组织工程心脏瓣膜细胞生物学研究进展

由于现有的机械瓣和生物瓣仍存在种种不足,如不具备生长性、需抗凝、易感染、不能生长和自我修复等。组织工程心脏瓣膜是一新兴的研究领域,涉及多门学科。构建组织工程心脏瓣膜应包括支架的制作、细胞的种植、瓣膜的体外培养和最终移植入人体。其中种植的细胞是组织工程心脏瓣膜的基本要素。就组织工程心脏瓣膜的细胞生物学研究进展做一综述。     

组织工程心脏瓣膜细胞生物学研究进展

由于现有的机械瓣和生物瓣仍存在种种不足，如不具备生长性、需抗凝、易感染、不能生长和自我修复等。组织工程心脏瓣膜是一新兴的研究领域，涉及多门学科。构建组织工程心脏瓣膜应包括支架的制作、细胞的种植、瓣膜的体外培养和最终移植人人体。其中种植的细胞是组织工程心脏瓣膜的基本要素。就组织工程心脏瓣膜的细胞生物学研究进展做一综述。     

脂肪间充质干细胞分化为内皮细胞并体外构建组织工程心脏瓣膜

背景：组织工程心脏瓣膜是利用组织工程技术将种子细胞种植于瓣膜支架上所构建的一种人工瓣膜,目前国内外研究主要集中于种子细胞来源及支架选择上。 目的：探讨人脂肪间充质干细胞体外向内皮细胞诱导分化后的细胞作为种子细胞,脱细胞猪主动脉瓣膜作为支架体外构建组织工程心脏瓣膜的可行性。 方法：利用吸脂术采集脂肪组织,分离、培养脂肪间充质干细胞,流式细胞仪鉴定细胞表型;免疫细胞化学方法及RT-PCR检测细胞分化标志物;应用Triton X-100联合胰蛋白酶的方法制备脱细胞猪主动脉瓣支架,将体外培养扩增的诱导分化后的内皮细胞种植于支架上构建组织工程心脏瓣膜,光镜及电镜下观察组织工程心脏瓣膜的组织学结构。 结果与结论：脂肪组织分离培养的脂肪间充质干细胞向内皮细胞诱导分化后表达CD31、CD34、CD144、Ⅷ因子和内皮型一氧化氮合成酶等内皮细胞特异性抗原;脱细胞猪主动脉瓣膜支架脱细胞完全,弹力纤维及胶原纤维保持完整;构建的组织工程心脏瓣膜可见支架上排列连续的单细胞层。提示脂肪间充质干细胞在体外向内皮细胞诱导分化后已初步具有内皮细胞功能,在脱细胞猪主动脉瓣膜支架上生长良好,可以在体外初步构建组织工程心脏瓣膜。     

组织工程心脏瓣膜的构建：现状与前景

背景：目前临床上应用的心脏生物瓣和机械瓣都存在一些缺陷和不足,而组织工程心脏瓣膜有可能避免这些问题的出现,成为瓣膜替代物的理想选择。 目的：探讨构建组织工程心脏瓣膜的实验研究进展。 方法：应用数据库检索的方法分析关于组织工程心脏瓣膜的实验研究文献,组织工程心脏瓣膜的三大要素为种子细胞、支架材料和细胞种植。 结果与结论：心脏瓣膜修复和置换是目前治疗心脏瓣膜性疾病的主要外科手段。目前,主要用于构建组织工程心脏瓣膜的种子细胞有血管内皮细胞、内皮祖细胞以及骨髓间充质干细胞等。经脱细胞处理的支架具有良好的生物力学性能和组织相容性,细胞种植后支架表面会形成一层连续的细胞层,其构建的组织工程心脏瓣膜是可行的。组织工程心脏瓣膜有着良好的应用前景,但目前还有很多问题需要解决,还处于研究的初级阶段。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程全文链接：     

组织工程心脏瓣膜种子细胞:来源及应用

背景:应用机械瓣和生物瓣行瓣膜置换是治疗终末期瓣膜病的有效手段,然而他们的临床应用受到多个因素的限制。具备生物活性的组织工程心脏瓣膜有潜力克服机械瓣和生物瓣的不足,选择适宜的种子细胞是组织工程心脏瓣膜研究的一个重要方面,许多成熟的体细胞和干细胞已被用于构建组织工程心脏瓣膜,然而尚未获得理想的结果。目的:以构成瓣膜的细胞成分为基础,对用于构建组织工程心脏瓣膜的种子细胞、体外细胞种植方法的研究进行综述。方法:由第一作者基于PubMed数据库和万方数据库应用计算机检索2000年1月至2012年12月相关的文章,英文检索词为"Tissue engineering,Heart valves,Cell",中文检索词为"组织工程,心脏瓣膜,细胞",优选文章内容与组织工程心脏瓣膜种子细胞直接相关,具备针对性和权威性,发表在权威杂志的文章共39篇进行综述。结果与结论:瓣膜的细胞成分主要是内皮细胞和间质细胞,早期人们常用内皮细胞和成纤维细胞构建组织工程瓣膜,随着干细胞研究的深入,应用搏动性生物反应器种植间充质干细胞具有构建的组织工程瓣膜的潜力。     

组织工程化心脏瓣膜的研究进展

心脏瓣膜置换术是外科治疗瓣膜性心脏病的主要方法，但目前临床应用的人工瓣膜的远期效果尚不满意。近年来，随着组织工程学技术的进展，利用培养的自身组织细胞种植于支架材料表面，体外重新构建理想的心脏瓣膜植物日益成为研究热点。本文简述了心脏瓣膜工程的定义，细胞支架材料的选择，种子细胞的培养、种植方法以及组织工程化心脏瓣膜的评估，并指出下一步研究中尚需解决的问题。     

组织工程心脏瓣膜的研究进展

组织工程心脏瓣膜(tissue engineering heart valve,TEHV)理论上能克服机械瓣及生物瓣的不足,具有广阔的发展前景.目前组织工程心脏瓣膜的研究主要集中在瓣膜支架材料的选取及制备、种子细胞的选择和种子细胞的种植及培养等三方面.本文将分别就这三方面研究进展进行介绍,分析目前存在的问题,并对其应用进行展望.     

骨髓间充质干细胞联合可降解支架体外构建组织工程带瓣静脉（英文）

背景:临床上治疗慢性静脉功能不全的主要方法是静脉瓣膜修复及带瓣静脉段移植,但这些方法创伤较大,且带瓣静脉来源有限。组织工程学和再生医学在修复病变血管方面取得的进步,而以自体来源的内皮细胞为种子细胞的组织工程带瓣静脉也见于了报道,但存在排出反应。目的:构建一个有可自我更新、修复、类似天然瓣膜结构并具有功能的带瓣静脉。方法:麻醉取Beagle犬的骨髓获取骨髓间充质干细胞,采用密度梯度离心和贴壁法获取骨髓间充质干细胞,并进行细胞的传代、冻存复苏、流式细胞仪检测和定向诱导分化。采用热致相分离技术,以聚(乳酸-乙醇酸)共聚物为基材,利用自制带瓣静脉模具制备三维组织工程带瓣静脉支架,制备组织工程带瓣静脉支架,并研究其形态结构。将骨髓间充质干细胞种植在支架上构建可降解的带瓣静脉,在体外培养2周。结果与结论:扫描电镜观察显示支架孔隙率高。培养的细胞符合骨髓间充质干细胞的形态特征,培养的细胞大部分表达CD29和CD44,不表达CD34和CD45。细胞毒性实验显示支架无毒性,有利于细胞增殖和迁移。将细胞种植在支架表面上培养后可形成单层细胞层。体外实验验证细胞支架复合物的瓣膜有一定的开闭功能。利用三维聚(乳酸-乙醇酸)共聚物支架和骨髓间充质干细胞可成功构建组织工程带瓣静脉,组织工程带瓣静脉将有可能作为静脉瓣膜的的替代物治疗静脉瓣膜疾病。     

经液氮保存具有活性的同种生物瓣脱细胞支架的制备

目的为体外构建组织工程瓣提供脱细胞的同种生物瓣支架材料,并建立相应的技术方法。方法选取经液氮保存、具有活性的同种生物带瓣管道作为实验材料,用含十二烷基硫酸钠(SDS)的Tris低渗缓冲液脱去同种带瓣管道存在的细胞;固定剂固定后,分别行HE染色、胶原纤维和弹力纤维染色的光镜和扫描电镜观察、摄片。结果用质量浓度为0.03%SDS的Tris低渗缓冲液与同种瓣膜共同孵育48h,完全脱去了表面的内皮细胞(ECs),又较完整地保留了胶原纤维和弹力纤维等细胞外基质主要成分,其形态学结构在脱细胞前后无明显改变;瓣叶中心部位有部分成纤维细胞存留。而对于脱主动脉壁细胞,质量浓度为0.1%SDS更合适。结论质量浓度为0.03%～0.1%SDS的低渗缓冲液对制备脱细胞的同种生物瓣支架效果较佳,有利于同种瓣再内皮化时种植细胞的粘附和扩增,可进一步应用于组织工程瓣体外构建的研究。     

一种新型抗钙化处理的人工生物瓣膜流体力学性能

目的 评价一种新型生物瓣膜的体外流体力学性能,并与传统生物瓣膜及机械瓣膜进行比较.方法 将测试瓣膜分成三组:新型生物瓣组(GA SOB处理牛心包瓣),传统生物瓣组(单纯GA处理牛心包瓣),机械瓣组(双叶瓣),每组分别选21号、25号、29号三种型号,采用清华大学TH-1200脉动流测试仪,按照ISO5840瓣膜检测标准进行流体性能检测,包括跨瓣压差、返流量、返流百分比及有效开口面积,并进行组间的分析、比较.结果 新型生物瓣膜的前向流跨瓣压差较传统生物瓣小17%～30%,较机械瓣小23%～50%;新型生物瓣的有效开口面积较传统生物瓣和机械瓣分别大13%～37%和36%～50%;新型生物瓣的返流量较传统生物瓣大1.2～2.0 mL,约3%～6%;较机械瓣小0.9～2.8mL,约1.3%～5%.结论 新型人工生物瓣膜具有良好的血流动力学性能.     

海藻糖保护同种带瓣大动脉的最适浓度

背景：目前液氮低温保护组织和器官技术已经非常成熟,但其保护剂一直以来争论不一。 目的：观察不同冷冻保护剂对液氮深低温冻存同种带瓣大动脉组织细胞凋亡和代谢的影响,寻求最佳的冷冻保护剂及冷冻保护剂的最适浓度。 方法：取新西兰大白兔带瓣主动脉、肺动脉标本,将其在液氮中冻存12,15,18个月,冻存液分别使用0.1 mol/L二甲基亚砜,0.1 mol/L海藻糖,0.1 mol/L海藻糖+0.1 mol/L二甲基亚砜,0.2 mol/L海藻糖+0.1 mol/L二甲基亚砜,0.3 mol/L海藻      糖+0.1 mol/L二甲基亚砜。标本复温后,免疫组织化学方法检测标本的细胞凋亡情况,葡萄糖消耗量测定法检测组织细胞的代谢水平。 结果与结论：免疫组织化学和葡萄糖消耗量测定结果均显示经0.1 mol/L海藻糖+0.1 mol/L二甲基亚砜,0.2 mol/L海藻糖+  0.1 mol/L二甲基亚砜冻存液处理的标本冻存效果最好,其次是经0.3 mol/L海藻糖+0.1 mol/L二甲基亚砜处理和经0.1 mol/L海藻糖单独处理的标本,单独使用0.1 mol/L二甲基亚砜处理的标本冻存效果最差。说明海藻糖对液氮深低温保存同种带瓣大动脉活性有很好的保护作用,单独使用海藻糖优于单独使用二甲基亚砜,联合应用海藻糖和二甲基亚砜效果更好,且联合应用的海藻糖最佳浓度范围是0.10~0.20 mol/L。     

Observations on Cardiac Output in Animal Experiments and Clinical Application of Jiuling Bileaflet Mechanical Valve Prosthesis

Objective:To observe the cardiac output(CO)in animals and patients undergone valve replacement with Jiuling bileaflet mechanical valve prosthesis.Methods: 1.Animal experiments:6 sheep that subjected to mitral replacement with a 21-mm-valve prosthesis were measured by open cardiac catheterization intraoperatively. Echocardiographic and open cardiac catheterization under dobutamine stress were performed on 2 sheep survival for 30 months post-operation.2.Patient measurements:CO of 14 cases of aortic valve and 10 cases of mitral valve was measured by open cardiac catheterization,and after 12 months,it was measured by echocardiography.Results:1. Animal experiments:The mean CO of 6 sheep was 2.5 L/min intraoperatively by catheterization,and that of 2 sheep survival for 30 months post-implant was 3.0 L/min by echocardiography and 2.9 L/min by catheterization,respectively.2.Patient measurements: The mean cardiac index of 4 patients with 21 mm valve replacement was(2.55±0.27) L/min/m2by catheterization,and was(2.84±0.13)L/min/m2 by echocardiography after 12 months.Conclusion:This study demonstrates that cardiac function on animals and patients return to normal activity after undergone the valve replacement,and the newly valve prosthesis shows excellent hemodynamic performance.     

Improved chamber for the isolation of anaerobic microorganisms.

A small portable chamber for the recovery of anaerobic bacteria is described. This rigid chamber is constructed of clear acrylic with dimensions of 30 inches (ca. 76.2 cm) wide, 18 inches (ca. 44.7 cm) deep, and 18 inches (ca. 44.7 cm) high. Conventional bacteriological techniques can be used inside the chamber to efficiently isolate strict anaerobic organisms. An adapter allows the attachment of a standard anaerobic jar to the outside of the chamber. The jar can be used to store reduced media. Once the jar is attached to the chamber and the media is removed to the interior of the chamber, the jar is available to receive inoculated media. The anaerobic jar can then be removed from the chamber, without contaminating the jar or chamber with oxygen, and be placed in a conventional 37degreesC incubator. This chamber also allows the microbiologist to process cultures without wearing gloves as was necessary with previous anaerobic chambers. Air-tight latex rubber sleeves seal around the microbiologists arms and to the armport flange of the chamber to prevent the introduction of oxygen into the chamber. Anaerobic conditions are maintained by circulating a 80% N2, 10% H2, 10% CO2 gas mixture through alumina pellets coated with palladium. This study indicates that anaerobic conditions obtained in this chamber are sufficient for recovery of obligate anaerobes.     

Evaluation of the matrix-synthesis potential of crosslinked hyaluronan gels for tissue engineering of aortic heart valves

Our goal is to fabricate continuous sheets of elastin atop non-biodegradable hydrogels (hylans) containing crosslinked hyaluronan, a glycosaminoglycan. Such elastin-hyaluronan composites may be useful to tissue engineer replacements for the glycosaminoglycan- and elastin-rich layers of the native aortic valve cusp. Neonatal rat aortic smooth muscle cells were cultured atop hylan gels with micro-textured surfaces, and on plastic, and the components of the extracellular matrix (collagen, elastin) were periodically analyzed. The hylan substrates induced the cells to proliferate more rapidly and over longer time periods (approximately 4 weeks) relative to those cultured on plastic (2-3 weeks). Consequently, at all assay times, the amounts of elastin was derived from the hylan-based cell cultures was 25% or more than that derived from cells cultured on plastic. However, when elastin content was normalized to the cell DNA content, no significant differences were found in the two substrates beyond the first two weeks of culture. Conversely, at culture times greater than 2 weeks, cells cultured atop hylan gels produced amounts of collagen/nanogram of DNA that were approximately 56% less than that synthesized by cells cultured on plastic. Cells grown on hylan deposited an unusual matrix layer, rich in elastin, at the hylan-cell interface. This elastin was found to be organized into fenestrated sheets and loose elastin fibers, structures that were also isolated from the elastin matrix of the ventricularis layer of porcine aortic valve cusps. We have thus demonstrated that hylan gels are useful as substrates to induce elastin synthesis in culture to obtain structures that resemble the elastin matrix of the native aortic valve.     

孕酮对氧糖剥夺损伤的PC12细胞的保护作用

目的: 观察孕酮(PROG)对氧糖剥夺(OGD)PC12细胞活力及葡萄糖转运蛋白3(GLUT3)表达的影响,在培养细胞证明孕酮抗缺氧缺血损伤的神经保护作用。方法: 神经生长因子诱导分化良好的PC12细胞,随机分为3组:(1)正常对照组:常规培养,不进行OGD处理;(2)OGD组:无糖培养基、低氧环境(95%N₂和5%CO₂持续通气)进行OGD 30 min处理,然后复氧复糖培养24 h;(3)PROG +OGD组:培养液含终浓度为10 nmol/L 孕酮,余同OGD组。WST-8法检测各组PC12细胞的活力;检测培养液中乳酸脱氢酶(LDH)的活性,判断细胞损伤的程度;反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测PC12细胞GLUT1 mRNA和GLUT3 mRNA表达;Western blotting法检测PC12细胞GLUT3蛋白表达。结果: 孕酮可以减轻OGD引起的PC12细胞肿胀,降低LDH漏出,减轻细胞损伤,显著增加OGD组PC12细胞的活力(P<0.01)。RT-PCR显示PROG +OGD组GLUT3 mRNA的表达明显高于OGD组(P<0.05),Western blotting显示PROG +OGD组GLUT3蛋白的表达显著高于OGD组(P<0.01)。结论: 孕酮对体外培养OGD损伤的PC12细胞具有保护作用,其机制可能与上调GLUT3蛋白的表达有关。     

Observation and quantification of cavitation on a mechanical heart valve with an electro-hydraulic total artificial heart

In previous studies, we investigated the cavitation phenomenon in a mechanical heart valve using an electro-hydraulic total artificial heart. With this system, a 50% glycerin solution kept at 37 degrees C was used as the working fluid. We reported that most of the cavitation bubbles were observed near the valve stop and were caused by the squeeze flow. However, in these studies, the effect of the partial pressure of CO(2) on the mechanical heart valve cavitation was neglected. In this study, in order to investigate the effect of the partial pressure of CO(2) on mechanical heart valve cavitation using an electro-hydraulic total artificial heart, we controlled the partial pressure of the CO(2) in vitro. A 25-mm Medtronic Hall valve was installed in the mitral position of an electro-hydraulic total artificial heart. In order to quantify the mechanical heart valve cavitation, we used a high-speed camera. Even though cavitation intensity slightly increased with increases in the PCO(2) at heart rates of 60, 70 and 100 bpm, throughout the experiment, there was no significant difference between the PCO(2) and cavitation intensity.     

人工心瓣在脉动循环模拟系统上的能量损耗的研究

本文对常用的不同尺寸的５种人工心瓣在脉循环系统的主动脉瓣位，在不同的心率，心输邮量和主动脉平均压下进行能量损耗（Ｅｎｅｒｇｙｌｏｓｓｅｓ）的评价。人工心瓣的能量损耗据所计录的左心室压，主动脉压，前反向的跨瓣流量而计算。结果表明，跨瓣压关（ΔＰ）主输量（ＣＯ）的增加而增加，随心率（ＨＲ）和心瓣尺寸（ＶＳ）的增加而减小；跨瓣反流量（Ｒｅｇ）随ＶＳ的增加而增加，且除笼球瓣外，Ｒｅｇ随ＣＯ的增加而减少；主     

心室流腔角度对主动脉瓣影响的脉动流实验研究

目的探究左心室流腔与主动脉轴线所呈角度对主动脉瓣力学性能的影响。方法依据从华中科技大学同济医学院附属协和医院获得的患者CT图像上的心室流腔角度大小,通过3D打印技术制作心室流腔角度分别为0°、16.5°和30°的3组主动脉根部模型。然后将人工生物瓣安装在主动脉根部模型上,在Vivitro心脏-血管模拟实验系统中进行不同心输出量条件下的脉动流实验。心率设定为70次/min,脉动流流动速率分别为2、3、4、5、6、7 L/min的条件下,测试瓣膜的跨膜压差、反流比和有效开口面积。在每个脉动流流动速率条件下测试10次,取平均值。结果不同心室流腔角度模型之间,生物瓣的跨膜压差存在差异但均符合国家标准GB 12279—2008/ISO 5840:1996,即小于10 mmHg(1 mmHg=0.133 k Pa)。对于心输出量较低的情况,较小的心室流腔角度有助于反流比的下降,较大的心室流腔角度有助于增大瓣膜的有效开口面积;而对于心输出量较高的情况,较小的心室流腔角度有利于瓣膜有效开口面积的增大。结论手术时,医生可根据患者的各项参数大小选择合适的心室流腔角度。     

Novel pulse duplicating bioreactor system for tissue-engineered vascular construct

Cell culture in a biomimetic environment is known to improve the mechanical endurance of tissue-engineered cardiovascular components. Our goal was to generate a bioreactor that can reproduce a wide range of pulsatile flows with a completely physiological pressure profile. The morphology and biochemical properties of tissue-engineered products were also studied to test the usefulness of this novel bioreactor. The combination of an outflow valve, compliance chamber, and resistant clamps together with a balloon pumping system was able to successfully reproduce both physiological systolic and diastolic pressures. The compliance chamber was especially effective in transforming the original peaky pressure waveform into a physiological pressure profile. The tissues, cultured under a physiological pressure waveform with pulsatile flow, presented widely distributed cells in close contact with each other. They also showed significantly higher cell numbers, total protein content, and proteoglycan-glycosaminoglycan content than cultured tissues under a peaky pressure wave or under static conditions. This new bioreactor system is suitable for evaluating a favorable environment for tissue-engineered cardiovascular components.     

体外培养人视网膜微血管内皮细胞屏障功能的研究

目的： 研究原代培养的人视网膜微血管内皮细胞屏障功能。方法: 对人视网膜微血管内皮细胞进行原代培养并鉴定,第4代细胞接种于Polyester(PET)膜上,不同时点对滤膜表面行显微镜观察,通过紧密连接相关蛋白occludin的表达,间接反映细胞之间紧密连接的形成,应用共聚焦免疫显微镜观察2、3、4周occludin表达的变化;跨膜电阻（TER）检测屏障的稳定性,并通过测量正常培养条件和5 μg/L的血管内皮生长因子（VEGF）干预下辣根过氧化物酶(HRP)通透性的改变反映屏障特性。结果: 成功培养了人视网膜微血管内皮细胞,纯度可达95.8%。细胞接种1周后融合为单层,接种后2、3、4周细胞密度无明显变化,细胞接触紧密,呈单层生长,可见occludin在细胞相邻边界规则的表达;occludin在2、3、4周,在细胞内的分布逐渐移向相邻细胞交界处;2周时视网膜微血管内皮细胞跨上皮细胞电阻达（120.62±3.97）Ω/cm2,2、3、4周差异无显著（P>0.05）;单层细胞的通透性检测结果显示,HRP从滤膜上方到达下方随时间延长呈线性增加,且在VEGF的干预下,各时点通透率明显增加（P<0.05）。结论: 利用体外培养的人原代视网膜微血管内皮细胞建立单层细胞具有典型的屏障功能特性,可作为体外研究血视网膜内屏障的有用模型。