猪伪狂犬病毒Fa株侵染对PK-15细胞microRNAs表达谱的影响

【目的】分析猪伪狂犬病毒Fa株(PRV-Fa)侵染对猪肾传代细胞PK-15 microRNAs(miRNAs)表达谱的影响。【方法】利用Illumina高通量测序技术,鉴定感染和非感染PRV-Fa的PK-15细胞的miRNAs;筛选并利用实时荧光定量RT-PCR(RT-q PCR)验证差异表达miRNAs;对差异miRNAs进行靶基因预测和Gene ontology(GO)分析。【结果】在感染和未感染PK-15细胞中分别检测到384个和405个miRNAs,其中感染PRV-Fa后差异表达的miRNAs共127个(60个上调,67个下调)。荧光定量结果显示差异miRNAs的表达趋势与高通量测序结果一致。GO分析显示,miRNAs广泛参与信号传导、细胞代谢、免疫反应、基因表达等生物学进程,其中miR-10b、miR-16、miR-18a、miR-19b、miR-20a、miR-145-5p、miR-146a、miR-181a、miR-499-5p等miRNAs与免疫相关。在靶基因调控网络图中,ssc-miR-30a-5p与ssc-miR-30d处于关键位置。研究鉴定出5个新的病毒编码miRNAs,其中PRV-miR-LLT2与PRV-miR-LLT4靶向PRV早期蛋白基因EPO。【结论】伪狂犬病毒Fa株感染对PK-15细胞编码miRNAs有显著影响。     

凡纳滨对虾低温差异表达miRNA的分析鉴定及靶基因的验证

为了解析miRNA及靶基因在凡纳滨对虾低温适应过程中的分子调控机制, 研究开展了凡纳滨对虾常温(28℃)及低温锻炼(16℃, 6d)下肝胰腺小RNA文库的测序和分析。从常温对虾的小RNA文库测序获得18—32 nt的高质量序列10690259条, 鉴定出已知的成熟miRNAs 57条; 而从低温锻炼对虾的小RNA文库获得18—32 nt的高质量序列序列8587144条, 鉴定出已知的成熟miRNAs 48条。分析获得25个在低温锻炼下呈显著差异表达的miRNAs。运用qRT-PCR验证了3条低温下差异极显著的miRNAs的表达模式。结果显示, 3条miRNAs的表达模式与高通量测序结果基本一致。预测低温差异表达miRNAs的靶基因, 并与转录组分析获得的低温显著差异表达基因进行比对, 从二者重合的基因集中挑选出4个基因, 即nuclear export mediator factor Nemf-lik、synapse-associated protein、seleno proteins 以及DEAD-box RNA helicase Variant 1, 运用qRT-PCR验证其在不同条件低温锻炼凡纳滨对虾肝胰腺中的表达规律, 为解析miRNAs及其靶基因在对虾低温适应过程中的分子调控机制提供了基础数据。     

鳜不同孵化时期miRNA转录组分析及生长相关miRNA鉴定

MicroRNA是一类20-24 nt核苷酸长度的参与基因转录后水平调控的非编码小分子RNA。利用高通量测序技术获得鳜(Siniperca chuatsi)孵化后第3天、第17天和第28天全鱼miRNA转录组,共鉴定出1 084个miRNAs,其中432个已知、624个保守、28个新发现。第17天时鉴定出的miRNA个数最多,为926个。在3个发育时期都表达的有628个miRNAs,只在各时期中特异表达的分别有71、104和70个miRNAs。一些与鳜发育相关的miRNAs在上述3个时期呈现持续上调或下调的表达特点。进一步的实验表明,miR-199-5p和miR-203可能与鳜生长发育相关,相应的靶基因分别是WnT和MyoD。     

草鱼CD81基因的克隆及功能分析

为研究白细胞表面分化抗原81(CD81)的功能, 对草鱼CD81进行了克隆, CD81全长共1376 bp, 其中5'非翻译区87 bp, 3'非翻译区581 bp, 开放阅读框为708 bp, 包括8个外显子, 7个内含子, 编码235个氨基酸。实验采用实时荧光定量PCR的方法检测了CD81在健康草鱼不同组织中的表达情况及草鱼出血病病毒(GCRV)攻毒前后的表达变化情况。结果显示草鱼CD81在所有被检测组织中均有表达, 在头肾中表达量最高。在GCRV攻毒前后草鱼鳃、脾、肝、肠及头肾5个组织中的CD81表达量均有明显变化。同时, 采用绿色荧光蛋白(GFP)来示踪CD81的亚细胞表达部位, 激光共聚焦显微镜显示, 同人类一样, 草鱼CD81定位于细胞膜上。       

栖息于青藏高原不同海拔环境的两种草原毛虫miRNA转录组的比较分析

有关动物适应异质性海拔环境的研究,已在表型、解剖学、生理学、基因组学和转录组学等方面广泛开展,但是很少关注小RNA(micro RNAs或miRNAs)的生态适应性功能.草原毛虫是青藏高原高寒草地的重要害虫,并对不同海拔环境产生了良好的适应性.为此,本研究以两种栖息于青藏高原不同海拔环境的黄斑草原毛虫和门源草原毛虫为研究对象,基于Illumina Hi Seq技术对这两种草原毛虫的miRNA转录组进行了高通量测序.结果表明,两种草原毛虫中共鉴定到109个成熟miRNAs,其中47个为保守miRNAs.在所有miRNAs种,共有9个miRNAs的表达水平在两种草原毛虫间存在显著差异性.对这9个差异性表达的miRNAs采用实时荧光定量PCR进行验证,发现8个基因的表达水平与高通量测序结果完全一致.功能分析表明,差异性表达的miRNAs共预测到93个靶基因.这些靶基因主要富集到脂、核酸和维生素等代谢或衰老相关的GO条目,并与代谢、抗寒和低氧等KEGG通路相关(如AMPK信号通路、Wnt信号通路和m TOR信号通路).这些研究表明,miRNAs在草原毛虫对异质性海拔环境的适应性进化过程中具有重要作用.该研究加深了对青藏高原特有昆虫适应高海拔环境的遗传基础的理解.     

禾花鲤与建鲤肌间骨miRNAs测序与分析比较

为了研究禾花鲤(Rice flower carp)肌间骨柔软的分子调控机制,采集禾花鲤和建鲤(Jian carp)的肌间骨进行micro RNAs (miRNAs)的高通量测序,并进行了生物信息学分析。从禾花鲤肌间骨的小RNA文库测序获得18 32 nt的高质量miRNA序列25474895条、鉴定出成熟miRNAs 595种,而从建鲤文库获得miRNA序列24625715条、成熟miRNAs 570种。表达差异分析结果显示,与建鲤相比,禾花鲤肌间骨中84个miRNAs呈上调表达、267个呈下调表达。禾花鲤下调表达的miRNAs中有7条为已报道的促进人类成骨的miRNAs,上调表达的miRNAs中有6条为已报道的抑制人类成骨的miRNAs。因此推测禾花鲤可能是通过下调表达促进成骨的miRNAs及上调表达抑制成骨的miRNAs来抑制成骨过程,从而维持其肌间骨细小及柔软的特性。研究为国内首次开展禾花鲤肌间骨发育的分子调控机制研究,为水产动物肌间骨发育的研究奠定了基础。     

温室白粉虱触角miRNA转录组分析及调控嗅觉相关基因miRNA的鉴定

microRNA(miRNA)是一类真核生物中内源性的非编码小RNA,在基因转录后水平调控靶基因的小分子.温室白粉虱(Trialeurodes vaporariorum)是一种危害多种蔬菜、花卉及农作物等的世界性害虫,可以导致植物细菌性病害的传播和流行,其触角对温室白粉虱的取食、行为和生长发育等起到了重要作用.本研究以温室白粉虱成虫触角为材料,通过Illumina高通量测序平台对其miRNA转录组进行测序,结合生物信息学分析,鉴定到83个已知miRNAs和38个新miRNA(novel_mirs),并对它们表达水平进行定量分析.此外,对已知miRNA种子序列碱基编辑情况进行了调查.最后,利用生物信息学工具对miRNAs进行靶基因预测和功能注释,获得了 miRNA-靶基因关系及调控嗅觉相关基因的miRNAs.本研究为深入探讨温室白粉虱触角miRNA中嗅觉相关基因的调控关系,了解昆虫嗅觉形成的分子机制提供了参考.     

基于转录组的不同火龙果品种抗性差异分析

不同的品种抗性不同,为进一步探究不同火龙果品种之间的抗性差异,为后续火龙果抗性育种提供参考,该研究利用Illumina HiSeq 2000测序平台对'普通白肉'(BR)和'厄瓜多尔黄龙'(EY)两个品种进行转录组测序分析,并参考GO Ontology、KEGG等公共数据库对差异表达基因进行功能分类与富集分析.结果表明...     

基于RNA-Seq筛选APEC及其PhoP/Q缺失株感染雏鸡肠道免疫相关基因

本研究以禽致病性大肠杆菌(APEC)及其PhoP/Q缺失株感染雏鸡小肠为模型,以分析其免疫相关基因的表达变化为目的,采用转录组测序(RNA-Seq)技术对感染APEC及其PhoP/Q缺失株的雏鸡小肠样本RNA进行测序,分析免疫相关基因的表达变化,结果为野生株攻毒组与对照组相比、野生株攻毒组与缺失株攻毒组相比、缺失株攻毒组与对照组相比,分别筛选出131、105、172个差异表达基因(fold change≥2, FDR≤0.05),GO功能分类结果显示分别有87、99、159个基因得到注释,这些基因主要富集到氧化还原过程、脂蛋白转运、血管内皮细胞迁移、免疫反应、凋亡过程负调控、肝素结合、铁离子结合、CCR趋化因子受体结合等功能,得出APEC及其PhoP/Q缺失株感染雏鸡后引起机体肠道免疫相关基因变化的结论,根据GO功能注释筛选出PTPRC、LCP1、YFV等免疫相关基因,为深入研究雏鸡肠道免疫提供依据。     

蒙古沙冬青保守microRNAs的鉴定及靶基因预测

蒙古沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)是生长在荒漠中的木本植物, 对于我国西北部干旱、半干旱区域的植被维护与恢复具有重要价值。蒙古沙冬青对干旱、低温等多种逆境具有较高的耐受性, 是研究林木耐受逆境生理与分子机制的合适材料。MicroRNA(miRNA)是一类长度约为21个核苷酸的内源性非编码小分子RNA, 在植物生长发育和逆境应答等生物学过程中发挥着重要的调控作用。目前, 许多植物物种的miRNAs已经获得鉴定, 但未见蒙古沙冬青miRNAs的相关报道。文章应用高通量测序和生物信息学分析方法对蒙古沙冬青幼苗保守miRNAs的类型、表达丰度以及靶基因进行了分析和预测。共鉴定了10个家族的19种保守miRNAs, 其表达丰度介于55~1920269个拷贝之间。通过在线软件psRNATarget预测了其中14个保守miRNAs的靶基因。对于这些靶基因的功能分析表明, 蒙古沙冬青的保守miRNA主要通过转录调控、激素信号途径、物质代谢和胁迫应答等生物学过程参与植物生长发育和环境响应。     

草鱼感染GCRV后血液中淋巴细胞变化及BCL10表达分析

为了研究草鱼BCL10基因在草鱼出血病中的应答机制, 文章克隆了BCL10基因, 并利用生物信息学、荧光定量和血涂片等技术对其进行了分析。生物信息学结果显示, BCL10基因开放阅读框为738 bp, 编码245个氨基酸。实时荧光定量PCR结果显示, 感染病毒后草鱼体内BCL10表达量持续上调, 在肝胰腺和中肾中第4天达到峰值, 第7天表达量开始下调。血涂片显微镜观察发现了血液中淋巴细胞在感染病毒后第1到第4天下降, 第7天时上升。肾脏的组织病理学观察也发现中肾中肾小管上皮细胞第1到第7天逐渐空泡化, 脱落坏死。以上结果表明, BCL10基因参与了草鱼应对草鱼呼肠孤病毒(GCRV)入侵的免疫应答。     

MicroRNA regulation of molecular networks mapped by global microRNA, mRNA, and protein expression in activated T lymphocytes

MicroRNAs (miRNAs) regulate specific immune mechanisms, but their genome-wide regulation of T lymphocyte activation is largely unknown. We performed a multidimensional functional genomics analysis to integrate genome-wide differential mRNA, miRNA, and protein expression as a function of human T lymphocyte activation and time. We surveyed expression of 420 human miRNAs in parallel with genome-wide mRNA expression. We identified a unique signature of 71 differentially expressed miRNAs, 57 of which were previously not known as regulators of immune activation. The majority of miRNAs are upregulated, mRNA expression of these target genes is downregulated, and this is a function of binding multiple miRNAs (combinatorial targeting). Our data reveal that consideration of this complex signature, rather than single miRNAs, is necessary to construct a full picture of miRNA-mediated regulation. Molecular network mapping of miRNA targets revealed the regulation of activation-induced immune signaling. In contrast, pathways populated by genes that are not miRNA targets are enriched for metabolism and biosynthesis. Finally, we specifically validated miR-155 (known) and miR-221 (novel in T lymphocytes) using locked nucleic acid inhibitors. Inhibition of these two highly upregulated miRNAs in CD4(+) T cells was shown to increase proliferation by removing suppression of four target genes linked to proliferation and survival. Thus, multiple lines of evidence link top functional networks directly to T lymphocyte immunity, underlining the value of mapping global gene, protein, and miRNA expression.     

草鱼Noxa基因克隆及其应答GCRV入侵的表达响应

研究通过获得草鱼Noxa基因(Cinoxa)全长cDNA, 进行序列分析和进化树构建, 使用定量PCR (qPCR)的方法研究其在GCRV刺激下的表达模式。研究发现, 草鱼Noxa基因的蛋白序列与斑马鱼Noxa基因具有高度相似性。通过分析草鱼和斑马鱼的Noxa基因的蛋白三维结构(3D)模型, 研究发现两者具有高度一致的蛋白三维结构模式, 该模型与高等哺乳类中的Bcl-2家族蛋白中C端结构域同源。对Cinoxa在GCRV刺激下的表达模式的研究表明, Cinoxa在GCRV感染后中肾、脾脏和头肾中表达发生显著性变化, 攻毒后24h和120h出现显著上调表达。研究表明草鱼Noxa为斑马鱼Noxa的同源基因, 并且参与了草鱼对GCRV入侵的应答反应, 为深入研究鱼类Noxa应答病毒入侵的功能和转录调控机制奠定了基础。     

三阴性乳腺癌相关miRNA筛选及其靶基因的生物信息学分析

应用生物信息学方法筛选并分析三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer,TNBC）相关miRNA及其靶基因,为TNBC的研究提供潜在的分子靶点。采用GEO2R分析TNBC相关miRNA芯片数据集,筛选差异表达倍数最大的5个上调和5个下调miRNA。miRWalk、TargetScan和miRDB预测靶基因并进行Veen分析取交集。利用DAVID对靶基因进行GO富集分析和KEGG通路分析。利用STRING数据库构建蛋白互作网络,并结合Cytoscape构建miRNA-靶基因调控网络,从而筛选出关键的miRNA及其关键靶基因。利用GEPIA2数据库对靶基因进行生存分析。GEO2R筛选出486个差异miRNA,上调和下调的miRNA分别有298个和188个。对差异倍数最大的5个上调和5个下调miRNA的靶基因进行富集分析显示,靶基因主要参与ErbB信号通路、癌症中转录调控紊乱和cGMP-PKG信号通路等。miRNA-靶基因调控网络显示,表达上调的关键miRNA为miR-611,其关键靶基因为CDC27、UBE2D2、UBR1、SPSB1、HERC2和RLIM;表达下调的关键miRNA为miR-1205,其关键靶基因为WSB1、FBXL8、UBE2W、PTPN11、ARF6、DNAJC6和COPS2。生存分析表明,UBR1（P=0.007 2）和PTPN11（P=0.029）表达上调可显著降低TNBC患者的整体生存率。经筛选获得的关键miRNA及其关键靶基因可作为潜在分子标记物用于TNBC的早期诊断、治疗靶点选择和预后判断,并为后续的研究提供参考依据。     

miR-194a介导饲料维生素D3调节黄颡鱼JAK-STAT免疫通路的研究

为了研究miRNA如何介导饲料维生素D3在黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)JAK-STAT通路中调节免疫应答的机制,选择黄颡鱼幼鱼为主要研究对象,设计了3组维生素D₃浓度分别为1120、3950和16600 IU/kg的饲料,开展了为期12周养殖实验,养殖实验结束后进行鮰爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)攻毒实验。对攻毒后的头肾和脾脏组织进行Illumina高通量测序,筛选差异表达的miRNAs,并对差异表达miRNAs进行靶基因的生物信息学预测和富集分析,发现miR-194a的靶基因富集在JAK-STAT信号通路中;进一步通过双荧光素酶报告基因实验验证了miR-194a对靶基因jak2a和tyk2具有靶向性调控的关系,能够发挥对jak2a和tyk2的抑制作用;通过体外巨噬细胞实验,在细胞中同样检测到miR-194a可以响应培养基中不同浓度的活性维生素D₃,并对靶基因jak2a与tyk2同样发挥抑制作用;通过进一步对靶基因在JAK-STAT通路中的下游基因表达检测,发现随着JAK-STAT信号通路...     

高通量测序技术分析急性髓系白血病血浆外泌体微RNA表达谱差异

急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）是一类造血干细胞的恶性克隆性疾病,目前的诊断方法不利于疾病的早期发现,且诊断结果重复性较差。已有大量研究显示,细胞外microRNA（miRNA或miR）富集在外泌体（exosome）中,且受其表面膜的保护而具有很好的稳定性,是理想的分子标志物。目前,多种实体肿瘤均已检测到肿瘤特异性外泌体miRNA(exosomal miRNA)。然而,在AML患者中未见此外泌体miRNA报道。本研究探讨急性髓系白血病血浆外泌体miRNA表达谱差异及新miRNA序列。采用solexa高通量测序技术对7例AML患者（AML组）及7例健康对照者（对照组）血浆外泌体miRNAs进行测序,利用Mireap预测软件进行新miRNAs分析,通过edger差异分析软件筛选组间差异miRNA,获得211个已知的差异表达miRNAs以及2个新miRNAs,选择4个差异表达的miRNAs：miR-155-5p、miR-335-5p、miR-451a及xxx-m0038 5p（新miRNA）,在两组（各23例）的血浆外泌体样本中,进行实时荧光定量PCR（qRT-PCR）验证,验证结果与测序结果一致。对差异表达的外泌体miRNA进行靶基因预测及其GO（Gene Ontology）和信号通路富集分析,发现靶基因聚集的生物学功能多数参与生物进展过程的调控。靶基因主要富集在FoxO、MAPK、Hippo信号通路以及HTLV-I感染等。结果显示,AML患者与健康对照者的血浆外泌体miRNA存在着差异性表达。差异性表达的miRNA特异性很高,对进一步阐明AML白血病发生与发展的分子机制、研发新的无创诊断方法、新的诊断标记物和有效治疗AML的方法具有十分重要和深远的意义。