转基因作物外源转基因成分环介导等温扩增技术检测方法的建立及应用

 【目的】建立转基因作物外源转基因成分环介导等温扩增技术检测方法。【方法】以转基因作物中常用的花椰菜花叶病毒35S启动子（CaMV35S）为主要研究对象,利用环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）,针对CaMV35S基因的6个区域设计4种特异引物,利用1种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在65℃保温1 h,通过荧光显色即可完成对转基因作物鉴定工作。同时对7种转基因作物进行LAMP检测。【结果】该LAMP方法通过特异性检测含有CaMV35S启动子的转基因作物,其检测结果的特异性与常规PCR方法结果一致,灵敏度是常规PCR的10倍。【结论】转基因作物LAMP检测方法具有高度的特异性及稳定性,结果可靠,非常适合转基因作物的快速检测,有较好的应用价值。     

2016年青海省油菜籽转基因抽样调查

为了评估和监管青海省油菜转基因情况,2016年对省内互助、门源、乐都等11个市县的42批样品进行了检测。通过定性PCR,检测发现CruA内标准基因、CaMV 35S启动子、FMV 35S启动子、NOS终止子、HPT基因、NPTⅡ基因、Bar基因和PAT基因均为阴性,未发现转基因油菜籽。鉴于转基因作物违法滥重的问题严重性,对青海省转基因作物监管工作提出了相应建议。     

焦润菊(青海省乡镇企业技术推广站,青海西宁,810001)

为了评估和监管青海省油菜转基因情况,2016年对省内互助、门源、乐都等11个市县的42批样品进行了检测,通过定性PCR,检测发现CruA内标准基因、CaMV 35S启动子、FMV 35S启动子、NOS终止子、HPT基因、NPT II基因、Bar基因和PAT基因均为阴性,未发现转基因油菜籽。鉴于转基因作物违法滥重的问题严重性,笔者对青海省转基因作物监管工作提出三点建议。     

多重PCR分析方法应用于转基因农作物的检测

以转基因大豆、水稻等样品为材料,采用多重PCR技术对转基因作物中常见的启动子、终止子、筛选标记基因和转入的目的基因等多个外源转基因元件进行检测,以期建立一套快速、准确、高效的转基因农作物筛查鉴定技术。通过多重扩增实验,建立了关于转基因大豆检测的大豆内源Lectin基因,花椰菜花叶病毒(Cauliflower mosaic virus,CaMV)35S启动子和根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因NOS终止子的三重PCR分析体系,及关于转基因水稻检测的CaMV35S、NPTII和HPT基因的三重PCR分析的技术体系。并以大豆、水稻等农作物样品为检测材料,采用单一PCR和多重PCR技术同时进行检测,结果表明多重PCR方法具有快速、高效、简便、准确等特点,在转基因成分的检测上具有非常重要的实际应用价值和潜力。     

转基因大豆中外源基因的二重PCR检测

用CTAB法提取转基因大豆(Roundup Ready品系)的总DNA.根据行业标准SN/T 1195-2003,合成用于扩增花椰菜花叶病毒(Cauliflowerm osaic viru,s CaMV)35S启动子的引物S1和S2、根癌农杆菌(Agrobacterium tum efaciens)CP4菌株EPSPS基因的引物Ea、ER和Eb.应用这5条(2组)引物对转基因大豆进行二重PCR检测时,扩增得到2个新片段,分别与片段S1ER、S1Eb大小一致.将片段S1ER、S1Eb进行克隆并测序,序列已在GenBank上登录,接受号分别为AY592954和AY596948.序列分析结果表明,片段S1ER含有CaMV 35S启动子和矮牵牛叶绿体转运肽序列(CTP)的部分序列,片段S1Eb含有CaMV 35S启动子部分序列、CTP和CP4 EPSPS基因的部分序列,原用于扩增CP4 EPSPS基因的引物中,仅引物Eb位于CP4 EPSPS基因中.重新合成扩增CP4 EPSPS基因的引物E1和E2,建立的二重PCR方法不仅适合于转基因RoundupReady大豆,还适合于其它植物中的CaMV 35S启动子和CP4 EPSPS基因的同时检测.     

利用实时荧光PCR快速筛查玉米中转基因成分

玉米是拥有转基因转化体数量最多的作物,多样的转化体增加了玉米中转基因成分筛查的难度。为了建立玉米中转基因成分的快速筛查方法,利用Taqman探针实时荧光PCR方法,通过对玉米样品中CaMV35S启动子(P-35S)和NOS终止子(T-NOS)2个元件组合的检测,完成对现有玉米转化体的筛查。建立的Taqman探针实时荧光PCR方法灵敏度可达到0.1%,检测时间较普通PCR方法缩短1h以上。同时提出了转基因玉米转化体鉴定路线图。该筛查方法可对玉米中的转基因成分进行快速、高灵敏度的筛查。     

抗草甘膦转基因大豆PCR检测方法的建立与应用

 应用PCR检测方法 ,以大豆凝集素 (lectin)基因为内置标准 ,检测了抗草甘膦转基因大豆中的外源CaMV35S启动子、NOS终止子和CP4 EPSPS成分 ,并通过Southern杂交进一步证实了PCR检测结果的可靠性 ,建立了基于PCR的抗草甘膦转基因大豆检测方法 ,最低检测限度为 0 .0 5 %。用此方法检测转基因情况未知 ,分别来自欧盟、美国、阿根廷、未知国别的进口大豆及未知国别的进口豆粕 ,除从欧盟进口的大豆无CaMV35S启动子、NOS终止子、CP4 EPSPS基因成分外 ,其余样品均含有上述成分 ;而从国内非转基因大豆中未检出上述成分。用此方法检测抗草甘膦大豆京引D1×豫豆 12的F2 和F2∶5群体植株 ,PCR检测结果与大田施药 (草甘膦有效成分 1.0kg·ha-1)检测结果一致率分别达 10 0 %和 93.0 %。     

大豆及腐竹中转基因成分的多重PCR分析

采用CTAB法提取大豆干样、新鲜毛豆及腐竹中的总DNA,内源LECTIN基因扩增结果均为阳性,表明提取到的DNA中不存在抑制PCR的物质.应用花椰菜花叶病毒(Cauliflowermosaicvirus,CaMV)35S启动子和根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因(NOS)终止子的二重PCR分析,筛选到7个含转基因成分的样品.半嵌套式PCR检测结果表明阳性样品中的外源目的基因为来自根癌农杆菌CP4菌株的EPSPS基因.最后成功进行了扩增内源LECTIN基因、CaMV35S启动子和NOS终止子的三重PCR分析,以及内源LECTIN基因和EPSPS基因的二重PCR分析,得到预期结果.多重PCR方法具有快速、简便、准确等特点,在植物产品的转基因成分检测上具有重要的应用价值.     

大豆rbcS基因启动子的克隆及在转基因烟草中的功能缺失分析

【目的】进一步验证栽培大豆rbcS基因启动子功能,为植物基因工程相关研究提供启动子资源。【方法】从栽培大豆中克隆了rbcS基因5′端上游1 538bp的DNA序列,根据光诱导表达调控元件及顺式作用功能元件所在的位置,设计含1 089,712和190bp 3个5′端缺失体,并将rbcS基因启动子(1 538bp)及3个5′端系列缺失体序列分别与gus基因融合,构建植物表达载体并命名为pGmrbcS、pA、pB和pC,用农杆菌介导法转化烟草,通过gus基因活性变化检测不同缺失体的表达特性。【结果】克隆了1 538bp的大豆rbcS基因启动子序列及1 089,712和190bp的5′端缺失体启动子片段。GUS活性检测表明,在pGmrbcS转基因烟草的叶中GUS活性最高,且与pCAMBIA1301转基因烟草叶片中CaMV35S启动子驱使gus基因的表达量相当,而茎、根中GUS活性较低。GUS定量分析表明,T1代转基因烟草光下培养时,3种缺失体启动子叶片中的GUS表达活性均与CaMV35S启动子相当,其中pB活性最高,是CaMV35S启动子活性的1.4倍,pA、pC活性低于pB,分别为pB活性的84%和71%;含pA的转基因烟草于黑暗中萌发的幼苗叶片gus基因不表达,光下萌发幼苗叶片有gus基因表达,而含有pB、pC的转基因烟草,在黑暗和光下萌发的幼苗叶片中均有gus基因表达,且表达量以pB最高。【结论】含有长度为1 089bp(pA)光诱导元件的rbcS基因缺失体启动子具有光诱导和组织特异表达特性,长度为712bp(pB)的缺失体启动子的启动活性最高。     

转番木瓜环斑病毒复制酶基因番木瓜的多重定性检测

为监测和管理转基因番木瓜华农1号的商品化生产、销售,建立了相应的转基因定性检测方法.选用木瓜蛋白酶作为番木瓜的内源对照基因,建立对转基因番木瓜PRSV-Rep基因、外源CaMV35S启动子序列、NOS终止子序列和NPTⅡ基因的常规PCR检测体系.退火温度为40～60℃时,都分别扩增出了清晰的目的基因.单基因常规PCR检测转基因模板量的下限为5×10-7g.建立的三重PCR检测技术,检测了包括NPTⅡ、Rep和CaMV35S;NPTⅡ、Rep和Nos;NPTⅡ、Rep和Papain等3个组合.建立了NPTⅡ、ReP、CaMV35S和Nos4个基因的四重PCR检测技术.     

CaMV35S启动子驱动的FT基因调控杨树早期开花的初步研究

为了研究CaMV35S启动子驱动的FT基因对转基因杨树Populus早期开花的影响,利用Gateway技术构建了35S::FT基因表达载体,并对杨树进行了遗传转化,从转基因杨树花的发育、花器官变异等方面初步探讨了35S::FT促进杨树早期开花性能。结果表明:35S::FT转基因杨树分生组织属性的改变及初始花结构的形成发生于试管培养阶段;花开始发育后如不及时把开花植株继代培养或转至土壤温室培养,初始花结构会凋谢枯萎,不能继续发育。转基因植株花器官的分化与发育发生于温室培养阶段的3~5周内,能够分化出典型的花器官,但发育不完全,具雌雄蕊、花盘结构,无成熟苞片结构,雄蕊不能成熟发育。35S::FT诱导的花均为单朵花,而非野生型的柔荑花序;多数花属于单性花,但转基因雄性无性系中会出现两性花。转基因植株的开花率随着试管苗继代次数的增加而急剧下降,但两性花比例会上升。     

光诱导和组成型启动子控制柠檬酸合酶基因过量表达对转基因烟草耐铝性影响的比较

分别用光诱导型启动子(PrbcS)和组成型启动子(CaMV 35S)驱动柠檬酸合酶基因(cs)在转基因烟草中过量表达,比较转基因烟草中柠檬酸的含量和分泌量及其铝耐受性的变化.结果表明:诱导型转基因株系的CS酶活性是野生型的2.3～2.4倍,组成型转基因株系的酶活性是野生型的1.6～2倍;在30 μmol·L-1铝胁迫下,诱导型转基因植株的根相对伸长量是野生型的2.8～2.9倍,组成型的根相对伸长量是野生型的2～2.3倍;在无铝或300 μmo1·L-1铝胁迫下,转基因烟草叶片和根中柠檬酸含量均高于野生型,其中诱导型转基因植株叶片中柠檬酸含量高于组成型转基因植株,转基因烟草柠檬酸的分泌量分别是野生型的1.8～2.0倍和3.0～3.3倍;在有铝胁迫的珍珠岩基质上培养时,转基因烟草的生长情况好于野生型.这些结果证明,与CaMV 35S相比,采用PrbcS启动子控制cs基因的过量表达可更有效地增加转基因烟草中CS的酶活性及叶片中柠檬酸的合成量,同时也能更有效地提高转基因烟草柠檬酸的分泌量,从而增强其对铝毒害的抵御能力.     

含烟草几丁质酶基因的质粒pBG1121的构建及水稻转化

烟草几丁质酶基因已转入番茄、烟草等作物中，并得到了抗病基因植物，为了检验该基因转入水稻后，能否得到抗病的水稻，构建了适于水稻转化的质粒pGB1121。将烟草几丁质酶基因（TchiB）连上CaMV35S启动子和Nos终止区构建成融合基因，再将CaMV35S启动了／TchiB编码区／Nos终止区融合基因插入到双元载体pCAMBIA1301的多克隆酶切位点，得到一个13．9kb具有几丁质酶基因和潮霉素抗性基因的转化质粒pBG1121，进行酶切和PCR检验后，用共器介导法转化水稻，后代植株用潮霉素处理，经PCR检验，初步证实已将目的基因整合到受体植物的基因组中。     

转DREB1A基因提高烟草抗逆性的研究

将拟南芥(Arabidopsis thatiana)DREBIA基因分别在组成型启动子花椰菜病毒35S启动子和逆境诱导型启动子rd29A的驱动下转入烟草中,获得的两种转基因植株对干早和低温胁迫的抗性均显著提高,但对盐胁迫的杭性无明显变化.研究分析了组成型启动子和逆境诱导型启动子控制的DREBIA转基因植株在形态发育和抗...     

受MeJA诱导的烟草GTs基因启动子的克隆及转化

利用已克隆的1个受甲基茉莉酸(MeJA)诱导的糖基转移酶(GTs)基因,以PCR扩增得到该基因启动子序列,长度约为1.4kb,用改造后的双元载体pCAMBIA1301与GTs基因启动子连接,构建了含目的启动子与GUS基因的融合基因质粒pCAP-GUS.通过根癌农杆菌介导的烟草叶盘转化法转化烟草W38,经PCR检测验证得到了含有融合基因的转基因烟草植株,为进一步研究GTs基因的功能奠定了基础.     

豆粕中转基因成分检测方法的研究

从核酸和蛋白质两个角度对转基因豆粕及大豆原料进行了检测方法上的研究。设计并合成引物对转基因豆粕的内源基因lectin、CaMV35S启动子基因、NOS终止子和Cp4-epsps基因进行检测。应用ELISA的方法对不同含量的转基因蛋白及转基因豆粕进行检测,其检测的灵敏度可达到0.25%,但ELISA不适用于加工产品转基因成分的检测。Western杂交检测转基因豆粕及大豆,其检测极限达到0.5%。对于豆粕这样的加工产品,检测蛋白质及核酸两种方法结合使用,可使检测结果更为准确。     

烟草orf25基因植物表达载体的构建及遗传转化

为更好地研究烟草雄性不育的机理,构建orf25基因的植物表达载体。orf25基因是ATP合成酶F(0)部分的4个亚基因之一。以雄性不育烟草MS革新3号为受体材料,利用组成型启动子Ca MV35S构建orf25基因植物表达载体,将表达载体p BI121-orf25导入根癌农杆菌LBA4404。采用根癌农杆菌介导orf25基因遗传转化MS革新3号,结果证明载体上的目的基因orf25已整合到烟草基因组中,并获得了52株转p BI121-Ca MV35Sorf25基因烟草植株,经PCR鉴定,转基因阳性植株有14株,转化率为26.9%。为下一步研究该基因的功能及其与烟草雄性不育性的关系提供依据。     

过量表达cyp71av1和cpr基因提高青蒿中青蒿素的含量

青蒿素是从青蒿植株地上部分提取的一种含有过氧桥结构的倍半萜内酯,是目前最有效的治疗疟疾的药物。为了提高青蒿中青蒿素的含量,根据