毛果杨固有无序蛋白质基因克隆及胁迫响应分析

为了解毛果杨中固有无序蛋白PtrIDP1（Potri.010G161200.1）基因的相关信息，探究该基因在毛果杨的不同组织、不同逆境胁迫下的表达特性，本研究根据Phytozome数据库中得到的基因全长序列设计引物，克隆得到该基因的目的片段。该基因完整的CDs区序列长度为423 bp，共编码140个氨基酸。构建亚细胞定位表达载体，瞬时转化洋葱表皮细胞，在激光共聚焦显微镜下观察显示，PtrIDP1定位在细胞核内。利用实时定量RT-PCR技术分析了PtrIDP1基因在毛果杨不同组织中的表达特异性和应对非生物胁迫的表达特性。结果表明：PtrIDP1基因在毛果杨的根、茎、叶中均有表达，其中在根部表达量最低，在茎和叶中相对表达量较高。PtrIDP1基因在高盐和干旱胁迫诱导时其表达量的变化模式不同，初步分析认为PtrIDP1基因参与了毛果杨非生物逆境胁迫的响应过程。     

白桦MYB基因响应激素及盐旱处理的表达研究

转录因子参与到植物激素不同的信号通路中及非生物胁迫的调控中，为研究白桦MYB转录因子家族基因对不同激素信号及非生物胁迫的响应，本研究以野生型白桦（Betula platyphylla）种子为材料，分别用10 μmol·L^-1的茉莉酸甲酯（MeJA）、100 μmol·L^-1的乙烯利（ETH）、20 μmol·L^-1的脱落酸（ABA）、50 μmol·L^-1的细胞激动素（KT）、200 mmol·L^-1 NaCl、100 mmol·L^-1 Mannitol以及水为对照进行处理，对激素处理4周的白桦下胚轴进行表型观察及基因表达分析，结果显示：激素处理能够影响白桦下胚轴及胚根的生长，经过ETH处理的白桦下胚轴和根短于水处理的对照，KT处理过的白桦下胚轴和根长于水处理的对照；MeJA、Ethylene及ABA处理对大部分BpMYBs的表达存在负调控，而BpMYB2，8，12基因上调表达；KT处理后，只有BpMYB11下调表达，其他的BpMYBs基因上调表达；NaCl处理后，大部分基因表现出先下调后上调的表达模式，在48 h被高度诱导；Mannitol模拟干旱处理条件下，大部分基因表现出先微弱上调后下调的表达模式。这些结果说明白桦MYB家族基因能够响应激素、盐和旱的处理，在调控白桦下胚轴及胚根应答外界信号的发育中起作用。本研究为探索激素调控木本植物生长发育的分子机制研究提供了数据和材料。     

长白落叶松转录因子LobHLH34克隆及表达分析

为了解转录因子bHLH在长白落叶松（Larix olgensis）中的功能,探究该基因在长白落叶松不同组织中及不同逆境胁迫下的表达特性,从长白落叶松根、茎和叶3个不同部位的转录组数据中获得bHLH34基因全长序列,并设计引物,克隆得到长白落叶松bHLH34基因,其完整的开放阅读框（ORF）长度为696 bp,共编码231个氨基酸。构建亚细胞定位表达载体,瞬时转化毛果杨（Populus trichocarpa）原生质体,在激光共聚焦显微镜下观察显示,LobHLH34基因定位在细胞核内。系统进化树分析结果显示,长白落叶松与云杉（Picea asperata）、卷柏（Selaginella tamariscina）树种该基因的亲缘关系较近。利用qRT-PCR技术分析了bHLH34基因在长白落叶松中的组织表达特异性和应对非生物胁迫的表达。结果表明LobHLH34基因在长白落叶松的根、茎、叶中均有表达,其中在茎部表达量最低,在叶中相对表达量最高。LobHLH34基因在NaCl、PEG和ABA处理时,不同器官中的表达量也有所不同。推测长白落叶松bHLH34基因参与了植物的生长、发育、响应逆境胁迫的过程,且在不同器官中具有特异性。     

刚毛柽柳ThPP2C基因的克隆和表达分析

蛋白磷酸酶2C（PP2C）是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶,在体内以单体形式存在,由它催化的可逆磷酸化反应是细胞信号转导的重要组成部分,这一过程几乎参与所有的生理和病理过程。本研究从柽柳中克隆获得一条PP2C基因,命名为ThPP2C。该基因开放读码框（ORF）长849 bp,编码282氨基酸,推测蛋白质分子量为30.54 kDa,理论等电点为7.13。qRT-PCR结果显示,0.4 mol·L^-1 NaCl、20%（w/v） PEG₆₀₀₀、150 μmol·L^-1 ABA和100 μmol·L^-1 JA胁迫处理后,ThPP2C基因在刚毛柽柳根和叶中的表达均发生了明显改变,但时空表达模式不完全相同。NaCl、ABA和JA处理后ThPP2C基因在叶中都表现为下调表达。而根中,NaCl和JA胁迫后主要表现为上调表达。ABA处理早期表达下调,随后表达量逐渐增加。与其他3种胁迫不同的是,PEG₆₀₀₀处理后ThPP2C基因在根中明显下调,而在叶中胁迫早期表现不明显,48 h后被高度诱导。表明ThPP2C基因可能参与了刚毛柽柳高盐、干旱以及激素处理的适应过程,但其功能还有待进一步验证。     

水曲柳S6K基因的生物信息学及胁迫和激素下的表达分析

以所获取的水曲柳FmS6K基因（FmS6K1和FmS6K2）为对象,解析其核苷酸序列及其所编码蛋白质的基本信息,探索非生物胁迫和植物激素条件下基因的表达特征。结果表明,FmS6K1和FmS6K2基因长度分别为1 583和1 796 bp,分别编码480和483个氨基酸,二者均含有完整的开放阅读框。FmS6K1为两性蛋白,FmS6K2是亲水蛋白,二者均不含有信号肽。低温（4℃）和盐（NaCl）胁迫均影响FmS6K1和FmS6K2基因的表达,水曲柳根、茎、叶中的FmS6K1和FmS6K2基因对盐更加敏感,FmS6K2基因比FmS6K1基因对低温和盐胁迫的响应更为敏感;外源ABA、GA和IAA均能够影响FmS6K1和FmS6K2基因的表达,FmS6K1在水曲柳根、茎、叶中对外源的IAA响应更大;水曲柳根茎叶中FmS6K2基因均对外源ABA处理有显著上调应答,对外源GA的响应主要在根中,但对IAA的应答主要在茎和叶片中。上述结果表明FmS6K基因在调控植物生长发育和适应逆境胁迫方面扮演重要角色。     

毛果杨CNGC家族全基因组鉴定及胁迫响应分析

植物环核苷酸门控离子通道（cyclic nucleotide-gated channels,CNGC）家族具有多种生物学功能,尤其是在植物的生长发育及逆境胁迫响应中发挥着重要的作用。本研究通过生物信息学方法及qRT-PCR对PtrCNGC家族成员蛋白的基本理化性质与结构特征、系统发育、基因结构和保守基序、启动子顺式作用元件,以及基因表达模式进行分析。结果表明：在毛果杨（Populus trichocarpa）全基因组中共鉴定出19个PtrCNGC基因,PtrCNGC家族成员可分为4个亚群（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ亚群）,其中第Ⅳ亚群分为2个亚组（Ⅳa组和Ⅳb组）。PtrCNGC基因编码的蛋白均为碱性蛋白,此外,该家族仅有1个成员为疏水性蛋白,其余成员全部为亲水性蛋白。19个PtrCNGC不均匀地分布于毛果杨的11条染色体上,剩余8条染色体上没有成员分布。PtrCNGC家族包含7对同源基因且它们之间的K_a/K_s值均远小于1。PtrCNGC家族各亚群成员之间的基因结构、蛋白保守基序分布差异较小。启动子顺式作用元件预测分析发现,PtrCNGC基因序列启动子区域存在响应多种激素以及逆境胁迫相关的作用元件。qRT-PCR结果表明,PtrCNGC家族在不同组织中的表达具有特异性,在茎中的表达量较高,在根和叶中的表达量较低;在盐胁迫和干旱胁迫下,PtrCNGC家族同一分支上的多数成员表现出相似的表达模式。本研究结果为进一步研究毛果杨CNGC家族在非生物胁迫中的功能提供参考。     

毛果杨nsLTP基因家族全基因组水平鉴定及其表达特性分析

植物非特异性脂质转移蛋白（non-specific lipid transfer proteins,nsLTP）是一类多基因家族编码碱性蛋白,负责脂肪酸体外结和与膜之间的磷脂转移,在植物生长发育和逆境胁迫响应中扮演着重要角色。目前为止,尚无模式植物毛果杨（Populus trichocarpa）nsLTP家族的研究报导。本研究从全基因组水平对PtrnsLTP家族成员的基因数量、亲缘关系、基因结构、编码蛋白保守基序等特性进行了分析,结果表明：PtrnsLTP家族共由39个基因组成,进化成5个亚家族,其中A亚族含有6个基因、B亚族含有2个、C亚族含有13个、D亚族含有3个、E亚族含有15个。PtrnsLTP家族包含7对旁系同源基因,其中1对大于1,6对Ka/Ks均远小于1,且这6对基因均处于同一个大的进化分支上,进化压力的不同导致基因间的功能出现了分化,编码蛋白均含有Motif 1和 Motif 2保守基序。利用qRT-PCR技术并结合杨树转录组数据对PtrnsLTP的组织表达与盐胁迫响应特性研究发现：各家族成员在毛果杨根、茎和叶中均有表达且经qRT-PCR技术验证后与网站预测结果基本吻合,有11、15和13个成员分别在根、茎和叶中有较高的表达,表明该基因家族参与了杨树不同组织的生长发育;NaCl胁迫下,该家族39个基因中分别有26个成员在根部、14个成员在叶部表达量随着胁迫时间的增加而升高,而32个基因在茎部表现为先升高后降低的趋势。本研究结果对于PtrnsLTP家族基因生物学功能的鉴定与盐胁迫响应基因资源的工作有着积极的推动作用。     

胡杨PeNAC121基因启动子的分离鉴定和胁迫应答模式分析

为了探究NAC转录因子家族成员在胡杨（Populus euphratica）逆境胁迫中的响应和调控机制,利用PCR技术从胡杨中克隆了PeNAC121基因的启动子序列,并采用生物信息学工具对该启动子的结构特征进行了分析,最后利用该启动子驱动GUS报告基因在三倍体毛白杨（Populus tomentosa）中表达,并对获得的转基因植株采用不同胁迫处理后进行了GUS染色和酶活性定量分析。结果表明,克隆获得的PeNAC121基因的启动子长度为1 997 bp（起始密码子ATG上游）,启动序列中除了含有大量的光响应元件,还含有多个与非生物逆境胁迫和激素响应相关的元件,如低温响应元件LTR、干旱响应元件MBS、防卫和胁迫响应元件TC-rich repeats、脱落酸（ABA）响应元件、以及赤霉素（GA）响应元件等。基因的组织表达模式检测结果显示,PeNAC121基因主要在茎中表达,在根和叶中的表达较少。GUS组织化学染色和酶活性检测结果表明,胡杨PeNAC121启动子显著受到NaCl、甘露醇、ABA和4 ℃低温的诱导表达。由上述结果推测PeNAC121基因与胡杨的逆境胁迫应答密切相关,表明该基因的启动子是一个能够应答多种逆境胁迫的诱导型启动子。本研究为阐明PeNAC121基因在胡杨逆境响应和调控中的作用机制提供理论参考。     

大青杨PubZIP1基因的克隆及亚细胞定位与抗旱表达特性分析

从大青杨中克隆得到PubZIP1基因,通过基因测序结果可知,PubZIP1基因全长1 083 bp,编码360个氨基酸。分析得出PubZIP1蛋白含有BZIP和DOG1两个结构域,其二级结构包括α-螺旋（62.50%）、无规卷曲（29.72%）、延伸链（5.56%）、β-折叠（2.22%）。通过亚细胞定位试验表明PubZIP1基因位于细胞核。通过qRT-PCR分析表明,在模拟干旱的不同7% PEG6000胁迫时间下,分析结果表明胁迫后PubZIP1基因在大青杨根中的表达量呈下降趋势。而在大青杨茎和叶片中的表达量呈上升趋势,尤其是在叶片中明显被诱导表达。预测该基因可能主要在叶片中表达并行使功能。     

小黑杨转录因子PsnbHLH162基因在盐和低温胁迫下应答分析

为揭示小黑杨(Populus simonii×P. nigra)在面对非生物胁迫时,转录因子PsnbHLH162在植物体内发挥的作用,同时探究该基因在植物体内的信号转导过程,进而为未来获取优良的抗逆树种提供理论基础。以小黑杨为原材料,克隆获取PsnbHLH162基因,对目的基因和启动子进行生物信息学分析;之后用150 mmol·L^-1 NaCl、4℃低温分别对野生型小黑杨进行胁迫处理,利用荧光定量PCR,分析基因响应非生物胁迫的功能。结果显示：PsnbHLH162 cDNA基因片段长537 bp,基因N端内含1个高度保守的HLH结构域。该基因表达蛋白是不含跨膜区域的稳定的亲水性蛋白,其定位在细胞核内且没有转录激活活性。启动子区域内含多种ABA应答、生长素应答、光应答和circadian元件,证实此基因参加非生物胁迫应答。荧光定量PCR结果表明在盐胁迫下,与茎、叶组织相比,基因在根组织的表达量最高;在低温胁迫下,与叶、根组织相比,基因在茎组织的表达量最高。发现野生植株内,PsnbHLH162能被盐、低温诱导表达。     

毛白杨PtLFY基因启动子的克隆及其瞬时表达分析

为了研究毛白杨LEAFY同源基因PtLFY的表达调控规律,利用PCR技术从毛白杨基因组DNA中克隆出PtLFY基因上游一段1575 bp的序列。经PLACE、PlantCARE在线软件分析表明,该序列含有TATA-BOX、CAAT-BOX等启动子基本元件,另外,还包含干旱诱导的MYB结合位点、脱落酸(ABA)响应元件、光响应元件等其他一些调控序列。因此,PtLFY的表达可能受干旱、ABA、光照等因子的调控。利用FootPrinter在线软件对毛白杨等6个物种的LFY同源基因启动子进行比对,发现不同物种的启动子相对保守,但也存在差异,说明LFY基因在功能上具有相似性,但存在一定差异。在序列分析的基础上,构建由PtLFY启动子驱动GUS报告基因的植物表达载体,命名为PtLFYp1304。通过农杆菌介导的方法转化烟草,对该启动子进行瞬时表达研究,结果表明PtLFY启动子可以驱动GUS基因在烟草根、茎、叶和花器官中表达,但在根、茎、叶中仅微弱表达,表达强度明显低于CaMV35S启动子,而在花萼和雄蕊中表达强烈。     

长白落叶松过氧化氢酶LoCAT1基因克隆及表达分析

为了解长白落叶松过氧化氢酶(CAT)基因的相关信息,探究该基因在长白落叶松不同组织中及不同逆境胁迫下的表达特性,本研究根据长白落叶松转录组数据库中获得的CAT1基因全长序列设计引物,克隆得到长白落叶松CAT1基因,命名为LoCAT1。该基因完整的开放阅读框(ORF)长度为954bp,共编码317个氨基酸。系统进化树分析结果显示,LoCAT1基因与北美云杉、银杏等CAT基因亲缘关系较近。利用实时定量RT-PCR技术分析了LoCAT1基因在长白落叶松中的组织表达特异性和应对非生物胁迫的表达模式。结果表明:LoCAT1基因在长白落叶松的根、茎、叶中均有表达,其中在茎部表达量最低,在叶中相对表达量最高。在非生物胁迫下,LoCAT1基因在长白落叶松根、茎、叶中的表达均发生了变化,但表达模式不同。在NaCl处理后,根和茎中LoCAT1基因均表现为下调表达,在12h时表达量最低,而叶中LoCAT1基因表达在24h明显受抑制,随后被上调表达,胁迫96h时表达量最高。PEG6000处理后,根和茎中LoCAT1基因的表达在胁迫早期被明显抑制,随后被上调表达。而叶中LoCAT1基因的表达在所有时间点均表现为上调表达。本研究推测长白落叶松LoCAT1基因可能参与了植物响应逆境胁迫的应答。     

Upland rice and lowland rice exhibited different PIP expression under water deficit and ABA treatment

Aquaporins play a significant role in plant water relations. To further understand the aquaporin function in plants under water stress, the expression of a subgroup of aquaporins, plasma membrane intrinsic proteins （PIPs）, was studied at both the protein and mRNA level in upland rice （Oryza sativa L. cv. Zhonghan 3） and lowland rice （Oryza sativa L. cv. Xiushui 63） when they were water stressed by treatment with 20% polyethylene glycol （PEG）. Plants responded differently to 20% PEG treatment. Leaf water content of upland rice leaves was reduced rapidly. PIP protein level increased markedly in roots of both types, but only in leaves of upland rice after 10 h of PEG treatment. At the mRNA level, OsPIP1,2, OsPIP1,3, OsPIP2;1 and OsPIP2;5 in roots as well as OsPIP1,2 and OsPIP1;3 in leaves were significantly up-regulated in upland rice, whereas the corresponding genes remained unchanged or down-regulated in lowland rice. Meanwhile, we observed a significant increase in the endogenous abscisic acid （ABA） level in upland rice but not in lowland rice under water deficit. Treatment with 60 μM ABA enhanced the expression of OsPIP1;2, OsPIP2;5 and OsPIP2;6 in roots and OsPIP1;2, OsPIP2;4 and OsPIP2;6 in leaves of upland rice. The responsiveness of PIP genes to water stress and ABA were different, implying that the regulation of PIP genes involves both ABA-dependent and ABA-independent signaling oathways during water deficit.     

2个慈竹bZIP基因的克隆、生物信息学分析及其诱导表达

从慈竹笋转录组数据库中筛选并克隆出2个bZIP基因（BebZIP2和BebZIP6）进行生物信息学分析。分析结果表明,它们编码序列长度分别为504和720 bp,编码167个和239个氨基酸,BebZIP2和BebZIP6属于bZIP相关蛋白,与水稻OsbZIP52/RISBZ5蛋白聚在一枝。组织表达分析表明,这2个慈竹BebZIP基因在慈竹笋、茎、展开叶和未展开叶等部位均有表达,属于组成型表达,同一基因在不同组织中的表达量差异较大,表达量的大小为未展开叶 > 展开叶 > 茎 > 笋。对慈竹幼苗进行ABA、NaCl和PEG6000非生物胁迫处理,结果表明,BebZIP2和BebZIP6对盐、干旱和ABA胁迫均具有不同程度的响应。     

Relations between MAPK phosphorylation and ABA level in <Emphasis Type="Italic">Malus sieversii</Emphasis> under water stress

A correlation between protein kinase phosphorylation and ABA level was studied in Malus sieversii (Ledeb.) Roem. seedlings under water stress. The seedlings were treated with PEG 6000 for imitation of water stress, and the MAPK activity and ABA content in each treatment were then determined. We demonstrated that the increase in the activities of the total protein kinase (TPK) and mitogen-activated protein kinase (MAPK) after treatment with 20% PEG 6000 appeared to result in a high level of ABA. MAPK activity accounted for 76.8% of TPK activity. The activity peaks of TPK and MAPK preceded the highest level of ABA accumulation. It is interesting that the ABA level in roots and leaves of seedlings pretreated with 2 × 10⁻² mM exogenous ABA for 20 min following treatment by 20% PEG 6000 was much higher than that of seedlings treated with exogenous ABA only. We analyzed the influence of MAPK inhibitor ITU (5-iodotubercidin) on ABA accumulation in the seedlings of M. sieversii under water stress and showed that 1 μM ITU significantly decreased the ABA level induced by a water loss. However, the phosphoesterase inhibitor PAO (phenylarisine oxide) enhanced ABA accumulation, indicating that the phosphorylated MAPK was correlated to ABA synthesis. Together, these results suggest that MAPK phosphorylation played an important role in ABA accumulation under water stress, and MAPK might mediate the signal transduction of ABA synthesis.