表达千穗谷Ah—AMP基因的转基因烟草抗病性研突

通过PCR从苋属植物千穗谷(Amarathus hypochondriacus)的总DNA中扩增出苋菜抗菌肽(Ah—AMP)的核基因片段，序列分析结果表明该基因长261bp，编码一个由86个氨基酸组成的Ah—AMP前体多肽。在构建Ah—AMP基因的植物表达载体pBinAH916后，通过根癌土壤杆菌介导方法转化了烟草。转化再生植株和T1代转基因烟草的PCR和Southern blot分析表明，AA—AMP基因已整合到烟草的染色体中，并为单拷贝整合。T1代转基因烟草的Nouthern blot分析结果表明，AA—AMP基因在转基因烟草中至少在mRNA水平上能正常表达。对T0代转基因烟草进行烟草青枯病的抗病性试验，筛选出两株抗性较强的植株。对T1代抗青枯病的统计分析发现，其抗病性比起始品种SRl分别提高了2．24和1．62个级别；其病情指数比起始品种降低49．6％和37．3％。对黑烃病也表现一定的抗性，主要表现在推迟发病时间，减缓发病速度上。这些结果表明AA—AMP基因在植物抗病基因工程研究中可能是一个有潜在应用价值的基因。     

H5N1型禽流感病毒HA基因在烟草中的表达

禽流感病毒H5N1是可以直接感染人类的甲型流感病毒,发展植物源口服疫苗是疫苗研究的方向之一.本研究通过农杆菌介导的方法将禽流感病毒H5N1的HA基因转化烟草.共获得38株潮霉素抗性植株,经PCR和Southern-blotting检测,目的基因已整合到转基因植株的基因组中.Western-dotting检测结果表明,目的基因在转基因烟草中得到表达,具有免疫原性,获得了能够表达HA基因的植物口服疫苗候选植株.     

H5N1型禽流感病毒HA基因在烟草中的表达

禽流感病毒H5N1是可以直接感染人类的甲型流感病毒，发展植物源口服疫苗是疫苗研究的方向之一．本研究通过农杆菌介导的方法将禽流感病毒H5N1的HA基因转化烟草．共获得38株潮霉素抗性植株，经PCR和Southern-blotting检测，目的基因已整合到转基因植株的基因组中．Western-dotting检测结果表明，目的基因在转基因烟草中得到表达，具有免疫原性，获得了能够表达HA基因的植物口服疫苗候选植株．     

苜蓿花叶病毒RNA_23′端cDNA转基因烟草及其抗病性研究

将本室克隆的编码复制酶基因3′端约1/2序列及其3′端非编码区的苜蓿花叶病毒中国分离株(AlMV-Ch)RNA23′端cDNA,重组到植物表达载体pROKII中,通过致瘤农杆菌(A-grobacteriumtumefaciens)介导,以叶圆片为转化材料,转化普通烟草,并获得了转基因植株.经卡那霉素抗性选择、PCR检测目的基因证明AlMVRNA23′端基因已整合到转基因烟草的基因组DNA中.转基因植物的攻毒试验表明转基因植株对苜蓿花叶病毒产生高水平的抗性.     

花粉管通道法转基因技术在甜瓜品种河套蜜瓜上的应用

为建立甜瓜(Cucumis melo L.)简便易行转化频率高的转基因技术,以甜瓜品种河套蜜瓜为受体材料,以含gus基因的植物双元表达载体pPZP221为外源基因供体,进行了花粉管通道法转基因研究.自交授粉后分别于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 h,切去柱头上端1/3部分,立即滴加质粒DNA溶液,果实成熟后收获转化种子.对T0代植株进行PCR检测,结果表明不同时间处理所得到的T0代植株均具有较高的转化频率,其中授粉后7 h滴加DNA溶液所获得的转化率为28.3%.对一部分PCR阳性的T0代植株基因组DNA进行Southern杂交分析,结果表明所有样品均出现特异性杂交条带,证明外源基因已整合到受体植物基因组中.     

抗人端粒酶逆转录酶单链抗体基因在烟草中的表达

构建了含抗人端粒酶逆转录酶单链抗体基因ScFv-hTERT的植物表达载体p1304-SH,通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草.转基因烟草植株叶片总DNA的PCR,Southern b lot检测结果表明,ScFv-hTERT基因已整合进了转基因烟草植株基因组中;RT-PCR,SDS-PAGE分析证实目的基因已在烟草叶片中成功表达,竞争性ELISA的结果表明,表达的重组抗体与其抗原有良好的结合活性.     

丙型肝炎病毒E2基因在转基因番茄植株中的表达

以T-E1E2为模板扩增得到丙型肝炎病毒包膜蛋白基因E2,构建该基因的植物表达载体p35s-E2．通过农杆菌介导的叶盘法转化番茄子叶．转基因番茄植株叶片总DNA的PCR、Southern blot检测结果表明,E2基因已整合进了转基因番茄植株基因组中;RT-PCR,Western blot分析证实E2基因在转基因番茄植株叶片中表达．     

利用植物生物反应器表达胸腺素α1的研究

胸腺素α1是胸腺肽中活性最高的组分,可以提高人体免疫力,通过组织提取或人工合成存在安全隐患和价格昂贵等问题.拟用植物生物反应器,转基因模式植物烟草表达胸腺素仅α1.通过已构建的植物双元载体p35S-2300-twin T-DNAs::Ta4::noster用农杆菌介导法转化烟草,在卡那霉素筛选压为50 mg/L时获得抗性烟草165株,经PCB和Southern blot分析证实,获得了17株独立转基因苗,阳性率10.30%,外源基因拷贝数为1-7个.还对利用含"twin T-DNA"植物双元表达载体转化烟草T0代的Tα4和nptII分别整合现象以及植物生物反应器生产胸腺素的前景进行了讨论.     

苜蓿花叶病毒RNA2 3''''端cDNA转基因烟草及其抗病性研究

将本室克隆的编码复制酶基因3′端约1／2序列及其3′端非编码区的苜蓿花叶病毒中国分离株(AIMV-Ch)RNA：3′端cDNA，重组到植物表达载体pROKⅡ中，通过致瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导，以叶圆片为转化材料，转化普通烟草，并获得了转基因植株．经卡那霉素抗性选择、PCR检测目的基因证明．AIMV RNA：3′端基因已整合到转基因烟草的基因组DNA中．转基因植物的攻毒试验表明转基因植株对苜蓿花叶病毒产生高水平的抗性．     

根癌农杆菌介导的绿色荧光蛋白基因在水稻植株中的表达

将改良的绿色荧光蛋白（EGFP）基因插入到植物表达载体中,构建了ubi启动子驱动下的植物表达载体p13UEGFP．通过根癌农杆菌介导转化水稻的胚性愈伤组织,经潮霉素筛选,获得抗性愈伤组织和再生植株．对T2代植株进行PCR分析、激光共聚焦显微镜检测和RT—PCR分析,结果表明,绿色荧光蛋白基因已经在转基因植株中稳定表达．     

冷诱导基因的转录因子CBF1转化油菜和烟草及抗寒性鉴定

为研究冷诱导基因的转录因子CBF1(C-repeat binding factor)基因对植物抗寒的作用,利用PCR技术从拟南芥菜(Arabidopsis thaliana)中扩增并克隆了该转录因子,并将其与CaMV 35S启动子融合构建成植物表达载体pBPCBF1.以农杆菌介导的叶盘法,分别转化了油菜和烟草.经PCR程序的DNA分析和Southern杂交对具有卡那霉素抗性的再生植株进行了鉴定,表明CBF1基因已整合进烟草和油菜基因组中.以电解质渗漏法分别检测了转化的油菜和烟草的抗寒性,结果显示转基因油菜的抗寒性较未转基因油菜有明显提高,转基因烟草抗寒性也有一定的提高.因此利用对转录因子的调控来提高植物的抗寒性可能有很好的应用前景.     

海岛棉GbRar1和GbSgt1基因的过量表达提高烟草离体叶片对赤星病的抗性

RAR1 和 SGT1 是两个植物抗病蛋白 (R) 防卫反应的信号元件,在 R 蛋白下游和活性氧产生之间发挥作用. 利用简并引物 PCR 及3′RACE 等技术,克隆了海岛棉 GbRAR1 和 GbSGT1的编码基因. Northern blot 表明,海岛棉GbRar1和GbSgt1基因在转录水平上受棉花黄萎病菌的诱导,诱导后 mRNA 表达量显著增加. 构建组成型植物表达载体 pRar 和 pSgt,分别转化烟草品种 NC89. 离体叶片抗病性鉴定表明,两类转基因烟草对赤星病的抗性明显提高,为植物防卫反应信号元件RAR1 和 SGT1在广谱抗病基因工程中的应用提供了实验证据.     

基于Gene-Deletor系统的安全复合性状转基因烟草研究

本研究利用农杆菌介导法将带有水稻花粉特异启动子籼稻花粉过敏原基因(OSIPA)启动子驱动的Gene-Deletor外源基因清除系统,水稻Os GA3ox2(D18)启动子驱动水稻Os GA2ox1基因,玉米Ubiquitin启动子驱动BAR::GUS融合基因为筛选标记基因以及水稻Actin1启动子驱动驱动抗虫Cry1Ab基因复合性状植物表达载体p GM626-D18-Os GA2ox1遗传转化三星烟草。通过GUS组织化学染色及PCR分子鉴定,获得了43株转基因烟草植株。结果表明,水稻OsGA2ox1基因在烟草中表达能降低转基因烟草植株高度,但不影响植株生殖生长。转基因烟草对烟草斜纹夜蛾幼虫具有抗性,可抑制烟草斜纹夜蛾幼虫的取食与发育。以50 mg/L的除草剂Basta处理野生型和转基因烟草离体叶片,发现BAR基因提高了烟草抗除草剂的能力。对12株转基因烟草T0代花粉外源基因清除效率进行研究,发现部分烟草株系外源基因清除可达到100%,其他未完全清除外源基因株系的清除效率介于42.84%~99.97%之间。     

TaNHX2基因植物表达载体的构建及在烟草中的表达

将TaNHX2基因重组于质粒pBIN438的CaMV 35S启动子下游,构建含TaNHX2基因的植物双元表达载体pBIN438-TaNHX2.采用农杆菌介导转化烟草(Nicotiana tobacum L.),获得含TaNHX2的转基因烟草植株.经PCR、RT-PCR分析表明,TaNHX2基因已整合到烟草中,并且得到表达.耐盐分析表明,外源基因TaNHX2提高了转基因植株的耐盐性.     

苜蓿花叶病毒RNA_23′端cDNA转基因烟草的研究

将克隆的苜蓿花叶病毒中国分离株(AlMV-Ch)RNA23′端cDNA重组到植物表达载体pROKII中,用三亲融合法导入农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)LBA4404,采用叶圆片法转化普通烟草,诱导再生小植株.经卡那霉素抗性筛选和PCR检测,证明AlMVRNA23′端基因已整合到转基因烟草的基因组DNA中.     

稻瘟病抗性基因 Pi63 启动子4 个构建体的表达及抗性分析

利用农杆菌介导法获得带有不同长度启动子区域的稻瘟病抗性基因Pi63全长基因的转基因水稻,并采用实时荧光定量PCR方法鉴定了T1代阳性植株的基因拷贝数,进一步测定了单拷贝转基因植株在接种稻瘟病菌前后Pi63基因的表达量变化.结果表明:接种后4个分别带有不同长度启动子的Pi63转基因植物T1代中Pi63基因的表达量均升高,其抗病相关的顺式作用元件处于P1与P2中间的区域,P0到P1的区域存在负调控元件.此结果可为进一步揭示水稻稻瘟病抗性基因Pi63的分子机理奠定基础.     

利用人内皮抑素基因构建植物表达载体及对烟草的遗传转化

将人内皮抑素(endostatin)基因重组于植物双元表达载体pGA 643,得到重组质粒pGE.用三亲融合法将其导入农杆菌LBA 4404中,采用叶盘法转化烟草,经诱导与筛选,获得了卡那霉素抗性植株.提取抗性植株总DNA,通过PCR扩增和Sou thern杂交检测,筛选出了整合有外源基因的转化植株.为进一步研究人内皮抑素在烟草中的表达及生物学功能奠定了基础.     

油菜耐热基因（BnTR1）转化多年生黑麦草丛生芽的研究

油菜耐热基因(BnTR1)克隆自油菜,编码一种E3连接酶.为验证它的抗逆功能,本研究用携带BnTR1和新霉素磷酸转移酶(neomycin phosphotransferase,nptⅡ)基因的植物表达载体pCAMBIA2301-TR1的根癌农杆菌EHA105,对多年生黑麦草丛生芽进行遗传转化.经共培养和巴龙霉素筛选培养,获得了175株抗性植株.通过PCR和RT-PCR检测,获得62株转基因植株.结果表明,外源BnTR1基因已整合到转基因植株基因组中并在转录水平上表达.初步抗旱检测表明,BnTR1基因能明显提高转基因植株的抗逆能力.     

转APX基因烟草抗旱能力研究

用毛白杨中克隆得到的抗坏血酸过氧化物酶(APX)基因,构建植物表达载体pBI121-APX,将pBI121-APX载体用农杆菌介导法转化烟草,成功得到转基因烟.PCR、PCR-Southern的结果表明,APX基因已经成功的整合到转基因烟草基因组中.干旱实验结果表明,与对照相比较,转基因烟草表现出较强的抗旱性.     

水稻Rho家族OsRac2启动子的转基因功能鉴定

采用PCR扩增的方法,构建了OsRac2基因转录起始位点上游1.7 kb的启动子5′缺失植物表达载体,转化烟草并筛选阳性转基因植株.以多种激素处理转基因烟草,通过组织化学分析和GUS荧光活性的检测,证实Os-Rac2启动子上存在着一些激素应答元件,该基因的表达可能受茉莉酸的正调控,脱落酸等激素的负调控.