肾上腺髓质素对豚鼠心室肌细胞L-型钙通道的作用及其信号转导机制

目的: 研究肾上腺髓质素( adrenomedullin, ADM)抑制豚鼠心室肌细胞L-型钙通道的信号转导机制。方法: 应用全细胞膜片钳技术,记录应用ADM(1-100 nmol·L^-1)前后L-型钙电流(I_Ca,L),以及分别记录应用ADM特异性受体拮抗剂ADM_22-52(100 nmol·L^-1)+ADM(100 nmol·L^-1)、蛋白激酶A (PKA) 特异性拮抗剂H-89(10 μmol·L^-1) + ADM(100 nmol·L^-1)、蛋白激酶C (PKC) 特异性拮抗剂PKC_19-36(10 μmol·L^-1)+ADM(100 nmol·L^-1)、PKC特异性激动剂PMA(1 μmol·L^-1)前后I_Ca,L。结果: ADM(1-100 nmol·L^-1)浓度依赖性地抑制豚鼠心室肌细胞I_Ca,L,并可被ADM_22-52(100 nmol·L^-1)完全阻断;H-89(10 μmol·L^-1)对ADM抑制I_Ca,L的作用无影响。PKC_19-36(10 μmol·L^-1)可完全阻断ADM 对I_Ca,L的抑制效应,且PMA(1 μmol·L^-1)可模拟ADM 对I_Ca,L的抑制效应。结论: ADM作用于特异性ADM受体可浓度依赖性地抑制豚鼠心室肌细胞I_Ca,L,此作用有可能与PKC激活相关。     

汉防己碱与1, 6-二磷酸果糖对兴奋性氨基酸所致突触体内游离钙浓度升高的影响

目的:研究汉防己碱(Tet)与1, 6-二磷酸果糖(FDP)对兴奋性氨基酸(EAA)诱导的突触体内游离钙浓度升高的影响。方法:制备大鼠脑突触体, 以荧光法测定突触体内游离钙浓度;加入谷氨酸(Glu, 100μmol·L^-1), 天冬氨酸(Asp, 100μmol·L^-1), N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA, 100μmol·L^-1)及Glu+Asp(50μmol·L^-1+50μmol·L^-1)后, 测定突触体内游离钙浓度的变化;提前给予Tet(10、30、60μmol·L^-1), FDP(15、30、75、150μmol·L^-1), MK-801(10、20μmol·L^-1)及Tet+FDP(10+15, 30+30μmol·L^-1)预孵, 再加入上述浓度的Glu、Asp、NMDA及Glu+Asp, 观察突触体内游离钙浓度的变化。结果:Glu、Asp、NMDA及Glu+Asp均呈剂量依赖性升高突触体内游离钙浓度, 提前给予不同浓度的Tet、FDP、MK-801及Tet+FDP, 均可使突触体内游离钙浓度呈剂量依赖性降低, 且以Tet+FDP的作用最明显。结论:Tet与FPD可显著抑制EAA诱导的突触体内游离钙浓度的升高, 这可能是二者保护缺血脑细胞的作用机制之一。Tet与FDP联合应用可能对缺血脑细胞有更强的保护作用。     

钙调神经磷酸酶在血管紧张素Ⅱ刺激的大鼠心肌细胞肥大中的作用及其活性调节

目的:观察钙调神经磷酸酶(CaN)在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)刺激的大鼠心肌细胞肥大中的作用及其活性调节。方法:建立AngⅡ诱导的大鼠心肌细胞肥大模型,观察CaN抑制剂对AngⅡ刺激的心肌细胞 [³H]-亮氨酸掺入的影响,以及各种因素对心肌细胞CaN酶活性的影响。结果:10、 100、 1000 nmol·L^-1的AngⅡ作用12 h分别使心肌细胞的CaN活性增加了13%、 57%(P＜0.05)、 228%(P＜0.01)。AngⅡ(10 nmol·L^-1)刺激心肌细胞2 h内,CaN活性与对照组无明显差异(P＜0.05);AngⅡ刺激心肌细胞12 h以上,CaN活性才明显增高(P＜0.05)。Losartan(50 μmol·L^-1)、H₇(50 μmol·L^-1)及Fura-2/AM(4 μmol·L^-1)可明显抑制AngⅡ刺激的心肌细胞CaN活性;而PD98059(50 μmol·L^-1)对AngⅡ刺激的心肌细胞CaN活性无明显影响。AngⅡ(10^-7mol/L)刺激的大鼠心肌细胞 [³H]-亮氨酸掺入明显高于对照组(P＜0.01),而CaN特异性抑制剂-环孢素A(0.5~5 μg/mL)可以明显抑制AngⅡ刺激的心肌细胞 [³H]-亮氨酸掺入。结论:依赖Ca²⁺/CaM活化的CaN可能在AngⅡ刺激的心肌细胞肥大中起重要作用;CaN的活化可能有赖于胞内Ca²⁺水平的持续升高,另外,CaN的活性还可能受到蛋白激酶C等信号分子的磷酸化调节。     

五味子乙素对氧化损伤的晶状体上皮细胞凋亡的影响

目的:探讨五味子乙素(Sch B)对实验性氧化损伤大鼠晶状体上皮细胞(LEC)凋亡的影响。方法:采用无菌操作摘取SD大鼠双眼,并在手术显微镜下分离晶状体,随机分为空白对照组、过氧化氢组(H₂O₂)、吡诺克辛(PS)组和Sch B组。使晶状体孵育在300μmol·L^-1H₂O₂培养液中复制LEC凋亡模型,同时加入终浓度为0.5mmol·L^-1的SchB,置二氧化碳培养箱共同孵育24h。取晶状体前囊膜,采用TUNEL法检测LEC凋亡及凋亡率,透射电子显微镜观察LEC超微结构改变和凋亡小体形成。结果:H₂O₂组LEC凋亡率(92.0±2.6)显著高于空白对照组(3.5±1.8)(P<0.01);SchB组LEC凋亡率(13.8±3.0)显著低于H₂O₂组,且与PS组(56.0±9.9)有显著的差异(P<0.05)。超微结构研究显示,H₂O₂组绝大多数LEC发生凋亡,并呈凋亡各期严重改变的全过程;Sch B组仅少数LEC发生凋亡,并多为早期或中期的轻微改变。结论:Sch B可明显抑制实验性氧化损伤大鼠LEC凋亡,且明显优于PS滴眼液。     

阿魏酸钠对大鼠晶状体上皮细胞凋亡相关基因BCl-2和bax的调控

目的:本研究旨在探讨阿魏酸钠 (SF)对实验性氧化损伤大鼠晶状体上皮细胞 (LEC)凋亡相关基因BCl-2和bax的调控。方法:将SD大鼠双眼随机分成空白对照组、过氧化氢 (H₂O₂)组、吡诺克辛 (PS)组和SF组。无菌操作摘除眼球并在手术显微镜下分离晶状体,使晶状体孵育在 300μmol·L^-1H₂O₂ 培养液中复制LEC凋亡模型,同时加入终浓度为 5mmol·L^-1的SF,置二氧化碳培养箱共同孵育 2 4h。取晶状体前囊膜采用免疫组化法检测凋亡相关基因BCl-2和bax的蛋白表达并进行比较。结果:(1)正常SD大鼠LEC中BCl-2和Bax均有表达,BCl-2表达较Bax表达强。 (2)H₂O₂ 组BCl-2表达显著下调,Bax表达显著上调 (Ridit检验,P <0.01);BCl-2 /Bax比率下降。(3)与H₂O₂ 组比较,SF可明显上调BCl-2表达,下调Bax表达 (P <0.01),BCl-2 /Bax比率上升。 (4)PS与SF的调节作用相似,但SF的作用强于PS(P <0.05)。结论:本研究结果表明,SF调控凋亡相关基因BCl-2和bax的表达可能是SF抑制LEC凋亡的分子机制.     

5-羟色胺对心肌细胞增殖及蛋白激酶C活性的影响

目的：观察5-羟色胺（5-HT）对新生大鼠心肌细胞增殖及蛋白激酶C（PKC）活性的影响，探讨5-HT在心肌肥大发病中的作用。方法：培养乳鼠心肌细胞,应用BCA法测定细胞总蛋白；流式细胞仪测定DNA含量；同位素底物掺入检测PKC活性。结果：5-HT在1 μmol·L^-1、10 μmol·L^-1和100 μmol·L^-1时均显著促进心肌细胞蛋白质和DNA合成，以10 μmol·L^-1剂量时作用最强。5-HT在1 μmol·L^-1和10 mol·L^-1剂量时可加强心肌细胞PKC活性，并促使PKC从胞浆移位到细胞膜，5-HT₂受体拮抗剂mianserin可逆转此作用。结论：5-HT可促进新生大鼠心肌细胞总蛋白和DNA合成，并通过心肌细胞5-HT₂受体激活PKC活性，促使PKC从胞浆移位到细胞膜，提示5-HT可能参与心肌肥大的发生发展过程.     

甲基莲心碱对耐长春新碱人胃癌细胞多药耐药性的逆转

目的:研究甲基莲心碱(Nef)逆转耐长春新碱人胃癌细胞多药耐药性(MDR)的作用及机制。方法:采用噻唑蓝(MTT)比色法检测长春新碱(VCR)的细胞毒性;PI染色流式细胞计数测定VCR诱导细胞凋亡;间接免疫荧光流式细胞术检测细胞P-gp和MRP的表达。结果:Nef(5、10μmol·L^-1)对人胃癌细胞(SGC7901)和耐长春新碱人胃癌细胞(SGC7901/VCR)无显著毒性作用,VCR对敏感株SGC7901的IC₅₀为0.06mg·L^-1,而对MDR细胞株SGC7901/VCR的IC₅₀为2.32mg·L^-1,SGC7901/VCR较SGC7901对VCR耐药39倍,Nef(2.5、5、10μmol·L^-1)能使VCR对SGC7901/VCR细胞的IC₅₀从2.32mg·L^-1依次下降至0.34、0.12、0.05mg·L^-1,逆转倍数分别为6.8、18.1、43.8。Nef(2.5、5、10μmol·L^-1)能降低SGC7901/VCR细胞对VCR的凋亡抗性,其作用强于维拉帕米(VRP)。SGC7901/VCR细胞较SGC7901细胞高表达P-gp、MRP,Nef(10μmol·L^-1)处理24h后,SGC7901/VCR细胞P-gp、MRP的表达明显低下。结论:Nef具有逆转耐长春新碱人胃癌细胞的MDR作用,其作用机理与下调P-pg和MRP表达有关。     

白三烯D4在促进培养的人气管 平滑肌细胞增殖中的作用

目的和方法:研究白三烯D₄(LTD₄)是否剌激培养的人气管平滑肌细胞(ASMC)增殖。将分离的人ASMC进行传代培养,在培养基中加入各种浓度的LTD₄,计数细胞并测定 [³H]-胸腺嘧啶核苷([³H]-TdR)掺入量和三磷酸肌醇(IP₃)累积量。结果: LTD₄在一定范围内(0.1 nmoL·L^-1~10 nmoL·L^-1)以浓度依赖的方式增加人ASMC(P＜0.01)。LTD₄也增加[³H]-TdR的掺入量和IP₃累积量(P＜0.01)。磷脂酶C抑制剂新霉素(1 μmol·L^-1)阻止IP₃累积量的增加(P＜0.01)。结论:LTD₄剌激培养的人ASMC增殖并且可能在哮喘的气道重塑中起了作用。     

过氧化氢对血管平滑肌细胞增殖和明胶酶A及其抑制因子基因表达的影响

目的:探讨过氧化氢(H₂O₂)对体外培养大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)增殖和明胶酶A(MMP-2)、及其抑制因子(TIMP-2)基因表达的影响。方法:先用四甲基偶氮唑(MTT)法筛选出H₂O₂对VSMC的毒性作用浓度和增殖作用浓度,在此基础上用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法测定H₂O₂对MMP-2、TIMP-2mRNA表达的影响。结果:H₂O₂浓度大于300μmol/L后显示出对VSMC的致死毒性作用;H₂O₂浓度在0.01-5.0μmol/L内可以刺激VSMC的增殖,且呈时间依赖性;1μmol/LH₂O₂、10μmol/LH₂O₂对MMP-2基因转录有明显的促进作用;不同浓度的H₂O₂对TIMP-2基因转录无明显促进作用。结论:适当浓度的H₂O₂可以促进VSMC的增殖和MMP-2mRNA表达,但对TIMP-2mRNA表达无明显作用,提示H₂O₂参与了血管重塑的不同病理环节。     

过氧化氢对乳鼠心肌细胞内游离钙浓度的影响及牛磺酸的拮抗作用

目的:研究过氧化氢(H₂O₂)对心肌细胞i的影响,以及牛磺酸对H₂O₂诱导钙超载的拮抗作用。方法:采用SD大鼠乳鼠进行心肌细胞培养,实验分4组:①正常对照组;②H₂O₂组:加入终浓度为100μmol/L的H₂O₂;③H₂O₂＋牛磺酸(同时)组:牛磺酸30mmol/L与H₂O₂100μmol/L同时加入;④H₂O₂＋牛磺酸(先后)组:先加入终浓度为100μmol/L的H₂O₂,2min后再加20mmol/L的牛磺酸。以Fluo-3/AM荧光指示剂负载,应用激光共聚焦显微镜技术,分别于加入H₂O₂后即刻与15min,检测i变化。结果:对照组心肌细胞内荧光强度和荧光光密度值较低。H₂O₂加入后即刻,细胞内荧光光密度值开始增加,15min后细胞内荧光强度和荧光光密度值显著高于对照组(P＜0.05)。而H₂O₂＋牛磺酸(同时)组细胞内荧光光密度值显著低于H₂O₂组(P＜0.05vsH₂O₂组);H₂O₂＋牛磺酸(先后)组细胞内荧光光密度值显著低于H₂O₂组(P＜0.05vsH₂O₂组)。结论:H₂O₂可引起心肌细胞内钙超载;牛磺酸能显著减轻H₂O2诱导的心肌细胞内Ca²⁺超载。     

过氧化氢对大鼠海马CA1区神经元钠电流的影响

目的与方法:采用全细胞膜片钳技术研究过氧化氢(H₂O₂)对急性分离的大鼠海马CA1区神经元钠电流的影响。结果:①过氧化氢可剂量依赖地增大钠电流,剂量为10μmol/L和100μmol/L时,钠电流分别增大(48.0±4.2)%和(88.2±5.1)%(n=10)。②10μmol/L的H₂O₂不影响钠电流的激活过程,却非常显著地影响其失活过程,作用前后的半数失活电压分别为(-64.58±1.22)mV和(-53.55±0.94)mV(n=10,P<0.01),但不改变失活曲线的斜率因子。结论:H₂O₂作为体内氧化代谢产物可能与一些神经系统疾病的发生有关。     

过氧化物酶体增殖物激活受体α在实验性大鼠脂肪肝中的表达

目的:研究过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)表达异常在脂肪肝发生中的作用。方法:采用小剂量CCl₄后肢皮下注射, 并高脂饮食复制大鼠脂肪肝动物模型, 检测肝脏甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)和游离脂肪酸(FFA)含量及血清谷丙转氨酶(ALT)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和FFA含量, 并做病理切片, 测定肝脂变面积。提取肝脏总RNA, 运用半定量RT-PCR方法对肝脏PPARαmRNA的表达情况进行分析。结果:脂肪肝模型组大鼠肝脏TG、TC、FFA含量分别为(1.88±0.20)mmol·L^-1、(11.03±1.12)mmol·L^-1和(1260.38±151.27)μmol·L^-1, 正常对照组则为(0.53±0.10)mmol·L^-1、(1.25±0.25)mmol·L^-1和(334.30±27.09)μmol·L^-1(P＜0.01)。血清ALT、TNF-α和FFA含量亦明显高于对照组。肝脏PPARα的灰度比值:脂肪肝模型组0.41±0.28, 正常对照组1.41±0.29(P＜0.01)。结论:肝细胞中毒性脂肪肝时, 肝脏PPARα表达减少, 使肝中脂质的利用和脂肪酸的氧化均发生障碍, 导致肝脂蓄积。     

17β-雌二醇对骨髓基质细胞骨形态发生蛋白受体ⅠA、B mRNA表达的影响

目的:研究骨髓基质细胞在向成骨细胞分化的介质中,17β-雌二醇(E₂)对其骨形态发生蛋白受体(BMPR)ⅠA,ⅠBmRNA表达的影响,探讨雌二醇对成骨细胞生成的作用。方法:用1,25(OH)₂D₃和地塞米松(DEX)诱导大鼠骨髓基质细胞向成骨细胞分化,应用半定量RT-PCR技术,观察不同浓度E₂对骨髓基质细胞分化过程中BMPR-ⅠA,ⅠBmRNA表达的影响,以α-磷酸奈酚为底物测定细胞碱性磷酸酶的活性,VanGieson染色法显示Ⅰ型胶原的含量。结果:E₂能明显抑制骨髓基质细胞分化过程中BMPR-ⅠAmRNA的表达,且呈剂量依赖性,随E₂浓度增加,BMPR-ⅠAmRNA从(23.7±1.7)%降至(16.3±1.5)%(P<0.05)和(8.3±1.2)%(P<0.01);BMPR-ⅠBmRNA随E₂浓度增加而增加,从(1.3±0.6)%增至(5.7±2.0)%(P<0.05)和(15.3±3.0)%(P<0.01)。ALP活性随E₂浓度增加而降低,从(42.6±2.5)U·L^-1·g^-1protein降至(10.8±1.5)U·L^-1·g^-1protein和(3.6±1.7)U·L^-1·g^-1protein(P<0.01);细胞Ⅰ型胶原的含量随E₂浓度增加而减少。结论:E₂能明显抑制体外培养的骨髓基质细胞分化过程中BMPR-ⅠAmRNA的表达,降低成骨细胞生成。     

丹酚酸B抑制氧化应激引起骨髓间质干细胞凋亡的研究

目的: 观察丹酚酸B (Sal B)对氧化应激介导骨髓间质干细胞(BMSCs)凋亡的影响并探讨其作用机制。方法: 大鼠BMSCs培养鉴定后分为5组:空白对照组、氧化应激组、低浓度Sal B＋H₂O₂组、中浓度Sal B＋H₂O₂组和高浓度Sal B＋H₂O₂组。应用MTT、流式细胞仪(FCM)及Hoechst标记的方法检测Sal B对氧化应激介导的细胞活性下降以及凋亡效应的影响;通过DCF荧光染色的方法检测过氧化氢及Sal B对细胞内活性氧生成的影响;用Western blotting的方法检测p-ERK1/2表达情况。结果: MTT结果显示不同浓度的Sal B共处理BMSCs 24 h能够提高氧化应激情况下的细胞活性,其中中浓度组的作用更为明显。Hoechst标记以及FCM检测的结果表明:10 μmol/L Sal B处理能够提高细胞活性,减少凋亡数。正常组细胞的DCF阳性细胞率为28.7％±8.1％,经500 μmol/L H₂O₂刺激24 h后,阳性细胞数急剧上升,高达86.9％±12.4％。而10 μmol/L Sal B处理 组的上升不明显,仅有42.1％±10.8％。由此可见,Sal B处理可以减少细胞内活性氧的生成;细胞在氧化应激的条件下p-ERK1/2在15 min内开始上调,持续120 min。而这种上调经10 μmol/L Sal B处理可以有效降低,同时Sal B可以降低细胞基础的p-ERK1/2表达。结论: Sal B 增强BMSCs抗氧化应激能力从而减少H₂O₂刺激引起的细胞凋亡,其保护机制可能与参与调节凋亡相关信号通路MEK/ERK1/2和抑制细胞内活性氧生成有关。