼠神经干细胞(NSCs)分化而来神经元细胞中离子型谷氨酸NMDA受体表达。方法分离培养孕14～16d胎鼠皮质和海马神经干细胞，对NSCs进行nestin和分化鉴定。通过RT—PCR、Western blot免疫印迹和免疫组化检测NSCs分化的神经元细胞中离子型谷氨酸NMDA受体亚单位NR1、NR2A和NR2B的mRNA和蛋白表达。结果从孕14～16d胎鼠大脑中分离培养出NSCs，NSCs分化后的神经元可以表达离子型谷氨酸NMDA受体亚单位NR1、NR2A和NR2B。结论由NSCs分化而来的神经元能表达离子型谷氨酸NMDA受体。     

诱导成人骨髓基质细胞成为神经干细胞及其分化的实验研究

目的　体外诱导成人骨髓基质细胞 (BMSCs)转化为神经干细胞 (NSCs)进而分化为神经元和胶质细胞。方法　以含有碱性成纤维细胞生长因子 (b FGF)或表皮生长因子 (EGF)加 b FGF或 b FGF、EGF加全反式维甲酸 (ATRA)的培养液培养 BMSCs,进行显微镜观察 ,纤维连接蛋白 (fibronectin)、I型胶原 (collagen )和神经上皮干细胞蛋白 (nestin)免疫组织化学染色和神经元特异烯醇化酶 (NSE) ,胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)免疫荧光染色。结果　经诱导物诱导 72 h后 ,fibronectin和 collagen I免疫阳性细胞减少。nestin免疫阳性细胞增多。 7d后 ,其又减少。同时 NSE和 GFAP免疫阳性细胞增多。细胞分化后 ,NSE阳性细胞最多占细胞总数的 2 4 .76 %±2 .72 % ,同时 GFAP阳性细胞占细胞总数的 36 .5 8%± 3.2 6 %。结论　 EGF、b FGF、ATRA及适宜的培养液可使BMSCs定向 ,转化为 NSCs,进而分化为神经元和胶质细胞。     

神经干细胞荷载溶瘤病毒靶向调控肿瘤微环境治疗脑胶质母细胞瘤

胶质母细胞瘤(GBM)是临床中最常见的颅内原发性恶性脑肿瘤，预后差、病死率高，目前缺乏有效的治疗手段。作为新型免疫治疗的溶瘤病毒(OV)具有特异性裂解肿瘤细胞的特点，并能够通过调节肿瘤微环境发挥抗肿瘤免疫反应。由于机体预先存在针对病毒的免疫力，OV在肿瘤组织的扩散能力及穿透性不佳等原因限制了其治疗效果。神经干细胞(NSCs)的肿瘤“归巢”特性及在脑实质内良好的迁移能力，可以作为OV的理想载体。临床前研究及Ⅰ期临床试验均表明NSCs荷载OV对GBM具有明显的治疗效果。文中对NSCs荷载OV靶向调控肿瘤微环境，达到治疗GBM的可能和挑战性进行文献学习。     

BRCA-1基因调控大鼠神经干细胞增殖的实验研究

目的 探讨BRCA-1基因在17β-雌二醇刺激下从大鼠分离培养的神经干细胞(NSCs)增殖中的作用.方法 成体SD大鼠海马NSCs的分离、纯化和培养.分为对照组及加入不同浓度的17β-雌二醇溶液共6组.于1d、7d、14d、21d分别将各组细胞进行传代培养及Nestin、BrdU免疫荧光检测,激光共聚焦显微镜对其表达进行定量分析.收集以上各时间点的NSCs以荧光定量RT-PCR法检测BRCA-1基因的表达,Western Blot法检测BRCA-1蛋白表达.相关性分析研究神经干细胞增殖与BRCA-1基因表达的关系.结果 与对照组相比,Nestin表达及BrdU荧光强度在10-5、10-6、10-717β-雌二醇组逐渐加强,各实验组BRCA-1 mRNA及蛋白表达增加,统计学差异均有显著意义.NSCs增殖量大时BRCA-1基因及蛋白的表达量也增高.相关性分析说明神经干细胞的增殖与BRCA-1基因表达存在正相关趋势(相关系数r＝0.46).结论 17β-雌二醇作为一种辅助因子可以促进神经干细胞的增殖.其作用与其浓度有关.BRCA-l基因能够调控成体神经干细胞的增殖.成体神经干细胞的增殖与BRCA-l基因表达蛋白量成正相关.BRCA-l基因的表达受到雌激素的调控,为正向调控.     

神经干细胞移植治疗中枢神经系统疾病的研究进展

神经干细胞(neuralstemsells,NSCs)具有多向分化潜能和自我更新能力及低免疫源性,从人和动物的胚胎和成体神经组织均可获得神经干细胞,体外培养或定向诱导分化后可做为移植治疗神经系统疾病的理想细胞来源。通过各种手段使内源性神经干细胞与移植的神经干细胞分化为适当的神经细胞来重建受损的神经结构,从而促进丧失的神经功能恢复。神经干细胞向病变部位的趋向迁徙性使其成为理想的药物与基因载体用于治疗恶性肿瘤和一些遗传性疾病。神经干细胞移植治疗神经系统疾病具有广阔的应用前景。     

神经干细胞增殖与分化调控的研究进展

神经干细胞（NSCs）是具有自我更新及多种分化潜能的细胞，具有广阔的临床应用前景。对NSCs增殖与分化的研究是应用NSCs的基础．其增殖分化受细胞因子、细胞外基质和神经传递素等多种因素影响。本文就目前对NSCs增殖分化调控的研究现状进行综述。     

体外三步法诱导胚胎干细胞定向生成神经干细胞的实验研究

目的 探讨体外定向诱导胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)生成高纯度神经干细胞(neural stem cells，NSCs)的方法。方法 模拟体内神经细胞分化发育的不同阶段及微环境，以脑星形胶质细胞为支持细胞，用全反式维甲酸(All-trans retinoic acid，ATRA)等分三阶段诱导ESCs定向生成NSCs。形态学观察及畸胎瘤形成试验对ESCs的全能性进行鉴定；形态学观察结合免疫组织化学、流式细胞术和RT-PCR检测胚胎干细胞标志OCT-4和神经干细胞标志Nestin蛋白和(或)基因表达对诱导全过程进行动态监测；NSCs分化试验对所诱导的NSCs的分化潜能进行检测。结果(1)体外培养的小鼠ESC-D3细胞在胚胎成纤维饲养层细胞上连续传代培养，仍保持向三胚层分化的能力；(2)随着诱导的进行，OCT-4表达逐渐减弱并消失，而Nestin表达逐渐增强，经三步法最终可诱导形成纯度高达90％以上的Nestin阳性细胞；(3)所诱导生成的细胞在NSCs选择性培养基中反复传代，仍表现为Nestin阳性和具有生成神经球的能力，在含血清培养基中可进一步分化为神经元、星形神经胶质细胞和少突胶质细胞。结论采用星形胶质细胞作为诱导基质，模拟体内神经分化过程的三步诱导法，可诱导ESCs生成较高纯度的NSCs，并能较好维持其干细胞特性和具有进一步分化的能力。     

磁共振报告基因示踪神经干细胞的研究进展

近年来,随着分子影像学技术的进步,细胞示踪技术取得了长足的进步.为了能够对移植后的神经干细胞(neural stem cells,NSCs)及其分化细胞与宿主自身神经细胞加以鉴别和示踪,经常需要在干细胞移植前对其进行合适的标记.同时,研究人员非常希望能够在合适的示踪剂帮助下,利用无创伤性影像学技术识别移植后NSCs,活体监测NSCs在脑内的存活、迁移、整合乃至成瘤情况,借此来正确评价NSCs移植的疗效,并作为客观评价神经功能恢复程度的指标.当前细胞治疗在临床多种疾病的应用逐渐开展和深入,如何示踪和定量到靶器官或病灶的细胞是急需解决的问题,也是细胞治疗临床推广应用的关键技术之一[1],特别是干细胞治疗以及以干细胞为载体的基因治疗是目前医学领域的研究热点.     

悬浮培养与贴壁培养方式神经干细胞分化表型特点

目的观察神经干细胞在悬浮培养与贴壁培养方式下的形态学特点及分化表型。方法新生6 h内的大鼠皮质应用无血清悬浮培养与贴壁培养神经干细胞(NSCs)技术培养,观察神经干细胞的形态学特点。体外胎牛血清(FBS)诱导NSCs分化,通过巢蛋白(Nestin)和GFAP免疫荧光染色鉴定分化表型。台盼蓝活细胞计数法比较细胞增殖能力。结果新生大鼠皮质应用无血清悬浮培养可获得稳定的NSCs细胞球,应用贴壁培养形成长梭状NSCs,NSCs巢蛋白免疫荧光染色结果呈阳性。体外FBS诱导分化后,神经球内开始出现放射状的神经纤维丝,免疫荧光染色可见GFAP阳性细胞向外伸展以及Nestin阳性细胞边集。贴壁的NSCs分化成星形胶质细胞,免疫荧光染色可见Nestin和GFAP染色阳性细胞。在相同条件下,应用悬浮培养在第2~3 d时增殖速度最大,而以贴壁培养方式培养出的神经干细胞在第4~5 d时增殖速度最大。结论应用无血清培养物B27与b FGF、EGF组合的NSCs完全培养基通过悬浮培养法与贴壁培养法,都可以成功在体外培养出NSCs;悬浮培养法培养NSCs在早期增殖速率上优于贴壁培养法。