维拉帕米对人晶状体上皮细胞整合素表达的抑制作用

目的研究钙通道阻滞剂维拉帕米对人晶状体上皮细胞（LECs）株SRA01/04整合素表达的影响。方法对人LECs株SRA01/04进行培养并传代,分别以0.02、0.04、0.08mmol/L的维拉帕米作用于SRA01/0424h,经流式细胞仪检测SRA01/04各整合素的阳性表达率。结果整合素α2、α3、α5、β1、β2在人LECs株SRA01/04中呈阳性表达,维拉帕米对其表达具有抑制作用,并随药物浓度的增加而逐渐增强（P〈0.05）。结论钙通道阻滞剂维拉帕米对LECs整合素的表达具有抑制作用,可能阻碍整合素介导的LECs黏附、移行和增生,有望成为防治后发性白内障的有效药物。     

泛素羧基末端水解酶L1在年龄相关性白内障晶状体上皮细胞中的表达及其抗氧化作用

背景 氧化损伤是年龄相关性白内障发生的主要原因,而泛素蛋白酶系统参与晶状体的分化发育,研究发现其关键酶泛素羧基末端水解酶L1( UCHL1)参与帕金森病和阿尔茨海默病等年龄相关性疾病的发生发展,且与氧化应激有关. 目的 研究UCHL1在年龄相关性白内障发病过程中的作用.方法 收集24例单纯年龄相关性白内障患者术后获得的晶状体囊膜(皮质性白内障12例、核性白内障12例)、5例正常人晶状体前囊膜上皮和人晶状体上皮细胞(LECs)系SRA01/04细胞,采用免疫荧光法检测UCHL1在各组人晶状体前囊膜上皮细胞中的表达情况.构建UCHL1真核表达质粒,鉴定后采用脂质体转染法转染SRA01/04细胞作为UCHL1过表达组,同时采用绿色荧光蛋白(GFP)真核表达质粒转染SRA01/04细胞作为GFP过表达组,使用梯度过氧化氢叔丁醇(TBHB)处理24h后,采用MTT法检测各组人LECs的活性变化.结果 免疫荧光检测表明,UCHL1在各组人LECs中均有表达,但在正常晶状体囊膜、皮质性白内障以及核性白内障晶状体囊膜上皮细胞表达量的总体差异有统计学意义(F=13.441,P=0.000).皮质性白内障组以及核性白内障组晶状体囊膜上皮细胞中UCHL1的表达量均低于正常晶状体组(P=0.000、0.000),但皮质性白内障组和核性白内障组之间UCHL1的表达量差异无统计学意义(P=0.164).Western blot鉴定结果表明,UCHL1真核表达质粒转染后可见SRA01/04细胞中UCHL1的强表达.MTT检测结果显示,0.3 mol/L TBHB处理24 h后,UCHL1过表达组细胞活性吸光度(A570/630)值与GFP过表达组比较有增高的趋势,而0.2、0.4、0.5 mol/LTBHP均导致SRA01/04细胞的耐受或者大量凋亡. 结论 UCHL1具有抗氧化作用,且可能在年龄相关性白内障的发生发展过程中起抑制作用.     

错配修复基因MSH3在人晶状体中的表达

目的　研究错配修复基因MSH3在人晶状体上皮细胞系SRA01/04、年龄相关性白内障（age-related cataract,ARC）患者晶状体组织以及24周人胎眼晶状体组织中的表达情况，探讨其与ARC形成的关系。方法　采用RT-PCR检测人晶状体上皮细胞系SRA01/04、ARC患者晶状体组织和健康人脐带（阳性对照）中MSH3基因的表达水平，免疫荧光检测24周人胎眼晶状体中MSH3蛋白的表达。结果　MSH3在晶状体上皮细胞系SRA01/04中高表达，在ARC患者晶状体组织中表达下调。MSH3在24周人胎眼晶状体纤维细胞、晶状体上皮细胞以及晶状体前囊组织中均有表达，且在晶状体上皮细胞中高表达。结论　MSH3在人胎眼晶状体组织和SRA01/04中高表达，而在ARC患者晶状体组织中表达下调，这种表达差异可能会影响DNA的错配修复过程，进而影响晶状体发育导致ARC的发生。     

老年性白内障患者circKMT2E表达变化及其对晶状体上皮细胞凋亡的影响

目的　探讨circKMT2E在老年性白内障（ARC）患者中的表达变化及其对晶状体上皮细胞凋亡的影响。方法　取10例在我院接受白内障手术的ARC患者晶状体前囊膜,另选取4例健康捐献者透明晶状体前囊膜作为对照。使用Trizol试剂从人晶状体前囊膜组织中提取总RNA。依次使用cutadapt软件、DCC软件(v0.4.4)、STAR软件 (v2.51 b)、CircBase数据库和circ2Trait数据库对所测得的环状RNA（circRNA）进行注释,筛选circRNA差异表达。将体外培养的SRA01-04细胞随机分组,其中,空白对照组:用正常培养液培养,不作特殊处理;miR-control组:转染miR-control无序序列;miR-34a组:转染miR-34a-5p mimics序列;miR-34a+control组:共转染miR-34a-5p mimics序列和pcDNA3.1-control空载体;miR-34a+HMGB1组:共转染miR-34a-5p mimics序列和pcDNA3.1-HMGB1质粒。采用实时荧光定量PCR与双荧光素酶报告基因检测基因表达情况。 通过流式细胞仪检测细胞凋亡率,Western blot检测蛋白表达。结果　经生物信息学分析显示,circKMT2E在ARC患者晶状体前囊膜组织中表达上调最为显著。双荧光素酶报告基因检测结果显示,转染miR-34a-5p后circKMT2E-WT报告基因的荧光素酶活性由1.000±0.023降低至0.502±0.057（P<0.05）;而circKMT2E-MUT报告基因的荧光素酶活性由1.005±0.018降低至0.989±0.053（P>0.05）。miR-34a组SRA01-04细胞凋亡率（23.59%±3.47%）较miR-control组（3.82%±0.41%）增高（P<0.05）,而miR-34a-HMGB1组SRA01-04细胞凋亡率（8.97%±1.20%）较miR-34a-control组（24.59%±4.33 %）降低（P<0.05）。miR-34a组SRA01-04细胞Cyt-C蛋白、Bax蛋白相对表达量较miR-control组均升高,同时Bcl-2蛋白相对表达量则降低（均为P<0.05）;miR-34a-HMGB1组SRA01-04细胞Cyt-C蛋白和Bax蛋白相对表达量较miR-34a-control组均降低,同时Bcl-2蛋白相对表达量较miR-34a-control组增加（均为P<0.05）。结论　circKMT2E可通过海绵吸附miR-34a-5p减弱其对下游靶点HMGB1的抑制作用,进而有效地阻止SRA01-04细胞凋亡,在一定程度起到延缓ARC发展的作用。     

Bax抑制因子1对紫外线B诱导下人晶状体上皮细胞凋亡的抑制作用

目的　探讨Bax抑制因子1（BI-1）对紫外线B（UVB）诱导下人晶状体上皮细胞凋亡的抑制作用。方法　取对数生长期的人晶状体上皮细胞（HLEC）系SRA01/04细胞,将BI-1过表达质粒及其空载质粒转染至SRA01/04细胞中,分别记为BI-1组、Vector组,另取不做任何处理的SRA01/04细胞作为blank组。转染48 h后,采用实时荧光定量PCR和Western blot检测转染后各组细胞中BI-1 mRNA和蛋白表达水平。而后再根据实验需要将细胞分为6组:（1）Control组,SRA01/04细胞不经任何处理;（2）UVB组,采用紫外线（2.0 W·cm^-2）处理SRA01/04细胞60 min;（3）Vector组,转染BI-1空载质粒的SRA01/04细胞;（4）BI-1组,转染BI-1过表达质粒的SRA01/04细胞;（5）Vector+UVB组,转染BI-1空载质粒的SRA01/04细胞,再经紫外线（2.0 W·cm^-2）照射60 min;（6）BI-1+UVB组,转染BI-1过表达质粒的SRA01/04细胞,再经紫外线（2.0 W·cm^-2）照射60 min。采用实时荧光定量PCR检测UVB照射后各组细胞中BI-1 mRNA表达水平,CCK-8法检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测各组细胞中活性氧（ROS）含量,荧光探针法检测细胞内质网内Ca²⁺浓度,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Western blot检测各组细胞中相关蛋白表达水平。结果　本研究中所培养的SRA01/04细胞在荧光显微镜下可观察到细胞内αA-晶状体蛋白呈红色荧光。随着UVB照射强度增加,SRA01/04细胞内BI-1 mRNA表达水平逐渐降低,本研究选择UVB照射强度为2.0 W·cm^-2进行后续的实验。与blank组或Vector组相比,BI-1组细胞中BI-1 mRNA和蛋白表达水平均显著上升,差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。与Control组比较,UVB组细胞增殖活性显著降低,细胞内ROS含量显著增加,细胞内质网内Ca²⁺浓度显著升高,细胞凋亡率显著升高,细胞内Cleaved-caspase-3、Bax蛋白表达水平显著上调,Bcl-2蛋白表达水平显著下调,细胞内GRP78、p-IRE1、p-JNK和Cleaved-caspase-12蛋白表达水平显著上调（均为P＜0.05）。BI-1+UVB组细胞增殖活性较UVB组显著增高,细胞内ROS含量较UVB组显著降低,细胞内质网内Ca²⁺浓度较UVB组显著下降;与UVB组比较,BI-1+UVB组细胞凋亡率显著下降,细胞内Cleaved-caspase-3、Bax蛋白表达水平显著下调,Bcl-2蛋白表达水平显著上调;BI-1+UVB组细胞内GRP78、p-IRE1、p-JNK和Cleaved-caspase-12蛋白表达水平较UVB组显著下调（均为P＜0.05）。结论　BI-1在UVB诱导的HLEC系SRA01/04细胞中表达显著下调,BI-1过表达可通过降低内质网内Ca²⁺浓度抑制内质网应激介导的IRE1-JNK信号通路的激活,进而抑制UVB诱导的SRA01/04细胞凋亡。     

转过氧化氢酶基因LECs对氧化损伤耐受性的实验研究

目的探讨转过氧化氢酶(CAT)基因晶状体上皮细胞(LECs)对氧化损伤耐受性的变化,为白内障的临床预防与治疗提供实验依据。方法应用稳定转染的方法构建CAT基因高表达LECsSRA01/04-CAT,测定CAT的活性。以SRA01/04和SRA01/04-CAT细胞为研究对象,使用过氧化氢(H2O2)为处理因素,MTT方法测定对SRA01/04和SRA01/04-CAT细胞的半数致死量(IC50);AnnexinV和碘化丙啶双染色分析H2O2诱导LECs凋亡作用。Western印迹方法分析凋亡过程中caspase-3的活化。结果成功构建CAT基因表达水平提高的SRA01/04-CAT细胞。SRA01/04-CAT细胞CAT的表达水平是SRA01/04细胞的3·5倍,SRA01/04-CAT细胞的CAT活性是SRA01/04细胞CAT活性的2·2倍。H2O2对SRA01/04细胞的IC50为32·24μmmol/L,对SRA01/04-CAT的IC50为85·32μmmol/L,转染CAT基因后SRA01/04-CAT对过氧化氢的耐受能力是SRA01/04的2·65倍。相同培养条件下H2O2诱导SRA01/04细胞凋亡率是SRA01/04-CAT细胞的2·1倍。H2O2诱导LECs凋亡的过程伴随caspase-3的激活,SRA01/04-CAT细胞caspase-3活化的时间比SRA01/04细胞晚,同一时刻上SRA01/04-CAT细胞caspase-3活化的强度比SRA01/04细胞弱。结论CAT基因可提高LECs对氧化损伤的耐受性,能够抑制活性氧诱导产生的细胞凋亡效应。CAT基因可能是一个较好的候选基因,用于白内障基因治疗。     

高糖对人晶状体上皮细胞沉默信号调节蛋白6（SIRT6）表达的影响

目的　观察高浓度葡萄糖对人晶状体上皮细胞(SRA01/04)活性及沉默信号调节蛋白6（SIRT6）表达的影响。方法　将SRA01/04细胞在不同葡萄糖浓度（5.5 mmol·L^-1、15.5 mmol·L^-1、25.5 mmol·L^-1、35.5 mmol·L^-1、45.5 mmol·L^-1、55.5 mmol·L^-1、75.5 mmol·L^-1）培养基中培养48 h后,用光镜观察SRA01/04细胞形态;CCK-8试剂盒检测各组细胞的活性;Western blot检测各组细胞SIRT6蛋白的表达水平。然后将SRA01/04细胞用55.5 mmol·L^-1葡萄糖干预,培养不同时间（0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h）后,Western blot检测不同时间SRA01/04细胞SIRT6蛋白表达水平。免疫荧光技术检测对照组（5.5 mmol·L^-1葡萄糖）和高糖组（55.5 mmol·L^-1葡萄糖）细胞的SIRT6蛋白表达情况。结果　随着葡萄糖浓度增加,SRA01/04细胞的数量逐渐降低。CCK-8检测结果显示,与5.5 mmol·L^-1葡萄糖组相比,随着葡萄糖浓度增加,SRA01/04细胞的活性逐渐降低,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。Western blot检测结果显示,SRA01/04细胞的SIRT6蛋白表达与葡萄糖呈浓度和时间依赖性,45.5 mmol·L^-1、55.5 mmol·L^-1、75.5 mmol·L^-1葡萄糖组与5.5 mmol·L^-1葡萄糖组比较,以及24 h组、48 h组和72 h组与0 h组比较,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。细胞免疫荧光结果显示,SRA01/04细胞中的SIRT6蛋白主要在细胞核表达,高糖组SRA01/04细胞中SIRT6蛋白表达较对照组显著降低（P<0.05),且高糖组细胞核出现明显的核固缩和核碎裂现象。结论　高浓度葡萄糖可以降低SRA01/04细胞的增殖活性,降低SIRT6蛋白的表达水平。     

PI3K抑制剂LY294002对人晶状体上皮细胞中S期激酶相关蛋白2表达的影响

目的探讨PI3K抑制剂LY294002对体外培养的人晶状体上皮细胞（LECs）增生和细胞周期S期激酶相关蛋白2（Skp2）表达的影响。方法 MTT比色法检测25μmol/L的LY294002处理人LECs细胞株SRA01/04后12h和24h细胞的增生情况;流式细胞仪检测LY294002作用24h后细胞周期的分布情况;Westernblot和real-timePCR法分别测定LY294002处理24h后细胞中Skp2及其mRNA的表达情况。结果 25μmol/L的LY294002作用于SRA01/04细胞0～24h,SRA01/04细胞的增生受抑制,且作用24h时对SRA01/04细胞的抑制作用最明显。LY294002组中处于G1期和S期的细胞占总细胞数的百分率分别为（66.15±2.63）%和（27.34±6.58）%,对照组为（56.73±1.35）%和（37.32±5.54）%,LY294002组细胞Skp2及其mRNA的表达量明显减少。结论 PI3K抑制剂LY294002可抑制人LECs的增生,使部分细胞停滞于细胞周期的G1期,LY294002抑制人LECs的增生可能与Skp2的表达下调有关。     

ILK siRNA对高浓度葡萄糖诱导的人LECs增生和上皮向间质转化的抑制作用

目的探讨整合素连接激酶（ILK）对高浓度葡萄糖诱导的人晶状体上皮细胞（LECs）增生和转化的作用。方法将体外培养的人LECs系SRA01/04细胞分别培养在含葡萄糖5.5mmol/L（正常对照组）和30.5mmol/L（高糖组）的培养液中,用RT-PCR检测培养0、6、24h后ILK mRNA的表达;用ILK siRNA脂质体转染细胞,转染6h后,加入2组培养液处理24h,检测ILK、细胞增生核抗原（PCNA）、LECs转化指标α-SMA和FN在mRNA水平的表达。结果高糖组培养6h和24h,SRA01/04细胞ILK mRNA是正常对照组的2.48倍和2.32倍（P〈0.01）,刺激后24h,SRA01/04细胞PCNA、α-SMA、FN的mRNA表达分别是正常对照组的1.75、1.96和1.75倍（P〈0.01）。ILK siRNA干扰后,正常对照组ILK的表达是非转染细胞的30%,高糖组转染细胞ILK mRNA水平（P〈0.01）是非转染细胞的21%（P〈0.01）,转染细胞PCNA、α-SMA和FN的表达分别是非转染细胞的29%、33%和39%（P〈0.01）。结论高浓度葡萄糖可诱导LECs增生、上皮向间质转化及ILK表达上调,抑制ILK的高表达能阻止这些过程。     

ALKBH5对紫外线诱导的晶状体上皮细胞氧化损伤模型中DNA损伤修复的影响

目的　探究N⁶-甲基腺苷（m⁶A）去甲基化酶ALKBH5对紫外线诱导的晶状体上皮细胞（LEC）氧化损伤模型中DNA损伤修复的影响。方法　运用qRT-PCR和免疫印迹实验检测年龄相关性白内障（ARC）患者和对照组晶状体前囊膜上皮细胞中ALKBH5的mRNA和蛋白的表达。通过紫外线B（UVB）构建晶状体上皮细胞株SRA01/04细胞氧化损伤模型和靶向ALKBH5设计小干扰RNA（siRNA）转染构建敲降模型,运用qRT-PCR和免疫印迹实验检测氧化损伤模型和敲降模型中ALKBH5的mRNA和蛋白表达。运用CCK-8法检测Control组、UVB组、UVB+siNC组和UVB+siALKBH5#3组中SRA01/04细胞活力变化。免疫荧光染色检测UVB+siNC组和UVB+siALKBH5#3组中15A3的荧光强度变化。运用qRT-PCR检测转染对照siNC组和转染siALKBH5#3组中11个DNA氧化损伤修复基因（ODRGs）的mRNA表达变化。结果　在ARC患者的晶状体前囊膜上皮细胞中,ALKBH5的mRNA和蛋白表达水平均显著升高。在UVB以时间梯度诱导SRA01/04的细胞氧化损伤模型中,ALKBH5的mRNA和蛋白表达水平均呈上升后下降趋势,其中UVB照射10 min后ALKBH5 mRNA和蛋白表达升高最为显著。ALKBH5敲降效率结果显示,与转染对照siNC组相比,转染靶向ALKBH5的siRNA后,ALKBH5的mRNA和蛋白表达均显著下降。CCK-8法检测结果显示,与UVB+siNC组相比,UVB+siALKBH5#3组SRA01/04细胞活力明显降低。免疫荧光染色检测结果显示,与UVB+siNC组相比,UVB+siALKBH5#3组SRA01/04细胞内DNA氧化损伤指标15A3染色显著增加。同时,与转染对照siNC组相比,转染ALKBH5#3组SRA01/04细胞的ODRGs中,TREX1、FANCD2、LIG1、MSH2、MSH3、RPA2、SMUG1、XRCC6 mRNA的表达均显著上升,DCLRE1A mRNA的表达显著下降,MGMT和MRE11A mRNA的表达则未见明显差异。结论　m⁶A去甲基化酶ALKBH5在UVB诱导的LEC氧化损伤模型中诱导性表达上升,敲降ALKBH5可促进LEC内大部分ODRGs表达升高,参与调控LEC内损伤DNA的修复,阻止ARC的发生。     

晚期糖基化终末产物受体（RAGE）在糖尿病性白内障和年龄相关性白内障患者前囊膜及人晶状体上皮细胞中的表达

目的　研究晚期糖基化终末产物受体（receptor of advanced glycation endproducts，RAGE）在糖尿病性白内障（diabetic cataract，DC）及年龄相关性白内障（age-related cataract，ARC）患者晶状体前囊膜和不同浓度高糖条件下培养的人晶状体上皮细胞（lens epithelial cells，LECs）中的表达。进一步探讨RAGE在DC患者晶状体前囊膜和人LECs中表达的变化及相互之间的关系。方法　收集DC及ARC患者的晶状体前囊膜，采用Western blot检测RAGE在前囊膜中的表达。ARC患者根据年龄分为:ARC1组（50~69岁）和ARC2组（70~89岁）。DC患者根据年龄及糖化血红蛋白（hemoglobin A1c，HbA1c）水平分为:DC1组（50~69岁，HbA1c为>7.0%~12.0%）、DC2组（50~69岁，HbA1c为4.0%~7.0%）、DC3组（70~89岁，HbA1c为>7.0%~12.0%）、DC4组（70~89岁，HbA1c为4.0%~7.0%）。将培养的人LECs根据培养液不同分为5组，A0组:采用DMEM 培养液；A1组:添加10 mmol·L^-1葡萄糖的培养液；A2组:添加20 mmol·L^-1葡萄糖的培养液；A3组:添加30 mmol·L^-1葡萄糖的培养液；A4组:添加30 mmol·L^-1甘露醇的培养液。Western blot检测以上各组中RAGE的表达，流式细胞仪检测以上各组人LECs凋亡率。结果　RAGE在前囊膜的表达程度:DC1组高于DC2组，DC3组高于DC4组，均高于相应年龄的ARC患者。体外实验中，RAGE在A1、A2、A3组中表达高于A0组，差异有统计学意义（P=0.001），也高于A4组，差异有统计学意义（P<0.001）；A1、A2、A3组人LECs凋亡率高于A0组，差异有统计学意义（P=0.002），也高于A4组，差异有统计学意义（P=0.002）；A1、A2、A3组人LECs凋亡率与培养液葡萄糖浓度呈正相关（r=0.892，P<0.001）。结论　RAGE在DC患者晶状体前囊膜的表达高于ARC患者，同等年龄下HbA1c水平越高RAGE表达越多；葡萄糖浓度越高，人LECs的RAGE表达越多，人LECs凋亡率越高。推测RAGE可能参与了白内障的形成，并加速了糖尿病患者的白内障进展。     

S期激酶相关蛋白2（SKP2）泛素化修饰OGG1对中波紫外线诱导的晶状体上皮细胞氧化损伤作用

目的　探索E3泛素连接酶S期激酶相关蛋白2（SKP2）介导的碱基切除修复蛋白8-氧代鸟嘌呤-DNA糖基化酶（OGG1）在年龄相关性白内障（ARC）发生过程中的泛素化降解机制。方法　采用免疫沉淀实验检测OGG1的泛素化修饰及其与SKP2的结合能力。采用中波紫外线（UVB）照射人晶状体上皮细胞株SRA01/04构建细胞氧化损伤模型。蛋白免疫印迹实验检测细胞氧化损伤模型和过表达模型细胞中SKP2的蛋白表达。通过转染SKP2质粒,增加SKP2的表达并观察细胞中OGG1蛋白的表达变化。结果　OGG1蛋白存在泛素化修饰。UbiBrowser软件预测能与OGG1结合的潜在E3泛素连接酶,并通过免疫沉淀实验证明SKP2与OGG1之间存在相互作用。在氧化损伤环境下,SRA01/04细胞中SKP2蛋白表达出现先下降后逐渐升高的趋势,其中UVB照射10 min时SKP2表达下降最为显著。对照组、转染空载质粒组和转染SKP2过表达质粒组SRA01/04细胞中SKP2蛋白的相对表达量分别为1.040±0.007、0.920±0.008和1.330±0.020,与转染空载质粒组相比,转染SKP2过表达质粒组细胞中SKP2蛋白的表达显著上调（P＜0.05）。空白对照组、UVB组、UVB+转染空载质粒组和UVB+转染SKP2过表达质粒组细胞中OGG1蛋白的相对表达量分别为1.05±0.01、5.05±0.16、5.20±0.07和3.83±0.10;与UVB+转染空载质粒组相比,UVB+转染SKP2过表达质粒组SRA01/04细胞中OGG1蛋白相对表达水平明显降低,且差异有统计学意义（P＜0.05）。结论　E3泛素连接酶SKP2能够促进OGG1发生泛素化降解,导致晶状体上皮细胞内部损伤性DNA的累积,从而导致ARC的发生发展。     

Wnt3a促进人晶状体上皮细胞增生及相关机制的研究

背景 晶状体上皮细胞(LECs)的异常增生是晶状体后囊膜混浊(PCO)的重要病理基础,以往研究证实Wnt3a信号可促进上皮细胞的增生,但其对LECs的作用机制尚不清楚. 目的 研究Wnt3a对人LECs增生的作用,探讨相关分子机制,为PCO的临床治疗提供新的靶点.方法 将人LECs系SRA01/04细胞进行培养后以4×105个/孔的密度接种于6孔板继续孵育.构建Wnt3a cDNA表达载体,采用脂质体介导转染技术将Wnt3a cDNA表达载体瞬时转染人SRA01/04细胞中,对照组转染pcDNA3-HA表达载体.采用Western blot技术验证载体在转染细胞中的表达;MTT法和流式细胞仪检测Wnt3a在SRA01/04细胞中的过表达对细胞增生能力的影响;Western blot法检测Wnt3a过表达对Wnt/β-catenin下游信号分子β-catenin、cyclin D1和c-myc蛋白表达的影响;应用免疫荧光法检测Wnt3a过表达后β-catenin表达的定位变化;采用免疫细胞化学法检测Wnt3a过表达后增生细胞核抗原(PCNA)蛋白表达的变化.结果 本研究成功构建了人Wnt3a基因的表达载体Wnt3a cDNA,获得Wnt3a过表达的Wnt3a/SRA01/04细胞及对照pcDNA3-HA/SRA01/04细胞.Western blot检测证实,与pcDNA3-HA/SRA01/04相比,Wnt3a/SRA01/04细胞内Wnt3a蛋白表达明显升高.MTT法检测表明,Wnt3a cDNA转染组SRA01/04细胞的增生率明显高于对照组(F分组=15.235,P=0.005;F时间=369.677,P=0.000),转染后各时间点2个组间SRA01/04细胞的增生率差异均有统计学意义(t=20.843,P=0.001;t=26.214,P＜0.01;t=25.177,P=0.001;t=35.516,P＜0.01;t=615.056,P＜0.01).细胞周期分析发现,Wnt3a cDNA转染组G1期细胞比例为51.74％,明显少于对照组的79.44％,而S期细胞的比例为36.23％,明显多于对照组的12.34％.Wnt3a cDNA转染组SRA01/04细胞PCNA蛋白表达阳性率为47.00％±7.58％,明显高于对照组的16.00％±3.61％,差异有统计学意义(t=8.256,P＜0.01).转染后48 h,β-catenin蛋白密集分布于Wnt3a/SRA01/04细胞核和细胞质中,而在对照组仅出现于细胞质之中.Wnt3a/SRA01/04细胞中Wnt3a蛋白表达水平上调,β-catenin细胞定位由细胞质转入细胞核;Wnt/β-catenin信号通路靶蛋白Cyclin D1和c-Myc蛋白表达上调. 结论 在SRA01/04细胞中,Wnt3a过表达使Wntβ-catenin信号通路活化,下游靶蛋白Cyclin D1和c-Myc表达上调,可促进人LECs的增生.     

POLH对过氧化氢诱导的晶状体上皮细胞氧化应激和凋亡的影响

目的　探究DNA聚合酶η（POLH）对过氧化氢（H₂O₂）诱导的晶状体上皮细胞氧化应激和凋亡的防御机制。方法　以年龄相关性白内障患者的晶状体前囊膜组织和H₂O₂处理的晶状体上皮细胞系SRA01/04为研究对象,分别通过RT-PCR和免疫印迹实验验证POLH的表达并筛选H₂O₂最佳作用浓度用于后续实验,将培养的SRA01/04细胞分为H₂O₂组、H₂O₂+HA组和H₂O₂+OV-POLH组,采用RT-PCR和免疫印迹实验检测POLH mRNA和蛋白表达情况,免疫荧光法检测DNA氧化损伤标志物以及TUNEL实验检测细胞凋亡变化,免疫印迹实验检测细胞中BAX、BCL-2、Nrf2和Keap1蛋白表达。结果　RT-PCR结果显示,与透明晶状体前囊膜（1.00±0.22）相比,年龄相关性白内障患者晶状体前囊膜组织中POLH mRNA相对表达量明显下降（0.38±0.62）（P<0.000 1）。RT-PCR和免疫印迹实验均显示,200 μmol·L^-1 H₂O₂处理的SRA01/04细胞中POLH表达量最低;TUNEL实验检测结果显示, 200 μmol·L^-1 H₂O₂处理后细胞的凋亡明显增加。RT-PCR和免疫印迹实验结果显示,与H₂O₂组和H₂O₂+HA组相比,H₂O₂+OV-POLH组SRA01/04细胞中POLH表达量显著升高（P<0.000 1）。免疫荧光染色结果显示,与H₂O₂+HA组相比,H₂O₂+OV-POLH组细胞的γH2A染色明显下降。免疫印迹实验检测结果显示,与H₂O₂组和H₂O₂+HA组相比,H₂O₂+OV-POLH组细胞促凋亡蛋白BAX表达量明显下降,而抑凋亡蛋白BCL-2表达量明显升高（均为P<0.01）;与H₂O₂组和H₂O₂+HA组相比,H₂O₂+OV-POLH组细胞Keap1蛋白水平明显下降,而转录调控蛋白Nrf2表达明显升高（均为P<0.01）。结论　过表达POLH可通过增强DNA损伤修复功能抑制H₂O₂诱导的晶状体上皮细胞凋亡,其抑制氧化应激机制可能与Nrf2-Keap1-ARE通路有关。     

人8-羟基鸟嘌呤糖苷酶1与年龄相关性白内障关系的临床研究

目的探讨与年龄相关性白内障（ARC）患者晶状体上皮细胞（LECs）中参与DNA损伤后碱基清除修复途径的氧化损伤修复基因—人8-羟基鸟嘌呤糖苷酶1（HOGG1）水平与ARC的关系。方法收集三种ARC（皮质性、核性、后囊下性）LECs样本,以透明晶状体LECs为对照组,用免疫组化、RT-PCR方法测定HOGG1在LECs的表达情况。结果对照组LECs中可见HOGG1的表达,三种ARC患者LECs中可见HOGG1表达较对照组增高（F=107.62,P〈0.01）,但三种ARC之间没有统计学差异。对照组与ARC组HOGG1均位于细胞质和细胞核。说明ARC LECs的细胞核和细胞质中HOGG1的表达量上调。结论 HOGG1表达上调参与ARC的发生发展。     

DNA氧化损伤修复基因ERCC6对过氧化氢诱导的氧化损伤的晶状体上皮细胞增殖和凋亡的影响

目的　探讨DNA氧化损伤修复基因ERCC6对过氧化氢（H₂O₂）诱导的氧化损伤的晶状体上皮细胞增殖和凋亡的影响。方法　采用不同浓度H₂O₂处理SRA01/04细胞,构建氧化损伤模型。取氧化损伤的SRA01/04细胞分为H₂O₂组、H₂O₂+空白质粒转染组和H₂O₂+pcDNA3.1-ERCC6质粒转染组进行转染处理。采用实时荧光定量PCR和免疫印迹实验检测转染后氧化损伤的SRA01/04细胞中ERCC6 mRNA和科凯恩综合征互补B蛋白（CSB）的表达变化。采用免疫印迹实验和EdU染色实验分别检测转染后各组SRA01/04细胞凋亡相关蛋白表达变化和细胞增殖能力。结果　当H₂O₂处理浓度为200 μmol·L^-1时, SRA01/04细胞ERCC6 mRNA和CSB蛋白的相对表达量最低,后续转染实验H₂O₂处理浓度均采用200 μmol·L^-1。与H₂O₂组和H₂O₂+空白质粒转染组相比,H₂O₂+pcDNA3.1-ERCC6质粒转染组SRA01/04细胞ERCC6 mRNA和蛋白表达水平均显著增高（均为P<0.05）。进一步实验发现,与另外两组相比,H₂O₂+pcDNA3.1-ERCC6质粒转染组SRA01/04细胞中的促凋亡蛋白Bax表达均明显降低,而抑制凋亡的蛋白Bcl-2表达则均明显增加（均为P<0.05）。EdU染色实验检测结果显示,与H₂O₂+空白质粒转染组相比,H₂O₂+pcDNA3.1-ERCC6质粒转染组SRA01/04细胞内绿色荧光亮度增高,阳性细胞数量增加,表明SRA01/04细胞的增殖能力增强。结论　ERCC6基因可能通过减弱DNA的核苷酸切除修复作用抑制氧化损伤的晶状体上皮细胞增殖、促进其凋亡从而导致老年性白内障的发生。     

circZNF292靶向miR-23b-3p/SIRT1轴调节人晶状体上皮细胞氧化应激损伤的机制分析

目的　探究circZNF292在调节人晶状体上皮细胞（LECs）氧化应激损伤中的作用及可能的分子机制。方法　收集单纯年龄相关性白内障（ARC）患眼的晶状体前囊膜组织（ARC组）和排除眼部疾病眼球捐献者的晶状体前囊膜组织（对照组）各3例,进行RNA提取及转录组学测序。应用qRT-PCR检测两组样本中circZNF292、miR-23b-3p和SIRT1 mRNA表达水平。利用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶活性来验证circZNF292、miR-23b-3p、SIRT1之间的靶向关系。体外培养人永生化LECs细胞系HLE-B3,分为空白对照组、NC siRNA组、circZNF292 siRNA组、NC inhibitor组、miR-23b inhibitor组、NC mimics组、miR-23b mimics组、circZNF292 siRNA+miR-23b inhibitor组。使用Lipo2000试剂转染,48 h后收获细胞。分别用MTT法、流式细胞术和荧光探针示踪法检测细胞活力、凋亡率及丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、活性氧（ROS）含量。结果　ARC组和对照组晶状体前囊膜组织样本之间鉴定得到469个下调circRNA和1231个上调circRNA,对前10位变化最明显的circRNA进行qRT-PCR验证,最终确定circZNF292在ARC组样本中下调最明显;且circZNF292与miR-23b-3p表达、miR-23b-3p与SIRT1 mRNA表达均呈负相关（r=-0.935,-0.951,均为P<0.05）。NC siRNA组和空白对照组细胞活力、细胞凋亡率及ROS、MDA、SOD、GSH-Px含量比较,差异均无统计学意义（均为P>0.05）。应用H₂O₂刺激后,与NC siRNA组相比,NC siRNA组+H₂O₂ HLE-B3细胞凋亡率及ROS、MDA含量均明显升高（均为P<0.05）,细胞活力及SOD、GSH-Px含量均明显降低（均为P<0.05）;而circZNF292 siRNA组+H₂O₂细胞凋亡率及ROS、MDA含量则较NC siRNA组+H₂O₂均进一步升高（均为P<0.05）,细胞活力及SOD、GSH-Px含量均进一步降低（均为P<0.05）。此外,circZNF292 siRNA+miR-23b inhibitor组上述指标较circZNF292 siRNA组则被逆转（均为P<0.05）。结论　circZNF292可通过miR-23b-3p/SIRT1轴调节人LECs氧化应激损伤,从而有望为ARC提供新的治疗靶标。     

EGR1对晶状体上皮细胞炎症反应及EMT的早期调控作用

目的：探究早期生长反应基因1（EGR1）对小鼠白内障术后晶状体上皮细胞（LECs）炎症反应以及上 皮-间质转化（EMT）的早期调控作用。方法：实验研究。选取10～16周龄EGR1敲除小鼠（EGR1-/-） 和野生型小鼠（WT）行白内障手术造模，于造模后0 h，3 h，24 h，48 h，72 h，4 d和5 d处死相应小 鼠并取眼球做冰冻切片。免疫荧光染色观察晶状体囊袋中EGR1蛋白、CD11b、LCN2、CXCL1和 αSMA的表达情况，Image J定量荧光强度。EGR1-/-小鼠和WT小鼠组间比较采用配对t检验，组内不 同时间点比较采用单因素方差分析。结果：WT小鼠白内障术后LECs中EGR1蛋白表达上调、炎症 反应指标CD11b、LCN2、CXCL1表达升高。EGR1-/-小鼠白内障术后LECs中EGR1蛋白表达无变化， CD11b、LCN2、CXCL1表达量明显小于WT小鼠（均P<0.01）。此外，EGR1-/-小鼠白内障术后EMT特 征性标记物αSMA的表达量、囊袋内有形细胞数量亦明显小于WT小鼠（72 h、4 d和5 d，均P<0.05）。 结论：白内障手术可早期激活LECs中的EGR1，激活的EGR1参与调控LECs的炎症反应和EMT，敲 除EGR1可以减轻上述炎症反应和EMT。     

PDGF-α受体沉默对人晶状体上皮细胞增殖及凋亡的影响

目的 研究血小板源性生长因子-α受体沉默对人晶状体上皮细胞增殖及凋亡的影响,为治疗后发性白内障提供实验依据.方法 体外培养人晶状体上皮细胞SRA01/04,用脂质体将合成的血小板源性生长因子-α受体反义寡核苷酸(PDGFR-αASODN)处理SRA01/04,MTT法检测细胞的增殖;流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡;Hoechst33258荧光染料染色法分析细胞凋亡;RT-PCR检测PDGF-α受体的表达.结果 PDGFR-αASODN作用于SRA01/04细胞24 h～72 h,SRA01/04细胞增殖受抑制,且72 h时对细胞的抑制作用最明显,与低浓度药物组比较,高浓度药物组对细胞的抑制作用增强(P＜0.05);实验组细胞凋亡率分别为(3.22±0.25)％、(5.29±0.27)％,与对照组(0.75±0.67)％和错义寡核苷酸组(1.46±0.60)％比较,差异有统计学意义(P＜0.05);实验组G1期细胞分布率分别为(53.31±1.30)％、(59.98±0.95)％,与对照组(47.73±1.18)％和错义寡核苷酸组(49.48±1.09)％比较,差异有统计学意义(P＜0.05);实验组PDGF-α受体在SRA01/04中表达下调.结论 PDGF-α受体沉默能抑制人晶状体上皮细胞的增殖,诱导其凋亡.     

急性氧化应激初期人晶状体上皮细胞株SRA01/04中衰老标记蛋白30抗氧化作用的研究

目的　初步探讨衰老标记蛋白30（senescence marker protein 30，SMP30）的增加对处于急性氧化应激初期的人晶状体上皮细胞株SRA01/04的保护作用。方法　将处于对数生长期的SRA01/04接种于96孔板，分别使用含150 μmol·L^-1、200 μmol·L^-1、250 μmol·L^-1、300 μmol·L^-1、350 μmol·L^-1、400 μmol·L^-1、450 μmol·L^-1 H₂O₂的培养基作用2 h，CCK-8法选取最佳H₂O₂浓度；使用慢病毒对SRA01/04进行转染建立SMP30高表达模型，实验分3组:SMP30过表达（over expression，OE）组、SMP30过表达相应空载（negative control over expression，NCOE）组及对照（control，CON）组。通过超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）定量检测试剂盒、氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione,GSSG）/总谷胱甘肽（total glutathione,T-GSH）测定试剂盒测量细胞内SOD活力及GSSG/T-GSH比值的变化。结果　经分析，建立模型的最佳H₂O₂浓度为300 μmol·L^-1。在此浓度下，与CON组（5.783±0.192）U·mg^-1及NCOE组（5.837±0.182）U·mg^-1相比，OE组细胞内SOD活力升高，为（10.251±0.110）U·mg^-1；与CON组（29.943±0.241）及NCOE组（30.037±0.433）相比，OE组细胞内GSSG/T-GSH比值（20.990±0.342）降低；差异均有统计学意义（均为P<0.05）。结论　当SRA01/04处于H₂O₂诱导的急性氧化应激初期时，SMP30表达的增加可通过增加SOD活力和降低GSSG/T-GSH比值，加强SRA01/04的抗氧化能力。