少突胶质前体细胞的培养及细胞缺氧缺糖模型的建立

目的 获取高纯度的大鼠少突胶质前体细胞系并建立细胞缺氧缺糖模型。方法 采用振荡分离纯化法和化学限定无血清培养基在体外获取纯化的大鼠少突胶质前体细胞,免疫荧光法对各分化阶段特异的表面抗原A2B5、O4、O1进行细胞鉴定。利用无糖培养基和连二亚硫酸钠造成O4阳性的少突胶质前体细胞的缺氧缺糖损伤,观察细胞的形态学改变,MTT法测细胞存活率。结果 获得纯度95%以上的大鼠少突胶质前体细胞,O4阳性少突胶质前体细胞出现缺氧缺糖损伤的形态学改变,并随缺氧缺糖时间延长而加剧;细胞存活率随缺氧缺糖时间的延长逐渐下降,30、60min和90min细胞存活率均低于正常对照组,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论 振荡分离纯化法是体外培养大鼠少突胶质前体细胞的可靠方法,利用无糖培养基和连二亚硫酸钠可以建立细胞缺氧缺糖模型。     

SD大鼠少突胶质前体细胞系的分离、培养及鉴定

目的获取高纯度的少突胶质前体细胞系,并作鉴定。方法根据星形胶质细胞和少突胶质前体细胞系生长时间的差异,细胞黏附特性的不同,利用振荡分离纯化法获得纯化的SD大鼠少突胶质前体细胞,再用添加了神经营养因子(N2)、血小板衍生生长因子(PDGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的无血清培养基传代培养。免疫荧光法对表面抗原进行细胞鉴定。结果获得纯度95%以上少突胶质前体细胞,少突胶质祖细胞A2B5、O4抗体阳性;未成熟少突胶质细胞O4、O1阳性;胶质细丝酸性蛋白(GFAP)均为阴性。结论通过振荡分离纯化法及结合少突胶质细胞定向培养基是培养少突胶质前体细胞的可靠方法;N2、PDGF、bFGF的添加可显著提高细胞产量,并使细胞保持在未成熟阶段。     

Nogo-A在体外培养的少突胶质前体细胞的表达

目的观察Nogo-A在少突胶质前体细胞的表达和细胞定位。方法采用改良振荡分离纯化法及化学限定培养基体外培养少突胶质前体细胞,并用其特异性抗体A2B5、O4、O1用免疫荧光法作细胞鉴定。然后在相应的少突胶质细胞分化阶段用免疫荧光法观察Nogo-A的表达。结果Nogo-A在细胞分离纯化培养后的1、2、4d均有阳性表达,阳性信号位于胞体及突起。结论在少突胶质祖细胞及未成熟少突胶质细胞表面及突起上均表达Nogo-A,为早产儿脑白质损伤及神经系统后遗症的发生机制中的作用提供了实验室基础。     

Nogo-A在体外培养的少突胶质前体细胞的表达

目的 观察Nogo-A在少突胶质前体细胞的表达和细胞定位。方法 采用改良振荡分离纯化法及化学限定培养基体外培养少突胶质前体细胞，并用其特异性抗体A285、04、01用免疫荧光法作细胞鉴定。然后在相应的少突胶质细胞分化阶段用免疫荧光法观察Nogo-A的表达。结果 Nogo-A在细胞分离纯化培养后的1、2、4d均有阳性表达，阳性信号位于胞体及突起。结论 在少突胶质祖细胞及未成熟少突胶质细胞表面及突起上均表达Nogo-A，为早产儿脑白质损伤及神经系统后遗症的发生机制中的作用提供了实验室基础。     

NgR在新生大鼠少突胶质前体细胞系的表达和缺氧缺血后变化的意义

目的：观察NgR在新生大鼠少突胶质前体细胞系（OLPs）的表达和细胞定位，以及缺氧缺血（OGD）损伤后的表达变化，探讨其在OLPs损伤后再生抑制中的作用。方法：采用改良振荡分离纯化法体外培养OLPs，采用其特异性抗体A2B5、O4和O1作细胞鉴定；用NgR抗体检测其在OLPs表达。用含连二亚硫酸钠的无糖培养基制作OLPs OGD模型，MTT法检测各组细胞存活率；用免疫荧光法和免疫印迹法观察NgR在细胞OGD后的变化。结果：OLPs在分离纯化培养后的第1，2和4天均表达NgR，阳性表达位于胞体及突起；细胞OGD后10 min，NgR表达出现增强，30 min后明显升高，与对照组比较差异具有显著性（均P﹤0.05）；MTT结果显示，OGD 30 min，细胞存活率较对照组显著降低（P﹤0.05）。结论：OLPs胞体及突起上均表达NgR；OGD后NgR表达明显增强，细胞存活率显著降低，提示NgR可能参与OGD后OLPs的再生抑制过程。［中国当代儿科杂志，2007，9（5）：445-448］     

脑缺氧缺血时少突胶质细胞损伤的机制

缺氧缺血是造成新生儿脑白质损害的常见原因 ,与脑瘫、智力低下等神经功能障碍密切相关。少突胶质细胞是脑白质的重要成分 ,故研究少突胶质细胞对缺氧缺血性损伤机制及其防治对策具有重要的临床意义。　　一、少突胶质细胞少突胶质细胞是中枢神经系统髓鞘形成细胞 ,它包绕神经纤维轴突而形成髓鞘 ,对轴突正常快速电传导等功能起重要作用。少突胶质细胞的前体细胞主要来源于前脑脑室下区 (SVZ) [1] 。依据抗原表达、形态和功能 ,少突胶质细胞系可分为先祖细胞、早期少突胶质祖细胞、晚期少突胶质祖细胞、未成熟少突胶质细胞、成熟少突胶质…     

原代大鼠星形胶质细胞对氧糖剥夺的增殖性应答反应

目的 建立良好的模拟缺氧缺血性脑损伤后星形胶质细胞增殖的体外模型的方法.方法 采用CCK-8(Cell Counting Kit-8)法测定星形胶质细胞活力,5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷(EdU)掺入法检测星形胶质细胞DNA合成,免疫组织化学染色法检测星形胶质细胞增殖细胞核抗原(PCNA)表达.比较原代大鼠星形胶质细胞在氧糖剥夺(OGD),10 mL·L-1氧气、无糖含血清培养基)培养不同时间(0h、3h、6h、9h)的增殖情况.结果 CCK-8检测结果显示随OGD培养时间延长,原代大鼠星形胶质细胞活力逐渐增强,6h达高峰,与相应时间点正常培养组比较差异有统计学意义;随后减弱,9h已接近正常培养组水平.OGD培养后,原代大鼠星形胶质细胞EdU和PCNA阳性细胞率逐渐增加,6h达最高水平,与相应时间点的正常培养组比较差异有统计学意义;而后下降,至9h与正常培养组比较差异无统计学意义.结论 OGD培养6h可成功模拟体内缺氧缺血后星形胶质细胞增殖改变,为进行缺氧缺血性脑损伤后星形胶质细胞过度增殖的相关研究提供了稳定可靠的体外实验模型和理论依据.     

3日龄未成熟大鼠缺血性脑损伤后少突胶质细胞超微结构变化

目的：少突胶质细胞是脑白质的主要细胞成分,了解少突胶质细胞损伤的病理过程有助于研究早产儿脑损伤的发生机制。该实验目的在于了解3日龄未成熟大鼠双侧颈总动脉结扎造成脑白质损伤后少突胶质细胞超微结构的变化。方法：将3日龄未成熟SD新生大鼠随机分为对照组和实验组。对照组仅切开颈部皮肤,而实验组结扎双侧颈总动脉。术后6,12,24 h分别取实验组和对照组存活大鼠8只,将脑组织的超微切片进行透射电镜检查。结果：对照组存活率为100％,实验组存活率为51%。透射扫描电镜发现实验组大鼠术后6 h脑白质少突胶质细胞普遍水肿,细胞器 (线粒体、内质网、高尔基体)水肿明显,数量减少,线粒体数目减少及水肿尤为多见,有的线粒体出现空泡现象,粗面内质网脱颗粒。术后12 h少突胶质细胞水肿更加明显,细胞器进一步减少,可见细胞核染色质分布不均,少数细胞已经出现核固缩。术后24 h实验组少突胶质细胞广泛核固缩、核溶解, 细胞器广泛缺失。结论：3日龄未成熟大鼠双侧颈总动脉结扎后,大鼠脑白质少突胶质细胞损伤。损伤数小时内少突胶质细胞的细胞器受损,随时间延长进行性加重,直至出现少突胶质细胞核固缩。该研究显示了脑缺血性损伤时,脑白质内少突胶质细胞的超微结构病理变化的全过程。［中国当代儿科杂志,2007,9（3）：225-228］     

适于人源少突胶质前体细胞长期体外扩增的较经济的培养方法

目的 细胞替代治疗是髓鞘化障碍疾病的可能有效的治疗方法.而细胞替代治疗必须具有相应的体外培养少突胶质前体细胞的方法.因此,本研究为了提供临床治疗所需的细胞,发展出了一种简单、经济且高效的获得人源少突胶质前体细胞(OPCs)的方法,为临床治疗提供了新的方法.方法 通过磁珠分选的方法得到人源OPCs,将其接种到OPCs增殖培养基中,观察短期(2、4、6、8d)和长期体外培养中OPCs的形态,免疫荧光染色鉴定第4代细胞OPCs特异标志O4、转录因子Sox10和血小板源性生长因子α受体(PDGFαR)的表达情况及诱导后分化为少突细胞的能力,同时观察B27和N1对OPCs生长状态的影响.结果 短期培养时,OPCs具有典型的双极或是三极形态且增殖状况良好.经过4代的长期培养,4代细胞均具有典型双极或三极形态;第4代OPCs免疫荧光染色鉴定90％以上细胞表达OPCs特异标志O4、Sox10和PDGFαR,诱导后,可以分化为少突胶质细胞.可见经过4代的长期培养,OPCs仍保持着初始性状且具有分化为少突细胞的能力并且仍然保持着较高纯度,表明该培养基适合人源OPCs长期培养.结论 使用该培养方法,分离得到的人源OPCs在体外不仅能够稳定培养和扩增,还具有分化为少突细胞的能力.通过这种可重复的方法,可以在体外尽可能简单的稳定获得大量高纯度人源OPCs,为临床应用提供了新的选择.且该方法使用较少的细胞因子,因此为髓鞘化障碍或髓鞘损伤疾病将来的细胞治疗,提供了一种适用于临床的OPCs的稳定高效的较经济的培养方法.     

缺氧缺血对人类胚胎脑室管膜下区神经细胞亚群的影响

目的 研究缺氧缺血对妊娠中期人类胚胎脑室管膜下区(subventricular zone,SVZ)神经细胞亚群的影响.方法 取即刻解离的妊娠中期人类胚胎脑SVZ细胞,分缺氧缺血组(HI组)和对照组短时培养.以氧糖缺失法(OGD)制备缺氧缺血损伤细胞模型.培养前以细胞成活率评价损伤程度,培养后以细胞特异性标志蛋白nestin、MAP2、GFAP、PDGFRa及RCA120的抗体通过免疫荧光细胞化学法分别鉴定神经干细胞(NSCs)、神经元、星形胶质细胞、少突胶质祖细胞及小胶质细胞,比较其百分含量.结果 HI组的细胞成活率(63.41%±0.06%),明显低于正常组(98.9%±0.01%)(P＜0.001),短时培养后HI组中细胞亚群中含量最高的是GFAP(+)的星形胶质细胞56.48%±0.03%,其次为神经干细胞NSCs 22.47%±0.03%而PDGFRa(+)的少突胶质祖细胞含量最低;在对照组中最高则为MAP2(+)的神经元48.81%±0.03%,其次为GFAP(+)的星形胶质细胞32.31%±0.03%.含量最少的为小胶质细胞1.15%±0.01%.结论 妊娠中期人类胚胎脑SVZ含有NSCs、神经元、星形胶质细胞、少突胶质祖细胞和小胶质细胞,缺氧缺血对SVZ神经细胞损伤明显,不同细胞对缺氧缺血损伤的耐受性不同:NSCs、星形胶质细胞对缺氧缺血损伤的耐受性相对强于神经元、少突胶质祖细胞.     

Pim1在体外培养大脑皮层神经元氧糖剥夺/复氧损伤中的表达及作用

目的 探讨原代培养大脑皮层神经元缺氧缺血损伤后Pim1的表达及其对细胞凋亡的作用。方法 取新生1日龄C57BL/6小鼠的大脑皮层神经元进行原代培养，培养第8天更换无糖无血清DMEM培养基，于1% O₂条件下培养3 h后，换为正常条件下培养，即氧糖剥夺/复氧（OGD/R）处理，以模拟体内神经元缺氧缺血状态。分别于OGD/R后0、6、12、24 h收集细胞，同时设立神经元正常培养组。原代培养神经元中分别转染Pim1过表达质粒或空质粒，然后分别进行正常培养或OGD/R处理，分别命名为Pim1组、对照组、OGD/R组和OGD/R+Pim1组；采用Real-time PCR检测Pim1 mRNA的表达，采用Western blot检测Pim1蛋白和凋亡相关蛋白活化的半胱氨酸蛋白酶（CC3）的表达。采用TUNEL法检测细胞凋亡。结果 Real-time PCR和Western blot结果显示，与正常组相比，OGD/R后神经元中Pim1 mRNA及其蛋白表达均显著降低，且均从OGD/R后0 h开始下降，12 h最低，24 h回升但仍维持在较低水平（P < 0.05）。Pim1过表达转染使神经元中Pim1蛋白水平增加。Pim1+OGD/R组CC3表达水平明显低于OGD/R组，Pim1+OGD/R组细胞凋亡率也较OGD/R组显著减少（P < 0.01）。结论 缺氧缺血损伤引起体外培养神经元中Pim1表达下降。过表达的Pim1可以抑制OGD/R诱导的神经元凋亡。     

长链非编码RNA BC088414在神经细胞缺氧缺血损伤中的作用

目的探讨长链非编码RNA BC088414在神经细胞缺氧缺血损伤中的作用。方法将大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(PC12)细胞分为常氧组、氧糖剥夺处理组(OGD组)、小分子RNA常氧组(siRNA组)及siRNA OGD组, n=3。以无葡萄糖无血清DMEM培养液于37℃、1%O2+99% N2/CO2条件下培养细胞6 h,建立缺氧缺血体外模型。采用实时定量PCR法检测BC088414、肾上腺素受体β2(Adrb2)和半胱氨酸蛋白酶6(Casp6) mRNA的表达;利用小分子干扰RNA(siRNA)抑制PC12细胞中BC088414的表达;采用TUNEL法检测细胞凋亡情况。结果 OGD组细胞凋亡指数明显高于常氧组(PPPP结论长链非编码RNABC088414可能通过Adrb2和Casp6促进凋亡,加重缺氧缺血引起的神经细胞损伤。     

缺氧缺血新生大鼠神经元自噬基因表达节律及调控机制

目的通过新生大鼠缺氧缺血脑损伤后神经元自噬基因和节律基因的表达,探讨缺氧缺血引起神经损伤的新机制。方法将12只Sprague-Dawley大鼠随机分为缺氧缺血组和假手术组,每组6只。采用结扎并切断大鼠右侧颈总动脉并给予低氧处理的方法建立体内缺氧缺血脑损伤模型。Western blot检测两组大鼠大脑皮层和海马组织节律蛋白Clock表达情况。体外培养大鼠神经元细胞,随机分为氧糖剥夺(OGD)组和对照组,OGD组加入无糖无血清DMEM培养基模拟细胞缺血状态,并给予低氧处理建立体外缺氧缺血脑损伤模型。采用Western blot检测两组不同时间点自噬相关蛋白Beclin1和LC3,以及节律基因Clock蛋白表达情况。应用si RNA技术抑制神经元Clock蛋白表达后,检测Beclin1和LC3的表达变化。结果体外培养神经元Beclin1和LC3Ⅱ的表达呈现节律性波动;OGD处理后,体外培养神经元Beclin1和LC3Ⅱ的表达随着时间的延长逐渐升高,不再呈现节律性波动;与假手术组相比,缺氧缺血引起大鼠皮层和海马组织Clock表达降低(P0.05);体外培养神经元经OGD处理后,Clock表达也较对照组显著降低(P0.05);与阴性对照组相比,抑制神经元节律基因Clock表达后,自噬相关蛋白Beclin1和LC3Ⅱ的表达均显著下降(P0.05)。结论缺氧缺血引起神经元Beclin1和LC3Ⅱ表达节律紊乱,其机制可能与Clock参与调控Beclin1和LC3Ⅱ的表达有关。     

卡维地洛对体外柯萨奇病毒B3致心肌细胞凋亡与Bcl-2/Bax蛋白表达的影响

目的探讨卡维地洛对体外柯萨奇病毒B3(CVB3)致心肌细胞凋亡的抑制作用及其机制。方法采用差速贴壁法培养原代Wistar乳鼠心肌细胞。实验分为正常对照组、病毒组、卡维地洛组及美托洛尔组。正常对照组仅加入不含血清的DMEM培养液,后3组于CVB3感染心肌细胞后分别加入不含血清的DMEM培养液、无血清培养基配制的卡维地洛、美托洛尔溶液。72h后在倒置相差显微镜下观察各组心肌细胞的形态、搏动速率;采用黄嘌呤氧化酶法测定其心肌细胞培养液中超氧化物歧化酶(SOD)活性,硫代巴比妥酸法测定其心肌细胞培养液中丙二醛(MDA)水平,流式细胞术检测其心肌细胞凋亡率,免疫细胞化学法检测其心肌细胞内Bcl-2及Bax蛋白表达水平。结果1.与病毒组比较,卡维地洛组心肌细胞搏动速率明显提高(P<0.05)、凋亡率明显降低(P<0.05),心肌细胞培养液中SOD活性显著升高(P<0.05)、MDA水平明显降低(P<0.05);美托洛尔组与病毒组比较,心肌细胞搏动速率、凋亡率、心肌细胞培养液中SOD活性、MDA水平均无统计学差异(Pa>0.05);2.与病毒组及美托洛尔组比较,卡维地洛组心肌细胞内Bcl-2蛋白表达增多,而Bax蛋白表达减...     

Development of neonatal murine microglia in vitro: changes in response to lipopolysaccharide and ischemia-like injury

Hypoxic/ischemic brain injury in the neonate can activate an inflammatory cascade, which potentiates cellular injury. The role of microglia in this inflammatory response has not been studied extensively. We used an in vitro model of murine microglia to investigate changes in microglial cytokine release and injury during early development. Isolated microglia were subjected to lipopolysaccharide (LPS) activation or injury by glucose deprivation (GD), serum deprivation (SD), or combined oxygen-glucose deprivation (OGD) for varying durations. The extent and the type of cell death were determined by trypan blue, terminal deoxynucleotidyl end-nick labeling, and annexin staining. Early-culture microglia (2-3 d in purified culture) showed significantly more apoptotic cell death after SD, GD, and OGD compared with microglia maintained in culture for 14-17 d. Measurements of tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) and IL-1beta in culture media demonstrated that OGD induced greater release of both TNF-alpha and IL-1beta than LPS activation, with early-culture microglia producing more TNF-alpha compared with late-culture microglia. Microglia that are cultured for a short time are more sensitive to ischemia-like injury in vitro than those that are cultured for longer durations and may contribute to worsening brain injury by increased release of inflammatory cytokines. Inhibition of microglial activation and decreasing proinflammatory cytokine release may be targets for reduction of neonatal hypoxic/ischemic brain injury.