单纯疱疹病毒1型感染对原代培养鼠皮质神经元凋亡caspase-3途径的影响

目的了解caspases-3在单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus type 1,HSV-1)感染原代培养鼠皮质神经元中对线粒体的调控作用以及与神经元凋亡的关系.方法用酶标仪检测体外培养小鼠皮质细胞正常组、病毒组、山梨醇组、山梨醇加病毒组、对照组在不同条件下caspase-3发光底物吸收值,测定caspase-3底物的含量.用流式细胞术结合TUNEL方法检测各组细胞凋亡情况及线粒体膜电位变化.结果加入底物后14 h测定A值:正常组为0.394 2、病毒1组为0.240 8、山梨醇组为0.539 2、病毒加山梨醇组为0.465 0,正常组caspase-3含量较阴性对照组增加,病毒组较正常组明显减低,山梨醇组较正常组明显增加,病毒加山梨醇组较山梨醇组减低.山梨醇及神经酰胺组细胞线粒体膜电位明显降低,而病毒组及病毒加山梨醇或神经酰胺组均无明显降低.结论正常体外培养的神经元存在细胞凋亡,病毒能够阻止线粒体膜电位的超极化,山梨醇诱导的神经细胞凋亡是依赖于caspase-3的细胞凋亡,HSV-1阻止依赖于caspase-3的细胞凋亡途径.     

体外培养小鼠皮质神经元感染HSV-1后的细胞凋亡

目的 :探讨HSV 1对原代培养神经元细胞凋亡的影响。方法 :用TUNEL方法结合流式细胞术、DNA电泳、免疫荧光技术 ,检测原代培养第 3天和第 7天小鼠皮质神经元感染HSV 110h后凋亡细胞变化情况。结果 :病毒组DNA梯型条带被阻止。第 3天各组凋亡细胞百分数为 :N ,14 0 5 % :V1,8 18% ;V2 ,4 97% ;NS ,2 2 13 % ;V1S ,9 99% ;V2S ,5 75 %。第 7天为 :N ,9 2 % ;V1,8 71% ;NS ,18 72 % ;V1S ,9 66%。结论 :山梨醇可以诱导神经元凋亡 ,HSV 1能阻止原代培养的小鼠皮质神经元凋亡且与病毒毒力有关。     

线粒体在缺血再灌注继发的神经元细胞凋亡中的作用

目的 观察线粒体功能失调在缺血再灌后神经元凋亡中的作用。方法(1)采用体外培养神经母细胞瘤细胞株N2a细胞，体外模拟缺血再灌注(缺氧90min，然后再灌不同时间)；(2)采用琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡情况；(3)MTT法、细胞色素c释放和跨膜压的改变判断线粒体的功能；(4)caspase-3活性测定采用水解其可见光底物。结果(1)N2a细胞缺血再灌12h即出现明显DNA片段化，24h更明显；(2)线粒体酶活性降低．跨膜电位在缺氧再灌1h先短暂下降再升高然后又明显降低。细胞色素c缺氧再灌3h开始下降，6h达到高峰．持续到24h；(3)caspase-3活性在缺氧再灌10h升高，24h达到高峰，线粒体通透性转换孔形成抑制剂CsA只能抑制部分caspasc-3的活性和DNA片段化改变；而caspase-8抑制剂虽不能完全抑制caspase-3的活性但能完全抑制DNA的片段化。结论N2a凋亡尚存在有caspase-3依赖性和非依赖性两条途径线粒体功能失调在缺氧再灌引起的N2a细胞凋亡过程中可能起到凋亡早期的启动和随后的信号放大作用。     

黄芩苷对AB25-35诱导人神经原母细胞瘤SH-SY5Y凋亡的保护作用

目的：探讨黄芩苷对Aβ诱导的神经细胞凋亡的保护作用,同时通过对诱导凋亡的关键因素综合分析阐明其作用机制。 方法：①实验方法及分组：正常对照组,神经元母细胞瘤SH-SY5Y无血清培养;模型组,模型组加终浓度为25μmol/L 的Aβ25-35处理24h;黄芩苷治疗组,黄芩苷预处理1h,再加终浓度为25μmol/L的 Aβ25-35处理24h,大剂量组采用100μM,小剂量组采用50μM。②实验评估：各实验组作用24小时后,收集细胞上清ELISA测定细胞NO、LDH分泌;MTT实验测定各组细胞存活率;流式细胞仪测定细胞凋亡及线粒体膜电位的改变;RT-PCR检测caspase-3的mRNA水平。 结果：MTT实验显示,Aβ25-35处理后SH-SY5Y细胞的存活率明显下降（p<0.01）,而黄芩苷各治疗组则显示出明显的保护作用（p＜0.05,p＜0.01）;细胞上清LDH活性测试显示,Aβ25-35组上清中的LDH明显升高（p＜0.01）;黄芩苷组各治疗组与模型组比差异显著（p＜0.05,p＜0.01）;比色法测定细胞上清中NO分泌显示,Aβ25-35处理后细胞NO分泌明显上升（31.64±1.96μM）,而黄芩苷各治疗组均能有效抑制NO的产生,黄芩苷100μM（9.43±0.63μM）,黄芩苷50μM（23.41±0.94μM）p＜0.01;流式细胞仪分别测定细胞凋亡率及线粒体膜电位,结果显示与正常对照组比较Aβ25-35明显诱导了细胞凋亡,同时线粒体膜电位也明显下降（p＜0.01）,而黄芩苷各治疗通过保护线粒体膜电位有效抑制了凋亡的发生发生;进一步的caspase-3mRNA表达测定中也显示黄芩苷各组均能明显抑制caspase-3的表达。 结论：本研究结果明确了黄芩苷能有效抑制Aβ25-35诱导的神经元细胞的调亡,在进一步机制研究中显示了黄芩苷同过抑制自由基损伤、调亡分子caspase-3的表达以及保护线粒体正常功能等凋亡发生的关键环节保护了神经元细胞。     

脓毒症大鼠模型脑胰岛素生长因子1表达的变化及影响

目的：探讨脓毒症大鼠模型胰岛素生长因子1（IGF-1）表达的变化及影响。方法采用盲肠结扎穿孔法（CLP）制作脓毒症大鼠模型,应用免疫荧光染色观察皮层IGF-1阳性细胞, western blot法检测IGF-1和caspase-3蛋白表达,TUNEL染色观察脑神经元凋亡。在脓毒症模型基础上,给予侧脑室定位注射IGF-1或生理盐水,相同方法检测caspase-3蛋白表达及脑神经元凋亡。结果与假手术组相比,脓毒症组大鼠皮层IGF-1阳性细胞数明显减少,caspase-3表达增高,IGF-1表达减低,神经元凋亡增加（均P＜0．05）。侧脑室注射IGF-1后,caspase-3表达和神经元凋亡较假手术组无明显变化;而侧脑室给予生理盐水大鼠caspase-3表达和神经元凋亡与脓毒症组相似。结论脓毒症大鼠的脑皮层IGF-1表达明显减低,细胞凋亡增多。给予外源性IGF-1后,细胞凋亡减少。提示IGF-1可能通过抑制caspase-3的上调对脓毒症大鼠起到脑保护作用。     

siRNA细胞色素c基因静默对大鼠脑皮质神经元体外模拟缺血再灌注损伤的影响

目的探讨体外模拟缺血再灌注（ischemia／reperfusion，IS／RE）后大鼠脑皮质神经元内质网应激凋亡的机制及抑制细胞色素c（Cyt c）表达对内质网应激的影响。方法体外培养SD乳鼠脑皮质神经元，用免疫组织化学、免疫荧光染色鉴定神经元纯度；用流式细胞术AnnexinV、PI双标检测调亡率及活性Caspase-3，-7，-9表达水平；用Westernblot免疫印迹方法检测Caspase-12、GRP78、Bcl-2、Cytc蛋白表达水平。结果SD乳鼠皮质神经元可纯化体外培养；空转染组神经元模拟缺血6h再灌注24h及48h（IS6h／RE24h、48h）细胞凋亡率分别是17．95％、22．62％；CytC基冈静默后凋亡率分别降至10．26％、9．37％，空转染组与转染组比较有统计学意义（P＜0．05）；空转染组神经元模拟缺血再灌注后GRP78、Cytc、活性Caspase-3、caspase-9、caspasel2表达均增加．Bcl2表达减少；siRNA Cyt c基因静默后神经元Bcl-2表达增加，GRP78、活性caspase-12、caspase-3、caspase-9表达明显降低，2组比较有统计学意义（P＜0．05）；空转染组和转染组均未检测到caspase-7表达。结论体外模拟缺血再灌注后脑皮质神经元发生凋亡，线粒体、内质网应激参与了神经元凋亡；抑制细胞色素c释放对内质网应激凋亡有抑制作用。     

大鼠脑缺血再灌注后Caspase-3、Bcl-2和Bax的表达

目的探讨大鼠脑缺血再灌注后caspase-3、Bcl-2和Bax在脑皮质神经元中的表达。方法将动物随机分为假手术组及缺血组,参照zea longa线栓法建立大鼠左侧大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)局灶性脑缺血再灌注模型,各组大鼠分别在左侧MCAO2h再灌注不同时间点断头取脑,脑皮质神经元中caspase-3、Bcl-2和Bax的表达通过免疫组化法来测定。结果缺血组大鼠脑皮质caspase-3的表达较假手术组显著增强(P<0.01),缺血组大鼠脑皮质Bcl-2的表达较假手术组显著增强(P<0.01),缺血组大鼠脑皮质Bax的表达较假手术组显著增强(P<0.01)。结论短暂性脑缺血再灌注上调脑皮质神经元中caspase-3和Bax的表达促细胞凋亡,上调脑皮质神经元中Bcl-2的表达抗细胞凋亡。     

线粒体钙单向转运体在匹鲁卡品致痫大鼠海马神经损伤中的作用

目的研究线粒体钙单向转运体(mitochondrial calcium uniporter,MCU)在氯化锂-匹鲁卡品(pilocarpine,PILO)癫痫大鼠模型神经损伤中的作用。方法将84只雄性SD大鼠随机分成空白对照(CON)组、PILO组(2 h、8 h、24 h和72 h 4个亚组)、Ru360组和精胺(Spermine)组。观察各组大鼠行为学改变,并荧光染色法测定海马组织线粒体Ca~(2+)浓度,TUNEL染色检测海马CA3区神经元凋亡,并采用Western Blot法检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Cyt C和caspase-3表达变化。结果 (1)与CON组比较,PILO组海马神经元线粒体Ca~(2+)浓度明显升高,凋亡明显增加(P0.05);与CON组比较,PILO组海马Bax表达水平、线粒体Cyt C释放及caspase-3激活明显增多,而Bcl-2表达水平明显减少(P0.05)。(2)与PILO组比较,Ru360组海马神经元线粒体Ca~(2+)浓度明显降低,凋亡明显减少(P0.05);与PILO组比较,Ru360组海马Bax表达水平、线粒体Cyt C释放及caspase-3激活明显减少,而Bcl-2表达水平明显增多(P0.05)。(3)与PILO组比较,Spermine组海马神经元线粒体Ca~(2+)浓度明显升高,凋亡明显增加(P0.05);与PILO组比较,Spermine组海马Bax表达水平、线粒体Cyt C释放及caspase-3激活明显增多,而Bcl-2表达水平明显减少(P0.05)。结论 MCU在PILO癫痫大鼠海马神经损伤中发挥重要作用,抑制MCU可发挥对海马神经元凋亡的保护作用,其机制可能是通过抑制线粒体介导的细胞凋亡途径。     

早期大剂量caspase-3抑制剂对兔蛛网膜下腔出血后脑皮层神经元凋亡的影响

目的观察早期使用大剂量特异性半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)抑制剂对兔蛛网膜下腔出血(SAH)后脑皮层神经元的凋亡的影响。方法枕大池二次注血法建立兔SAH模型。一次注血后第5天灌流固定法处死动物。用免疫组化及凋亡细胞原位末端标记技术(TUNEL)分别检测颞叶皮层神经元caspase-3的表达及凋亡情况。结果免疫组化显示SAH Z-DEVD-FMK(一种特异性caspase-3抑制剂)组皮层神经元caspase-3表达较SAH组及SAH 二甲基亚砜(DMSO,有机溶剂)组明显降低(P＜0．05)；TUNEL染色结合凋亡指数(AI)显示SAH组及SAH DMSO组较对照组存在明显皮层神经元凋亡(P＜0．01),而SAH Z-DEVD-FMK组皮层神经元凋亡较SAH组及SAH DMSO组明显减轻(P＜0．01)。结论早期使用特异性大剂量caspase-3抑制剂能减轻兔SAH后脑皮层神经元的凋亡,起到脑保护的作用。     

脑牵拉引起脑神经元凋亡的实验研究

目的探讨脑牵拉压（BRP）的测量方法及脑牵拉压引起神经元细胞凋亡的规律和机制.方法利用电阻应变计制作脑牵拉力的测量装置,对其定标.选用新西兰大白兔30只,分为30、40、50 g组,牵拉完毕后,用流式细胞仪检测各组脑牵拉压区神经细胞凋亡的百分率和细胞线粒体的活性变化.结果30 g的BRP牵拉30 min引起较低的细胞凋亡率,几乎不影响细胞线粒体的膜电位;40 g的BRP牵拉30 min引起较高的细胞凋亡率.细胞线粒体的膜电位明显降低;50 g的BRP牵拉15 min引起更高的细胞凋亡率,细胞线粒体的膜电位显著降低.结论该装置可作为脑牵拉压的测量工具,脑牵拉可引起神经元细胞凋亡以及细胞线粒体膜电位降低.实验性脑牵拉时,最好将BRP控制在40 g以下.     

Caspase-3-dependent reactivation of latent herpes simplex virus type 1 in sensory neuronal cultures

Life-long latent herpes simplex virus type 1 (HSV-1) is harbored in sensory neurons where sporadic reactivation occurs. Reactivation stimuli may involve activation of apoptotic signaling in the neuron. Previous experiments have demonstrated that reactivation of latent HSV-1 in dorsal root ganglion (DRG) neuronal cultures occurred following nerve growth factor (NGF) deprivation. NGF deprivation stimulates apoptotic signaling by activating the proapoptotic proteolytic enzyme, caspase-3. When DRG neuronal cultures harboring latent HSV-1 were treated with a caspase-3-specific inhibitor, NGF deprivation-induced reactivation was significantly reduced. Interestingly, the caspase-3 inhibitor had no effect on productive HSV-1 infection. Furthermore, activation of caspase-3 with either C2-ceramide or a recombinant adenovirus expressing caspase-3 caused significant HSV-1 reactivation.     

New modified activated partial thromboplastin time and prothrombin time methods using a synthetic chromogenic substrate in combination with diazotization

A chromogenic substrate, H-D-Phe-Pip-Arg-pNA (S-2238) is a highly specific substrate to thrombin and releases p-nitroaniline (pNA) by the action of thrombin. We describe new modified APTT and PT methods using S-2238 in combination with the diazotization of pNA. In the modified APTT method, 100 microliter citrated plasma (diluted to 10-fold), 90 microliter 1 mM S-2238, 100 microliter 20 mM CaCl2 and 100 microliter Actin were mixed in an ice-bath, then incubated for 8 min at 37 degrees C. The reaction was stopped, and the generated pNA was diazotized by adding the following solutions sequentially: 975 microliter 0.04% sodium nitrite, 975 microliter 0.3% ammonium sulfamate and 975 microliter 0.07% N-(l-naphthyl)-ethylenediamine dihydrochloride. Diazotization changed pNA from yellow to pink. Then, absorbance at 545 nm was read, and values were expressed as thrombin units/ml plasma. In the modified PT method, 100 microliter citrated plasma (diluted to 20-fold), 90 microliter 1 mM S-2238 and 200 microliter tissue thromboplastin-C solution were mixed and processed as above. Correlations of the present modified APTT and APTT methods, and of modified PT and PT methods were significant (r = 0.426, p less than 0.01 and r = 0.561, p less than 0.01, respectively).     

促红细胞生成素在脑缺血再灌注损伤中对线粒体的保护作用

目的 探讨促红细胞生成素(EPO)在脑缺血再灌注损伤中对线粒体功能的保护作用. 方法 30只SD大鼠按随机数字表法分为正常对照组、缺血再灌注组和EPO治疗组3组,每组各10只.EPO治疗组和缺血再灌注组用线栓法复制脑缺血再灌注模型.EPO治疗组在缺血再灌注后1、24、48、60 h腹腔注射EPO,剂量为3000 U/kg(用生理盐水以1:1比例稀释),缺血再灌注组腹腔注射同等剂量的生理盐水.正常对照组仅分离颈部动脉,动脉不做栓塞处理.缺血后72h观察各组大鼠脑组织神经细胞线粒体跨膜电位、线粒体丙二醛、超氧化物歧化酶、Na十_K+.ATP酶活性、一氧化氮含量和免疫组化检测海马区Caspase-3阳性细胞数的变化. 结果 EPO治疗组的神经细胞线粒体跨膜电位(77.48±5.93)、超氧化物歧化酶[(96.91±8.66)p,kat/g]、Na+_K+-ATP酶活性[(10.48±2.77)μkat/g]明显高于缺血再灌注组[44.47±17.35、(84.46±8.54)μkat/g、(7.37±2.87)μkat/g],线粒体丙二醛[(37.99±5.38)μmol/g]、一氧化氮含量[(10.18±2.02)μmol/g]、Caspase-3阳性细胞数(66.31±8.09)明显低于缺血再灌注组[(44.83±6.48)μmol/g、(12.12±2.14)μmol/g、74.90±7.42]. 结论 EPO对缺血再灌注损伤脑组织产生保护作用的重要机制之一是保护神经细胞线粒体的功能,其核心是抑制线粒体跨膜电位的下降.     

Seizure, neuron loss, and mossy fiber sprouting in herpes simplex virus type 1-infected organotypic hippocampal cultures

PURPOSE: Epileptic seizures are frequently seen after viral encephalitis. Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) encephalitis is the most common cause of acquired epilepsy in humans. However, little information is available about the neuropathogenesis of HSV-1-associated seizures. We have developed an in vitro HSV-1-infected organotypic hippocampal slice culture to elucidate the underlying mechanisms of HSV-1-associated acute seizure activity. METHODS: Hippocampal slice cultures were prepared from postnatal day 10 to 12 rat pups. Wild-type HSV-1 strain RE (1 x 10(5) PFU) was applied to cultures at 14 days in vitro. The excitability of CA3 pyramidal cells and hippocampal network properties were measured with electrophysiological recordings. Hematoxylin-eosin (H&E) and Timm stains were used. RESULTS: HSV-1 infection induces epileptiform activity, neuron loss, and subsequently a dramatic increase of mossy fiber sprouting in the supragranular area. With intracellular recordings, surviving CA3 pyramidal cells exhibited a more depolarizing resting membrane potential concomitant with an increase in membrane input resistance and had a lower threshold to generate synchronized bursts and a decrease in the amplitude of afterhyperpolarization than did controls. When the antiherpes agent acyclovir was applied with a delay of 1 or 24 h after HSV-1 infection, a dramatic inhibition of HSV-1 replication and protection of the neuron loss were observed. CONCLUSIONS: These results suggest that a direct change in the excitability of the hippocampal CA3 neuronal network and HSV-1-induced neuron loss resulting in subsequent mossy fiber reorganization may play an important role in the generation of epileptiform activity.     

NADPH氧化酶对HSV-1感染的小胶质细胞MMP-9激活的影响

目的 探讨NADPH氧化酶在单纯疱疹病毒1型(HSV-1)诱导的小鼠小胶质细胞(BV2)基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达中的作用. 方法 应用0.5、1.0mmol/LNADPH氧化酶特异性抑制剂Apocynin作用HSV-1诱导的BV2细胞,采用明胶酶谱分析细胞培养上清中MMP-9活性;RT-PCR检测NADPH氧化酶亚基p47phox及MMP-9 mRNA的表达;Dihydroethidium(DHE)测定细胞内活性氧簇(ROS)的产生量. 结果 与正常对照组比较,HSV-1诱导的BV2培养上清中MMP-9活性增加,p47phox、MMP-9 mRNA的表达增高,细胞内ROS水平增高约两倍以上,差异均有统计学意义(P＜0.05);0.5 mmol/L Apocynin作用后可使上述变化减轻,但仍高于正常对照组,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 NADPH氧化酶在HSV-1激活小胶质细胞MMP-9表达中可能起重要作用.     

TSA联合HSV-1对C6鼠胶质瘤细胞株细胞增殖、细胞凋亡的影响

目的探讨曲古抑菌素A(TSA)联合Ⅰ型单纯疱疹病毒(HSV-1)对C6鼠胶质瘤细胞株细胞增殖、细胞凋亡的影响。方法体外培养C6胶质瘤细胞,设对照组(加入等体积培养基)、TSA组(加入0.5×10^-3μmol/L TSA处理)、HSV-1(加入10 MOI HSV-1处理)及TSA+HSV-1组(加入0.5×10^-3μmol/L TSA和10 MOI HSV-1处理)共4组,每组设5个复孔。CCK-8法检测细胞增殖活性;流式细胞仪检测细胞凋亡率;RT-PCR、免疫印迹法检测血管内皮细胞生长因子(VEGF)的mRNA和蛋白表达水平。结果作用48、72 h,与对照组相比,TSA组、HSV-1组、TSA+HSV-1组C6细胞增殖活性显著降低(P<0.01),细胞凋亡率明显增高(P<0.05),VEGF mRNA和蛋白表达水平明显降低(P<0.05);而且,TSA+HSV-1组明显优于TSA组和HSV-1组(P<0.05)。结论TSA联合HSV-1对体外培养的C6细胞可产生协同或叠加杀伤作用,抑制VEGF表达可能是作用机制之一。     

Herpes simplex virus type 1 inoculation enhances hippocampal excitability and seizure susceptibility in mice

Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) is the major pathogen related to epilepsy. However, little is known about the pathogenesis of HSV-1-associated epilepsy. Here, we report that corneal inoculation of mice with HSV-1 induces acute spontaneous behavioural and electrophysiological seizures and chronically increases hippocampal excitability and seizure susceptibility. In slices from infected mice, the surviving hippocampal CA3 pyramidal neurons exhibited a more depolarizing resting membrane potential concomitant with an increase in membrane input resistance. They also had a lower threshold for generating synchronized bursts and a decrease in the amplitude of afterhyperpolarization (AHP) than did controls. These results suggest that a direct change in the excitability of the hippocampal CA3 neuronal network could play an important role in facilitating the development of acute seizures and subsequent epilepsy.     

三叉神经根区周围蛛网膜粘连与HSV-1感染关系的实验研究

目的 研究三叉神经痛患者三叉神经根区周围蛛网膜粘连与单纯疱疹病毒Ⅰ型感染的关系.方法 实验组40 例三叉神经痛患者三叉神经根区粘连的蛛网膜,对照组20 例外伤患者蛛网膜,每例蛛网膜分别做病理切片,PCR 检测HSV-1 特异性基因片段以及用HSV-1 单克隆抗体检测抗原的表达.结果 实验组病理切片光镜下粘连的蛛网膜主要以炎细胞浸润、水肿、钙化以及粘液样变性为主,检测到HSV-1 特异性基因片段阳性率为72.5% (29 /40),抗原阳性率为17.5% (7 /40),即以潜伏感染为主,少部分呈增值性感染.对照组病理切片有3 例细胞轻度水肿,余均为正常蛛网膜结构.有4 例HSV-1 特异性基因片段阳性,无抗原阳表达.卡方检验实验组和对照组蛛网膜HSV-1 的感染率有统计学差异(P＜0.05).结论 三叉神经根区蛛网膜的粘连与HSV-1 的感染密切相关;粘连的蛛网膜加剧了根区动脉对三叉神经根的压迫,是加重三叉神经痛的病因之一.