siRNA特异沉默卵巢癌细胞CD59基因的裸鼠移植瘤研究

目的:通过体内动物实验研究CD59-siRNA对卵巢癌细胞CD59的沉默效应及抑瘤作用,探讨CD59在肿瘤免疫逃逸中的作用.方法:将转染CD59干扰质粒的A2780细胞(T组)、转染空质粒的A2780细胞(V组)及未转染的A2780细胞(C组)分别接种于裸鼠皮下,通过绘制肿瘤生长曲线,裸鼠移植瘤组织切片CD59 mRNA原位杂交及CD59蛋白的免疫组化研究其抑瘤效应及对CD59的沉默效应.结果:肿瘤生长曲线显示,与对照组相比,CD59干扰质粒转染组肿瘤生长明显受抑制(P<0.05).原位杂交及免疫组化结果表明,干扰组的CD59 mRNA及CD59蛋白与对照组相比显著降低(P<0.05).结论:裸鼠体内实验表明,特异性沉默CD59基因的siRNA表达载体可以明显抑制CD59的表达,增加了卵巢癌细胞对补体攻击的敏感性,从而抑制卵巢癌在体内的生长,进一步说明了CD59在肿瘤免疫逃逸中的作用.     

HOXB7 siRNA表达载体在裸鼠体内对人恶性黑色素瘤细胞株的影响

目的探讨转染同源盒第7基因(HOXB7)siRNA质粒表达载体对人恶性黑色素瘤细胞株A375在裸鼠体内生长的影响。方法裸鼠皮下接种人恶性黑色素瘤A375细胞,对2周后形成的瘤块进行分组干预。随机分为生理盐水对照组、阴性质粒组、HOXB7质粒组,观察转染后各组裸鼠移植瘤的生长情况;免疫组化法比较瘤体内微血管密度(MVD)。结果HOXB7质粒组的裸鼠移植瘤块生长慢、体积明显小于生理盐水对照组[(0.134±0.039)cm3比(1.006±0.235)cm3,P<0.05],而阴性质粒组瘤块体积大小与生理盐水对照组无统计学差异[(0.929±0.157)cm3比(1.006±0.235)cm3,P>0.05]。HOXB7质粒组裸鼠体内肿瘤MVD低于生理盐水对照组[(2.8±1.9)比(19.9±5.6),P<0.05],阴性质粒组与生理盐水对照组无统计学差异[(18.1±5.5)比(19.9±5.6),P>0.05]。结论针对HOXB7siRNA质粒表达载体可有效抑制A375细胞裸鼠体内肿瘤生长和瘤内血管生成。     

HOXB7 siRNA表达载体在裸鼠体内对人恶性黑色素瘤细胞株的影响

目的 探讨转染同源盒第7基因(HOXB7)siRNA质粒表达载体对人恶性黑色素瘤细胞株A375在裸鼠体内生长的影响.方法 裸鼠皮下接种人恶性黑色素瘤A375细胞,对2周后形成的瘤块进行分组干预.随机分为生理盐水对照组、阴性质粒组、HOXB7质粒组,观察转染后各组裸鼠移植瘤的生长情况;免疫组化法比较瘤体内微血管密度(MVD).结果 HOXB7质粒组的裸鼠移植瘤块生长慢、体积明显小于生理盐水对照组[(0.134±0.039)cm3比(1.006±0.235)cm3,P＜0.05],而阴性质粒组瘤块体积大小与生理盐水对照组无统计学差异[(0.929±0.157)cm3比(1.006±0.235)cm3,P＞0.05].HOXB7质粒组裸鼠体内肿瘤MVD低于生理盐水对照组[(2.8±1.9)比(19.9±5.6),P＜0.05],阴性质粒组与生理盐水对照组无统计学差异[(18.1±5.5)比(19.9±5.6),P＞0.05].结论 针对HOXB7 siRNA质粒表达载体可有效抑制A375细胞裸鼠体内肿瘤生长和瘤内血管生成.     

RNAi沉默 N-cadherin 表达对 EC9706细胞裸鼠移植瘤生长的影响

目的: 探讨RNAi沉默 N-cadherin 表达对人食管鳞状细胞癌EC9706细胞体内生物学行为的影响。方法: 通过逆转录病毒介导的RNAi技术将 N-cadherin 基因的RNA干扰载体pMSCVneo/N-cadherin质粒及对照质粒pEGFP-MSCVneo质粒分别转染至人食管癌细胞系EC9706,运用G418进行抗性克隆的筛选和扩增,进而得到稳定转染的人食管癌细胞系EC9706(分别命名为干扰载体组和空载体组),将正常对照组、空载体组和干扰载体组EC9706细胞通过皮下注射的方式接种于裸鼠背部肩胛区,比较各组裸鼠成瘤期、成瘤大小、瘤体终重量及终体积等情况。运用免疫组织化学方法和Western blotting方法检测3组裸鼠移植瘤组织中E-cadherin、N-cadherin和MMP-9蛋白的表达情况。TUNEL法检测3组裸鼠移植瘤组织中细胞的凋亡水平。结果: (1)与正常对照组和空载体组相比较,干扰载体组裸鼠移植瘤的生长速率、成瘤大小、瘤体终重量和终体积明显降低(P<0.05)。(2)与正常对照组和空载体组相比,干扰载体组裸鼠移植瘤组织中N-cadherin和MMP-9的蛋白表达均下调(P<0.05),而E-cadherin的蛋白表达则无明显变化(P>0.05)。(3)与正常对照组(51.55±4.68)和空载体组(54.17±5.26)相比,干扰载体组(106.81±6.47)裸鼠移植瘤组织中凋亡的阳性细胞数明显增加(P<0.05)。结论: RNAi沉默 N-cadherin 表达可明显抑制EC9706细胞裸鼠体内移植瘤的生长,其作用机制可能是通过下调MMP-9的表达,降低细胞对细胞外基质的降解能力,进而降低EC9706细胞的体内侵袭力。RNAi沉默 N-cadherin 表达具有体内抑制食管鳞状细胞癌细胞生长的作用。N-cadherin可望成为抗食管鳞状细胞癌治疗的潜在分子靶点。     

抑制EGF-1受体表达对人鼻咽癌裸鼠移植瘤生物学行为的影响

目的诱导IGF-I受体基因沉默的shRNA真核表达质粒的在体抗瘤效应,探讨RNA干扰IGF-I受体基因对裸鼠人鼻咽癌移植瘤的生物学行为的影响。方法将右侧背部接种人鼻咽癌CNE2细胞后,肿瘤直径达5～7mm的24只裸鼠随机分为3组:A组为IGF-1RmRNA特异性真核表达质粒(pshRNA1)治疗组,瘤体内多点注射pshRNA1;B组为pshRNA2质粒载体对照组,瘤体内多点注射阴性质粒载体pshRNA2(剂量同A组);C组为生理盐水对照组,瘤体内多点注射0.3ml生理盐水。从开始治疗后3周处死裸鼠,分离肿瘤,部分做共聚焦观察质粒转染情况,其余肿瘤组织观察肿瘤组织的病理变化和IGF-I受体蛋白在瘤体内的表达变化。结果所有裸鼠移植瘤接种成功,14d左右肿瘤直径达5～7mm。治疗裸鼠7d后,pshRNA1治疗组抑制率达67.21%,瘤体积明显小于阴性质粒组和生理盐水组(P<0.05),阴性质粒组与对照组无显著差异。pshRNA1治疗组移植瘤可见大片癌组织表达绿色荧光,其中仅少数细胞为IGF-IR阳性细胞。阴性质粒组癌组织也表达绿色荧光,但IGF-IR阳性细胞数明显多于pshRNA1治疗组(p<0.05),而生理盐水组的移植瘤未见绿色荧光。结论shRNA干扰IGF-I受体基因能在体内有效下调IGF-I受体蛋白的表达、抑制鼻咽癌裸鼠移植瘤的生长。     

多基因共沉默治疗人喉鳞癌裸鼠移植瘤

目的 探讨针对血管内皮生长因子(VEGF)、端粒酶逆转录酶(TERT)、Bcl-xl的3个短发夹状双链RNA(shRNA)的串联表达质粒对人喉鳞癌裸鼠移植瘤生长抑制作用及其机制.方法 构建串联表达3个shRNA的质粒pEGFP-shVEGF-shTERT-shBcl-xl.建立人喉鳞癌Hep-2细胞系荷瘤裸鼠模型.将该质粒转染入荷瘤裸鼠瘤体内,观察肿瘤生长情况.荧光定量即时PCR检测三种目的 基因的mRNA在肿瘤组织中的表达情况,Western blot法检测三种蛋白的表达,原位末端标记法(TUNEL法)检测肿瘤细胞凋亡,免疫组织化学sP法检测肿瘤组织微血管密度.结果 与治疗前比较,质粒pEGFP-shVEGF-shTERT-shBcl-xl注射裸鼠皮下移植瘤后,肿瘤生长明显受抑制,治疗后14 d抑瘤率达91.2%.三个目的 基因的mRNA及蛋白表达水平比治疗前均有显著下降.移植瘤组织内检测到大量凋亡细胞,凋亡指数为(60.34±5.32)%.治疗组微血管密度明显低于生理盐水对照组及阴性质粒处理组.结论 pEGFP-shVEGF-shTERT-shBcl-xl能高效特异性地同时抑制3个靶基因在人喉鳞癌Hep-2细胞中的表达,增强基因沉默的多样性,并显著的抑制移植瘤的生长,提示未来应用多基因共沉默治疗喉鳞癌可能具有广阔的前景.     

siRNA对VEGF蛋白表达的影响及对裸鼠移植肾癌的抑制作用

目的探讨siRNA沉默血管内皮生长因子（VEGF）基因对人肾癌裸鼠移植瘤VEGF蛋白的表达水平及生长抑制作用的影响。方法化学合成针对VEGF的siRNA序列,通过脂质体将VEGF-siRNA转染到ACHN细胞中,将转染VEGF-siRNA的ACHN细胞（A组）、转染空质粒的ACHN细胞（B组）及未转染的ACHN细胞（C组）分别接种于裸鼠背部皮下。在SPF环境中饲养裸鼠并观察各组裸鼠移植瘤的生长情况,每隔5d测定移植瘤体积大小（肿瘤的长轴L,短轴W,肿瘤体积V=1/2LW2）,绘制肿瘤生长曲线,采用免疫组化及Western blot法测定裸鼠移植瘤组织切片中VEGF蛋白的表达水平。结果 A组小鼠移植瘤成瘤及生长明显缓慢,移植瘤的体积和质量均低于B、C组,差异有统计学意义（P〈0.05）;移植瘤组织切片免疫组化及Western blot法检测结果提示：与B、C组相比,A组中VEGF蛋白表达量降低,差异有统计学意义（P〈0.05）;而B、C组间瘤体的体积重量及VEGF蛋白表达差异均无统计学意义（P〉0.05）。结论 VEGF在肾癌的发生、发展中起着重要作用,化学合成的VEGF-siRNA可特异性抑制肾癌细胞中VEGF的表达,抑制肿瘤的生长增殖。     

骨母细胞特异性因子2介导间充质干细胞调控瘢痕疙瘩样瘤体生长的研究

目的探讨骨母细胞特异性因子2(Periostin)调控瘢痕疙瘩间充质干细胞(KMLSCs)对体外及裸鼠体内瘢痕疙瘩样瘤体生长的影响。方法从瘢痕疙瘩中分离培养KMLSCs,设置实验Periostin干扰组、空载体组和未转染组,根据干预目的构建Periostin慢病毒载体并转染对应组细胞。利用Western Blot技术体外检测各组细胞Periostin、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和血管内皮生长因子(VEGF)的表达情况;制备丝素蛋白-壳聚糖支架复合体,与细胞共培养后,扫描电镜观察支架的结构、KMLSCs的生长情况。建立裸鼠皮下瘢痕疙瘩样瘤体移植模型,移植8周后取出瘤体,测量3组肿瘤体积,通过荧光共聚焦技术检测各组组织中Periostin、α-SMA、VEGF以及Western Blot技术评估Erk的表达情况。结果体外培养的3组KMLSCs中Periostin在空载体组和未转染组有表达,而干扰组则表达微弱;同时3组细胞均不表达α-SMA和VEGF。制备的支架复合体呈多孔结构,KMLSCs在复合体支架中生长良好;各分组瘤体移植模型在体内裸鼠皮下成活良好。干扰组中Periostin表达下调后,瘤体体积显著减小,同时α-SMA、VEGF、Erk表达减弱,差异有统计学意义(P 0. 05),并呈现一致性。结论 Periostin可能通过调控KMLSCs的功能,参与了模型中瘢痕疙瘩样肿块的生长。     

c-Met基因调控肺腺癌A549细胞放射敏感性

目的探讨上调和下调肺腺癌细胞株A549细胞中c-Met基因表达水平后,该细胞鼠移植瘤放射敏感性的变化情况。方法利用电穿孔法将c-Met siRNA和重组表达载体pc DNA3.1-c-Met分别转染入肺癌A549细胞后采用G418筛选得到稳定转染的肺癌细胞系。转染48 h后用RT-PCR法和Western blot法分别检测细胞中c-Met基因和蛋白表达水平,采用CCK-8法检测细胞增殖活性;克隆形成实验研究分别上调和下调c-Met基因表达水平对肺腺癌细胞株A549放射敏感性的影响;TUNEL法检测细胞凋亡影响,移植瘤实验检测基因沉默和激进c-Met基因表达水平并联合放射射线照射对肺腺癌细胞生长的抑制作用。结果 c-Met下调组中肺癌A549细胞内c-Met基因和蛋白表达水平明显降低,而上调组中的表达水平则得到了明显升高。c-Met下调组肺癌A549细胞放射敏感性升高,c-Met上调组肺癌A549细胞放射敏感性降低(P0.05)。下调组中肺癌A549细胞的增殖活性受到抑制而细胞凋亡率显著增加(P0.05),上调组肺癌细胞的增殖能力明显增强而细胞凋亡率明显降低(P0.05);下调组裸鼠移植瘤的平均体积明显小于对照组,而上调组裸鼠移植瘤的瘤体平均体积则显著大于对照组(P0.05)。结论基因沉默c-Met的基因表达水平能显著降低肺癌细胞的增殖活性,抑制人肺癌A549细胞裸鼠移植瘤的生长并明显提高移植瘤瘤体的放射敏感性。     

BCSG1-siRNA在乳腺癌裸鼠移植瘤的表达

目的 探讨小分子干扰RNA(siRNA)对人乳腺癌移植瘤组织中乳腺癌特异性基因BCSG1表达的抑制作用.方法 根据BCSG1的已知cDNA序列,设计并体外转录合成4条特异性siRNA,分别导入载体质粒中,用脂质体介导分别转染人乳腺癌细胞系MCF7细胞中,以无关序列转染和未转染的MCF7细胞为对照.将用上述4条特异性siRNA和无关序列转染后的细胞连同未转染的MCF7细胞(共6组细胞)注入裸鼠皮下,构建裸鼠乳腺癌移植瘤模型,分析肿瘤生长抑制情况.采用半定量逆转录聚合酶链反应和免疫组织化学SP法分别检测6组裸鼠移植瘤中BCSG1 mRNA和BCSG1蛋白的表达情况.3组人肿瘤组织(浸润性导管癌、癌旁乳腺导管增生组织和乳腺纤维腺瘤)同时用作对照.结果 BCSG1-siRNA转染的4组的抑瘤率均明显大于无关序列转染组及未转染对照组(P＜0.01);与无关序列转染组及未转染对照组相比,BCSG1-siRNA转染的4组肿瘤组织中BCSG1蛋白的表达明显减弱;未转染细胞对照组和无关序列转染组、人乳腺浸润性导管癌组均有大量BCSG1 mRNA阳性条带,而在BCSG1-siRNA转染的4组中,仅有少量BCSG1较弱的mRNA阳性条带,与未转染细胞对照组和无关序列转染组相比,差异均有统计学意义(P＜0.01).结论 BCSG1-siRNA能有效抑制肿瘤的生长,下调裸鼠乳腺癌组织中BCSG1蛋白及mRNA的表达.