Cripto-1在食管癌组织中的表达及其与上皮间质转化的关系

目的 探讨Cripto-1在食管癌组织中的表达及其与上皮-间质转化(EMT)的关系.方法 采用RT-PCR、Western blotting检测41例食管癌患者癌组织、癌旁组织及正常食管黏膜组织中Cripto-1的表达;采用免疫组织化学法检测食管癌组织中Cripto-1及EMT标记物(N-钙黏蛋白、波形蛋白、E-钙黏蛋白)的表达,并结合临床病理资料分析Cripto-1蛋白与N-钙黏蛋白、E-钙黏蛋白、波形蛋白表达的相关性.结果 食管癌组织、癌旁组织及正常食管黏膜组织中Cripto-1 mRNA表达水平分别为0.35±0.08、0.22±0.04、0.13±0.03,Cripto-1蛋白表达水平分别为0.62±0.06、0.45±0.07、0.33±0.05,均明显高于癌旁组织及正常食管黏膜组织(P＜0.05).免疫组化染色显示,食管癌组织中Cripto-1、N-钙黏蛋白、波形蛋白、E-钙黏蛋白的阳性表达率分别为53.7％、51.2％、61.0％、36.6％.Cripto-1蛋白表达与N-钙黏蛋白及波形蛋白表达呈正相关(r=0.463,r=0.460,P＜0.05),与E-钙黏蛋白表达呈负相关(r=-0.310,P＜0.05),与淋巴结转移、远处转移及临床分期显著相关(P＜0.05).结论 Cripto-1在食管癌组织中表达增高,可能与食管癌的发生、发展相关,并可能通过调控EMT促进食管癌的转移.     

上皮间质转化在结直肠癌肿瘤干细胞富集过程中的作用观察

目的 探讨悬浮培养法富集结直肠癌肿瘤干细胞(CSCs)的过程是否与诱导上皮间质转化(EMT)有关.方法 以采用悬浮培养法培养出的结直肠癌SW620细胞3D微球体及其亲本细胞SW620为研究对象.采用流式细胞技术、Western blotting检测CSCs标记物CD44、Ep-CAM的表达,并行软琼脂克隆实验、NOD/SCID小鼠成瘤实验,以验证3D微球体是否富集CSCs;采用Western blotting检测EMT标记物E-钙黏蛋白(E-Ca)、N-钙黏蛋白(N-Ca)及波形蛋白(Vim)在3D微球体细胞及亲本SW620细胞中的表达差异.结果 与亲本SW620细胞比较,3D微球体细胞软琼脂克隆形成能力明显增强(P＜0.01),NOD/SCID小鼠成瘤能力明显提高,CD44+细胞百分比增加,Ep-CAM蛋白表达量明显增高(P＜0.01),上皮细胞标记物E-Ca表达明显降低(P＜0.01),而间质细胞标记物N-Ca和Vim表达明显增高(P＜0.01).结论 悬浮培养法富集结直肠癌CSCs可能与诱导EMT有关.     

CXCR4反义核酸对结肠癌细胞VEGF-C mRNA表达的影响及体外侵袭的抑制作用

目的 研究趋化因子受体CXCR4反义核酸转染对结肠癌细胞HT-29血管内皮生长因子-C(VEGF-C)mRNA功能性表达和其体外侵袭能力的影响.方法 利用自行设计的引物,借助RT-PCR技术获得两端含不同限制性酶切位点的CXCR4 cDNA片段,反向插入pcDNA 3.1( )质粒中,构建CXCR4反义真核表达载体.以脂质体转染法将质粒导入HT-29细胞,用RT-PCR检测其对HT-29细胞VEGF-C mRNA表达的影响,Western blot检测HT-29细胞CXCR4蛋白表达的变化,MTT法测定HT-29细胞的生长曲线,体外侵袭实验观察转染前后HT-29细胞体外侵袭能力的变化.结果 成功构建了CXCR4反义重组质粒.与未转染(HT-29)组表达的VEGF-C mRNA相比,CXCR4反义核酸转染(HT-29tran)组的表达量下降54.2%,而空白质粒转染(HT-29KZ)组的表达量仅下降9.4%,HT-29tran组和HT-29KZ组相比差异显著(P＜0.01).穿膜细胞百分率HT-29tran组为61.3%±5.8%,而HT-29KZ组为93.7%±7.8%,两组相比差异显著(P＜0.05).结论 CXCR4反义核酸转染可明显抑制HT-29细胞VEGF-C mRNA的表达,并可显著降低HT-29细胞的体外生长和侵袭能力.     

IDH1基因在肝内胆管癌细胞HuCCT1增殖与迁移中的作用及其初步机制

目的 探讨异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)在肝内胆管癌(iCCA)细胞HuCCT1增殖与迁移中的作用及其可能的分子机制。方法 采用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建IDH1基因敲除的HuCCT1细胞(HuCCT1^IDH1-/-);CCK-8法和克隆形成实验检测IDH1野生型HuCCT1(HuCCT1^WT)细胞和HuCCT1^IDH1-/-细胞的增殖能力;细胞划痕和Transwell实验检测细胞的迁移和侵袭能力;Western blotting检测细胞上皮间质转化(EMT)相关蛋白E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、Wnt3a、β-连环蛋白(β-catenin)的表达水平。生物信息学方法分析上述两种HuCCT1细胞的转录组测序结果,Western blotting验证转录组信息通路相关蛋白的表达。结果 与HuCCT1细胞比较,HuCCT1^IDH1-/-细胞增殖和克隆形成数目明显减少(P<0.05...     

1504-siRNA对EphA3表达肿瘤细胞HCT116的抑制作用研究

目的研究原癌基因EphA3的小干扰RNA(small interfering RNA)1504-siRNA对高表达结肠癌细胞HCT116的增殖抑制作用。方法将1504-siRNA质粒用Vigofect转染试剂瞬时转染HCT116细胞,36～48 h后,收集蛋白,用Western印迹检测EphA3及AKT信号通路中的蛋白分子表达,收集细胞,进行噻唑蓝(MTT)实验、平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验。结果 1504-siRNA能抑制HCT116细胞的EphA3蛋白水平,抑制其增殖、平板克隆和软琼脂克隆的形成,抑制pmTOR、p-c-Raf、pAKT、p-4ebp1等信号分子的表达。结论 1504-siRNA抑制HCT116细胞的增殖、存活能力和恶性程度,这可能是通过抑制AKT信号通路来实现,它有望作为肿瘤治疗的候选药物。     

1504-siRNA对EphA3表达肿瘤细胞HCT116的抑制作用研究

目的研究原癌基因EphA3的小干扰RNA（small interfering RNA）1504-siRNA对高表达结肠癌细胞HCT116的增殖抑制作用。方法将1504-siRNA质粒用Vigofect转染试剂瞬时转染HCT116细胞,36～48 h后,收集蛋白,用Western印迹检测EphA3及AKT信号通路中的蛋白分子表达,收集细胞,进行噻唑蓝（MTT）实验、平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验。结果 1504-siRNA能抑制HCT116细胞的EphA3蛋白水平,抑制其增殖、平板克隆和软琼脂克隆的形成,抑制pmTOR、p-c-Raf、pAKT、p-4ebp1等信号分子的表达。结论 1504-siRNA抑制HCT116细胞的增殖、存活能力和恶性程度,这可能是通过抑制AKT信号通路来实现,它有望作为肿瘤治疗的候选药物。     

RNA干扰对HT29细胞PIDD蛋白表达及细胞耐药性影响的研究

目的观察氟尿嘧啶（5-FU）刺激后PIDD蛋白在结肠癌HT29细胞中分布的改变,以及小干扰RNA（siRNA）干扰PIDD蛋白前后,HT29细胞耐药性的变化。方法用siRNA干扰HT29细胞内PIDD蛋白的表达,用5-FU刺激HT-29细胞。West-ern blotting法检测干扰前后细胞PIDD的表达,并比较5-FU刺激后干扰与未干扰HT-29细胞内PIDD在细胞中分布的变化。MTT比色法检测siRNA干扰前后细胞对5-FU的敏感性,并计算各组细胞的IC50值。结果未受5-FU刺激前,PIDD蛋白主要分布于细胞质中；受5-FU刺激后,PIDD蛋白迁移至细胞核。siRNA干扰后细胞中PIDD表达总量有所下降,胞质及胞核中的表达均降低,受5-FU刺激后PIDD的表达也未见升高,迁移至胞核的PIDD也未增加。MTT检测证明5-FU对转染组（PIDD-360转染12h后的HT29细胞）的IC50值为0.23&#177;0.06μg/ml,与正常组（未作处理的HT29细胞,IC50为2.71&#177;0.70μg/ml）和对照组（阴性对照试剂转染12h后的HT29细胞,IC50为2.78&#177;1.03μg/ml）比较显著降低（P〈0.05）。结论经siRNA干扰PIDD蛋白后,HT29细胞的耐药性明显下降,推测其机制与胞核中PIDD降低导致的NF-κB活性降低,细胞凋亡增多有关。     

人野生型和突变型CITED2真核表达质粒的构建与表达

目的 构建人转录辅助因子CITED2突变型(c.573-578del6)及野生型真核表达质粒并检测两种重组质粒CITED2蛋白的表达情况.方法 分别以健康儿童和CITED2基因突变的先天性心脏病患儿血细胞DNA为模板,PCR定向克隆扩增野生型和突变型CITED2编码链,分别T/A克隆至pMD19-T simple质粒上,筛选出野生型和突变型CITED2的T载体重组质粒.应用DNA重组技术将T载体重组质粒上的CITED2基因片段亚克隆入真核表达载体pEGFP-C1,构建pEGFP-C1-wtCITED2和pEGFP-C1-mtCITED2真核表达质粒,并分别转染至HEK293细胞,24h后在荧光显微镜下观察质粒转染情况,48h后应用流式细胞仪检测转染效率,Western blotting检测CITED2蛋白的表达.结果 成功构建了人野生型pEGFP-C1-wtCITED2和突变型pEGFP-C1-mtCITED2真核表达质粒.转染至HEK293细胞后24h,在荧光显微镜下可观察到各转染组EGFP的表达,转染后48h流式细胞仪检测转染效率为50％ ～ 60％,Western blotting检测可见CITED2蛋白与EGFP的融合表达.结论 成功构建了人转录辅助因子CITED2突变型及野生型真核表达质粒,并检测到CITED2蛋白的表达.     

紫花前胡苷调控EMT对宫颈癌细胞侵袭迁移的影响及其作用机制

目的 探讨紫花前胡苷（NDK）通过调控上皮-间质转化（EMT）影响宫颈癌细胞侵袭迁移的可能机制,并分析其对miR-324-3P/WNT3a轴的影响。方法 取对数生长期人宫颈癌HeLa细胞,分为4组：空白组（于37 ℃、5%CO₂、饱和湿度培养箱中培养）、miR-324-3P inhibitor组(转染_{hsa-miR-324-3p} inhibitor)、NDK组（加入20 mmol/L浓度的NDK培养）、miR-324-3P inhibitor+NDK组(转染_miR-324-3P inhibitor后加入20 mmol/L浓度的NDK培养),均处理48 h。采用Transwell实验检测各组细胞侵袭能力;细胞划痕实验检测各组细胞的迁移能力;qRT-PCR检测各组细胞中_miR-324-3P、_{WNT3a mRNA表达}水平;Western blotting检测各组EMT相关标志蛋白E-钙黏素（E-cadherin）、波形蛋白、神经型钙黏蛋白（N-cadherin）、WNT3a、β-ca...     

Twist过表达在人腹膜间皮细胞转分化中的作用

目的探讨twist在人腹膜间皮细胞(HPMCs)转分化中的作用。方法取HPMCs细胞,分别用50mmol/L右旋葡萄糖(高糖组)和5.6mmol/L右旋葡萄糖(对照组)刺激48h,采用Western blotting检测twist、E-钙黏素(E-cadherin)、成纤维细胞特异性蛋白1(Fsp1)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达情况。另采用质粒pcDNA3.1-twist(pcDNA3.1-twist组)和空载体pcDNA3.1(空载体组)分别转染常规培养的HPMCs,使HPMCs过表达twist后,采用qRT-PCR、Western blotting方法检测twist、E-cadherin、Fsp1和α-SMA mRNA及蛋白的表达情况。再采用质粒twist小干扰RNA(阳性转染组)和空载体pcDNA3.1(空载体组)分别转染50mmol/LD-葡萄糖培养48h后的HPMCs细胞,另选择未转染质粒的细胞作为亲本细胞组,采用Western blotting检测twist下调后,E-cadher-in、Fsp1、α-SMA蛋白水平的表达情况。结果与对照组相比,高糖组twist、Fsp1和α-SMA蛋白表达明显增加,E-cadherin表达减弱(P<0.05)。与空载体组相比,HPMCs过表达twist后,pcDNA3.1-twist组E-cadherin mRNA及蛋白表达减弱,Fsp1和α-SMA mRNA及蛋白表达增强(P<0.05)。用小干扰RNA使twist沉默后,与亲本细胞组及空载体相比,E-cadherin蛋白表达增加,Fsp1和α-SMA蛋白表达减弱(P<0.05)。结论 Twist过表达促进了HPMCs的转分化。