乙醇体系中酶抑制法检测氨基甲酸乙酯的研究

研究了在乙醇-水溶液和乙醇-缓冲液体系中,以乙酰胆碱酯酶对底物碘化硫代乙酰胆碱进行水解。根据氨基甲酸乙酯对乙酰胆碱酯酶的抑制率与吸光度的线性关系,测定体系中氨基甲酸乙酯的含量。实验发现,在乙醇-水溶液中,此方法不可行;而在低浓度乙醇-缓冲液体系中,氨基甲酸乙酯对乙酰胆碱酯酶的抑制率与其浓度在一定范围内呈线性关系。在5%、10%和15%乙醇-缓冲液体系中测定氨基甲酸乙酯的线性范围分别为2~10、1~5、1~5mg/L,相关系数在0.992~0.997之间,最低检出限为0.00895、0.04259、0.02916mg/L,RSD分别在1.41%~2.17%、0.34%~0.55%和3.61%~6.44%范围内。该法快速简便,所用仪器设备简单,检测成本低。本研究为酒精饮料及发酵食品中氨基甲酸乙酯的快速、简便、低成本检测方法的研究及相关产品的开发提供一定的理论和数据支持。     

电沉积法构建AChE/COD@AuNPs共固定化酶生物传感器差分脉冲伏安法快速检测有机磷农药

有机磷农药残留危害环境和人类健康。本文采用电沉积法将乙酰胆碱酯酶(AChE)与胆碱氧化酶(COD)固定化,共修饰于裸金电极表面,构建新型固定化酶生物传感器。通过电子显微镜对固定化酶形貌进行表征,结果表明：当固定化酶生物传感器上,乙酰胆碱酯酶与乙酰胆碱氧化酶的共修饰层数为2层,修饰圈数为35圈,在氯化乙酰胆碱浓度为2 mmol/L,pH 7.8的检测体系中,该生物传感器能够识别有机磷农药信号,且检测性能尚佳。传感器在有机磷农药质量浓度为10^-9～10-7mg/L时电流响应良好,工作曲线方程为y=0.0468x+1.2124(R²=0.9985),最低检出限1.15×10^-11 mg/L(S/N=3)。本研究为现场快速检测有机磷农药提供了新的研究方法。     

鲤鱼来源乙酰胆碱酯酶的高效表达及分子对接模拟

乙酰胆碱酯酶介导的农药残留检测方法在食品安全中发挥着越来越重要的作用。本研究以鲤鱼来源的乙酰胆碱酯酶基因(Cp ACh E)为试验材料,通过基因密码子优化来提高酶的表达量;通过表征鲤鱼乙酰胆碱酯酶的酶学性质探究其在农药残留检测中的应用潜力。采用计算机模拟技术寻找有机磷农药克百威与酶结合的氨基酸残基位点。结果表明:经密码子优化的重组酶乙酰胆碱酯酶的酶活力为7.4 U/m L,表达量提高约40倍,最适反应温度25℃,最适p H 8.0。动力学参数K_m和V_(max)分别是1.639 mg/m L和8.071μmol/min/mg。不同有机溶剂和金属离子对酶活力的影响存在差异,大多数有机试剂对乙酰胆碱酯酶活性有抑制作用,而Mg~(2+)、K~+、Ca~(2+)和Li~+离子对该酶活性有促进作用,其中Mg~(2+)(5 mmol/L)的促进最为明显,使该酶活力提高约1.7倍。重组酶对8种有机磷和8种氨基甲酸酯类农药都表现出较强的敏感性,其中,克百威抑制作用最强,最低检测限为0.044μg/m L。此外,分子对接发现,克百威与重组酶中的19个氨基酸之间形成氢键和疏水作用,其中氨基酸Tyr146、Ser147和Tyr355很可能是与克百威结合的靶位点。本研究成功实现了乙酰胆碱酯酶的高效表达,探究了乙酰胆碱酯酶与克百威的结合位点,为该酶在食品中有机磷和氨基甲酸类农药残留检测的应用及理性改造提供了一定的理论指导。     

大果榕果实乙醇提取物抗氧化活性及对α-葡萄糖苷酶和乙酰胆碱酯酶抑制活性

研究大果榕果实的多酚含量及其抗氧化活性、α-葡萄糖苷酶和乙酰胆碱酯酶抑制活性,为其进一步开发利用奠定基础。以采自海南保亭七仙岭的大果榕果实为实验材料,用体积分数65%的乙醇提取大果榕果实多酚,采用Folin-酚法测定总酚含量。对获得的大果榕果实多酚进行1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基、2,2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate),ABTS)自由基、羟自由基(·OH)清除率以及α-葡萄糖苷酶抑制活性和乙酰胆碱酯酶抑制活性测定。结果表明:大果榕果实多酚含量较高,达1.92 mg/g(以干质量计),其对DPPH自由基、ABTS+·和·OH均具有显著的清除活性,且呈质量浓度依赖性,IC50值分别为141.25、91.20、45.71μg/m L;大果榕果实多酚对α-葡萄糖苷酶抑制活性强于阳性对照阿卡波糖,且呈现明显的质量浓度依赖性,IC50值为102.33μg/m L;同时大果榕果实多酚对乙酰胆碱酯酶也具有一定的抑制活性,IC50值为4.9 mg/m L。研究结果表明大果榕果实多酚具有良好的抗氧化性、α-葡萄糖苷酶抑制活性和一定的乙酰胆碱酯酶抑制活性。     

6种茶叶提取物的乙酰胆碱酯酶抑制活性研究

目的 研究6种茶叶提取物的乙酰胆碱酯酶抑制活性。方法 采用改良的Ellman酶促反应来检测乙酰胆碱酯酶的活性, 以乙酰胆碱酯酶的活性为指标, 计算乙酰胆碱酯酶抑制率。结果 6种茶叶均具有不同程度的乙酰胆碱酯酶抑制活性。当萃取物浓度为1 mg/mL时, 宁红茶表现出很强的乙酰胆碱酯酶抑制活性, 平均抑制率高达64.41%。云台山毛尖和靖安白茶抑制率较高均在50%以上, 分别为56.27%和54.42%。狗牯脑、庐山云雾茶和铁观音抑制率分别为34.53%、29.62%、21.47%。当萃取物浓度下降为0.1 mg/mL时, 萃取物抑制活性有明显下降, 6种茶的平均抑制率均小于30%。结论 6种茶叶中云台山毛尖、宁红茶和靖安白茶有较强的乙酰胆碱酯酶抑制活性, 可为开发相关的功能性食品提供参考。     

基于MnO2纳米片类氧化酶特性的有机磷农药荧光分析方法建立

利用MnO2纳米片类氧化酶特性并结合有机磷农药的酶抑制原理,构建一种快速、简便、高灵敏有机磷农药荧光分析方法。通过测定反应体系荧光强度前后的变化,可以检测样品中有机磷农药的含量。通过优化酶浓度、底物浓度和反应时间,发现乙酰胆碱酯酶浓度为9.375 U/L,底物浓度为10 mmol/L,反应时间为11 min时,该荧光分析方法检测性能最佳,对氧磷的动态检测范围为1.56～200 ng/mL,检出限达到0.5 ng/mL（RSN=3）,运用该方法测定标准添加的自来水、卷心菜、燕麦样品的回收率在83.4%～105.9%之间,表明该方法具有很高的灵敏度与准确性,为快速高灵敏测定有机磷农药提供一种新的可能。     

黄饭花对α-葡萄糖苷酶、AChE和亚硝酸根的抑制活性研究

研究黄饭花不同部位提取物对α-葡萄糖苷酶、乙酰胆碱酯酶和对亚硝酸根离子的清除能力。结果表明黄饭花60%乙醇提取物、乙酸乙酯部位提取物和正丁醇部位提取物的抑制α-葡萄糖苷酶活性强于阳性对照阿卡波糖(IC50=2.998 mg/m L),其IC50值为1.640、0.952、1.900 mg/m L;黄饭花乙酸乙酯部位提取物对乙酰胆碱酶(acetyl cholinesterase,ACh E)的抑制作用效果强于阳性对照利斯的明(IC50=0.745 mg/m L),其IC50值为0.503 mg/m L;黄饭花乙酸乙酯部位提取物对亚硝酸根离子的清除活性约高于阳性对照VC(IC50=1.199 mg/m L),其IC50值为1.079 mg/m L。黄饭花乙酸乙酯部位的提取物具有较强的抑制α-葡萄糖苷酶和ACh E活性及清除亚硝酸离子的能力。     

丝网印刷电极法快速检测纺织品中有机磷

利用丝网印刷电极,构建一种壳聚糖/乙酰胆碱酯酶的生物传感器。壳聚糖作为酶的载体,可为乙酰胆碱酯酶提供一个理想的微观环境以保持酶的活性,固载的乙酰胆碱酯酶能快速灵敏地催化溶液中的底物氯化硫代乙酰胆碱(ATCI),实现对纺织品中有机磷农药的快速筛选。该方法灵敏度高,检测速度快,成本低。     

家蝇乙酰胆碱酯酶基因密码子优化及酶学特性表征

基于密码子通用性及不同物种密码子使用频率差异原则,对家蝇乙酰胆碱酯酶的基因序列进行优化,旨在提高其在毕赤酵母中的表达量,增强其应用前景。将基因序列中的低频密码子更换为毕赤酵母偏好的密码子,同时调整乙酰胆碱酯酶各区段GC含量至45%~55%。将优化的家蝇乙酰胆碱酯酶连接至表达载体pPIC9K并转入毕赤酵母GS115中,摇瓶培养。以改进的Ellman法测定重组家蝇乙酰胆碱酯酶（mdAchE）酶学性质,通过有机磷及氨基甲酸酯类农药抑制试验分析重组酶mdAchE的生物活性。家蝇乙酰胆碱酯酶密码子优化后在毕赤酵母中实现高效表达,酶活力约8.82 U/mL。抑制试验显示,重组酶mdAchE能够被马拉硫磷等7种有机磷农药,克百威等8种氨基甲酸酯类农药抑制,最低抑制浓度IC15值为1.83×10-15 μg/mL,远远低于其它诸如气相色谱法、生物传感器等方法测得的最低检测限（0.01 μg/mL,4.14×10-6 μg/mL）。本试验结果表明,重组乙酰胆碱酯酶mdAchE在有机磷及氨基甲酸酯类农药残留的检测领域具有较大的应用潜力。     

杨梅素及其类似物抗氧化与乙酰胆碱酯酶抑制活性研究

目的:探讨杨梅素、杨梅苷及二氢杨梅素的抗氧化和乙酰胆碱酯酶抑制活性。方法:采用DPPH自由基清除和乙酰胆碱酯酶抑制高通量筛选模型进行研究。结果:杨梅素、杨梅苷和二氢杨梅素清除DPPH自由基的IC50值分别为18.34、28.89、10.70μg/mL,三种化合物的抗氧化活性均强于阳性药芦丁(IC50=31.32μg/mL),其中二氢杨梅素还强于VC(IC50=14.69μg/mL);在质量浓度为0.25mg/mL时,杨梅素、杨梅苷和二氢杨梅素对乙酰胆碱酯酶的抑制率分别为:30.66%±4.05%、38.48%±1.98%、78.81%±2.23%,其中二氢杨梅素对乙酰胆碱酯酶抑制作用较显著,其IC50值为1546±47.05μmol/L。结论:杨梅素、杨梅苷、二氢杨梅素均具有显著的DPPH自由基清除能力,本文首次报道二氢杨梅素具有较好的乙酰胆碱酯酶抑制活性,值得进一步深入研究。     

蔬菜农药残留检测中酶抑制法的应用分析

目的:探讨酶抑制法在蔬菜农药残留检测中的作用。方法:完成样品与对照溶液的制备后,采用乙酰胆碱酯酶对样品与对照溶液内残留的有机磷和氨基甲酸酯类农药进行检测。结果:白菜样品中对酶抑制率为71.2%;番茄样品对酶抑制率为89.2%;甘兰样品对酶抑制率为90.1%。根据酶抑制程度,表明3种样品中皆含有一定的农药残留。结论:运用酶抑制法能够快速测定蔬菜农药残留含量,但为了保障测定结果的准确性,应结合定性定量方式一同进行检测。     

猪脑乙酰胆碱酯酶的分离纯化和性质研究

通过离心、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose和Superdex-200层析等步骤,从猪脑中获得电泳纯乙酰胆碱酯酶,该酶比活力和纯化倍数分别为2.05 U/mg和26.97,酶活回收率为11.95%;该酶分子质量为257.30 kD,亚基为66.94 kD;以碘化硫代乙酰胆碱为底物时,酶的最适反应温度为37 ℃,最适pH值为7.4,且在40 ℃以下,pH 6.0～8.0有较好的稳定性;最适底物浓度为4.0 mmol/L,Km为0.94 mmol/L。Ba2+和Zn2+对该酶有强烈的抑制作用,而低浓度Mg2+对该酶有激活作用。     

乙酰胆碱酯酶在有机磷和氨基甲酸酯类农药快速检测中的应用

为满足食品中有机磷和氨基甲酸酯类农药的快速检测，研究采用酶抑制显色方法，应用自制的乙酰胆碱酯酶制成农药快速检测试剂盒检测有机磷和氨基甲酸酯类农药，检测灵敏度在0．001mg／kg-0．1mg／kg范围。试剂盒为现场检测这两类农药提供了简便而快捷的方法。     

黑豆酯酶检测氧乐果残留条件的优化

目的研究以氧乐果为代表的有机磷农药残留检测条件。方法以黑豆酯酶为酶源,a-乙酸萘酯为底物,采用酶抑制法,考察黑豆酯酶稀释倍数、显色时间、反应温度3个因素对黑豆酯酶活力测定的影响。然后通过3因素3水平响应面法优化黑豆酯酶活力的测定条件,并确定氧乐果对黑豆酯酶的最佳抑制时间和检测的灵敏度。结果当黑豆酯酶稀释倍数为18,显色反应时间为10 min,反应温度为41℃时,黑豆酯酶活力测定的吸光度值达到0.811。氧乐果抑制黑豆酯酶的最佳时间是4 min。绘制氧乐果对黑豆酯酶的标准曲线,得到最低检测限为0.1μg/mL。结论本研究获得了以黑豆酯酶抑制法检测氧乐果残留的最佳条件,其检测限低于有机磷农药氧乐果残留检测的最低限值要求(0.2μg/mL)。因此,以黑豆酯酶为酶源的酶抑制法可以作为有机磷农药氧乐果残留快速检测的一种有效手段。     

猪腰豆幼苗中乙酰胆碱酯酶和酯酶活性及其对农药的敏感性

选取猪腰豆为研究对象,测定不同时期、不同部位猪腰豆幼苗中乙酰胆碱酯酶(AchE)和酯酶活性,选取活性最高的部位提取酶,分别检测其对有机磷及氨基甲酸酯类农药的灵敏性,确定最低检测限。结果表明：AChE在6d子叶中比活力最高为0.969U/mg;酯酶活力在2d幼芽中最高为1.9433U/mL;AChE对农药反应的灵敏性高于酯酶,对敌敌畏、氧化乐果、灭多威的最低检测限分别为0.025、0.07、0.07mg/kg,低于国家规定的允许残留限量,可以满足农药残留快速检测的要求。     

乙酰胆碱酯酶生物传感器法测定蔬菜水果中有机磷农药残留

研究一种快速简便测定蔬菜水果中有机磷农药残留的方法。利用乙酰胆碱酯酶生物传感器技术,以苹果、黄瓜为样品,采用标准加入法进行分析,测定蔬菜水果中有机磷农药残留。实验结果表明,该方法回收率在96.45%～100.12%,相对标准偏差为2.76%～3.09%,对马拉硫磷和甲基对硫磷的检出限分别为4.80×10-11、2.93×10-10mol/L。     

豆科植物不同发育阶段不同部位乙酰胆碱酯酶活性研究

采用比色法研究不同种类豆科植物于不同发育阶段、不同部位乙酰胆碱酯酶(AChE)活性,并测定其总酯酶活性、蛋白质含量、水分含量,旨在为农药残留快速检测提供配套的新酶原。结果表明,在不同种类的豆科植物中均检测到乙酰胆碱酯酶活性,但不同种类豆科植物存在差异,干种子期、幼芽期及幼苗期各部位的乙酰胆碱酯酶活性存在差异,以每克干物质中乙酰胆碱酯酶酶活计,干种子期猪腰豆(Whitfordiodendron filipes Dunn)中乙酰胆碱酯酶酶活性最高,为10.28U/g干重。     

鲎血细胞蛋白营养学评价及其水解肽体外活性

对鲎血细胞蛋白(TTBCP)进行营养学评价,并测定TTBCP水解物的体外抗氧化性、α-葡萄糖苷酶和乙酰胆碱酯酶的抑制活性。结果显示:TTBCP中必需氨基酸优于成人的FAO/WHO推荐模式,基本符合小孩的FAO/WHO推荐模式,其中必需氨基酸与总氨基酸的比值(E/T)为31.2%,氨基酸评分(AAS)为68.1,蛋白质效率比(PER)小于2.0。TTBCP水解肽对α-葡萄糖苷酶的半数抑制浓度(IC₅₀)为0.199 mg/mL,抑制率最高达到83.8%,对乙酰胆碱酯酶同样有抑制作用;TTBCP水解肽能清除超氧阴离子自由基、DPPH自由基和羟自由基,当浓度小于0.75 mg/mL的范围时,还原能力大于维生素C。由此可见,TTBCP具有复合功效,可作为糖尿病的保健食品和药品开发利用。     

基于分子对接探究紫苏粗提物对代谢综合征相关酶的抑制作用

目的：探讨紫苏粗提物对酶的抑制作用,阐明其对代谢综合征的药效物质基础。方法：测定紫苏粗提物中黄酮及酚酸含量;以抑制率为指标,测定紫苏粗提物对不同酶活性的抑制作用;采用分子对接预测紫苏粗提物对胰脂肪酶和淀粉酶抑制作用靶点。结果：紫苏粗提物中黄酮含量为0.309 8 mg/mg,总酚酸含量为58.59 mg/g。紫苏粗提物对α淀粉酶、黄嘌呤氧化酶、胰脂肪酶及乙酰胆碱酯酶的IC50值分别为0.273,0.244,0.347,0.018 mg/mL。芹菜素5-O-β-D葡萄糖苷、木犀草素7二葡萄糖苷酸、芹菜素7葡萄糖苷、山奈酚3-O芸香苷、迷迭香酸、芦丁等为紫苏粗提物的有效活性成分。结论：紫苏粗提物对4种酶都有一定的抑制活性,且呈剂量—效应关系。     

蔬菜中有机磷农药残留的两种酶抑制快速检测方法的比较研究

本实验比较了快速测定蔬菜中有机磷农残的两种酶抑制法即胆碱酯酶抑制法和植物酯酶抑制法，通过正交实验优化了两种酶抑制法的测定条件。对实际蔬菜样品的磷农残测定结果表明：这两种酶抑制快速测定方法均可用于蔬菜中有机磷农残的测定，其加标回收率都达到85％以上。但植物酯酶法测量精密度较好(3％以下)，酶源易得，提取、保存方便，在有机磷的快速测定中有更广泛的应用价值。