Identification of Different Hosts-adapted FMDV Asia Ⅰ/HeB Strain and Its Polvclonal Antibodv

口蹄疫病毒接种乳鼠、豚鼠及BHK-21细胞,获得相应的适应毒.以各组织液中的口蹄疫病毒RNA为模板,反转录并扩增VP1基因,PCR产物琼脂糖凝胶电泳,回收目的片段,测序.测序结果与核酸数据库中口蹄疫病毒VP1基因比对,并将各适应毒扩增的VP1基因序列相互比对.结果表明:此毒为口蹄疫病毒,各适应毒间序列同源性达98％.并用口蹄疫病毒抗原进行SDSPAGE,分别与大肠杆菌表达的口蹄疫病毒HeB株P1蛋白制备的多克隆兔抗及健康对照血清进行Western blot,对多克隆兔抗进行鉴定,并用间接ELISA测定此多克隆兔抗的效价.确定此多抗能中和FMDV结构蛋白,抗体效价＞1∶800.     

口蹄疫病毒vp3-间接免疫荧光诊断方法的建立

口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白VP3为保守区,各血清型间差异不大,因此以其为抗原建立一种快速、有效、操作简便的FMDV自然感染动物与疫苗免疫动物鉴别诊断方法.PCR扩增口蹄疫病毒结构蛋白VP3基因,克隆到杆状病毒表达系统转移载体pFastBacHT-A中,转座DH10感受态细胞,获得阳性克隆.提取基因组Bacmid,转染Sf9昆虫细胞,获得含口蹄疫病毒结构蛋白基因VP3基因的重组杆状病毒.以被检测血清为一抗,以FITC标记的兔抗牛IGg为二抗,通过反应条件的优化,建立间接免疫荧光检测方法,并检测血清44份,与EIASA方法符合率为90.9%.     

鹅星状病毒衣壳纤突蛋白VP27多克隆抗体的制备和鉴定

采用RT-PCR扩增获得鹅星状病毒(Goose astrovirus)的衣壳纤突蛋白基因vp27,并将其克隆至pCold-SUMO原核表达载体。重组表达载体pCold-vp27经过测序和双酶切验证正确后,转化到感受态细胞Rosetta。挑取阳性克隆子,利用异丙基硫代半乳糖苷诱导表达鹅星状病毒衣壳纤突重组蛋白,使用镍柱纯化衣壳纤突蛋白VP27,将定量的重组蛋白免疫BALB/c小鼠。利用ELISA、Western blot和IFA鉴定鼠抗衣壳纤突蛋白VP27多克隆抗体。结果显示,鼠抗衣壳纤突蛋白VP27多克隆抗体的效价大于1∶64 000,Western blot试验结果证明了鼠抗衣壳纤突蛋白VP27多克隆抗体的特异性,IFA试验结果证明鼠抗衣壳纤突蛋白VP27多克隆抗体能够识别天然的鹅星状病毒衣壳纤突蛋白VP27。     

O型口蹄疫病毒结构蛋白基因VP1的克隆与原核表达

[目的]为进一步研究口蹄疫病毒的诊断方法提供理论依据。[方法]根据GenBank上已公布的O型口蹄疫病毒核苷酸序列,设计合成1对特异性引物,通过RT-PCR扩增VP1基因,将其克隆至表达载体pGEX-6p-1中,经测序鉴定目的基因正确地整合至表达质粒中,用IPTG诱导重组基因表达。[结果]通过PCR扩增获得682 bp的目的片段,所克隆的VP1基因在原核细胞中成功表达,表达产物为融合蛋白,经SDS-PAGE鉴定分子量为51 kD,Western Blot结果表明融合蛋白具有免疫原性。[结论]获得了猪O型口蹄疫VP1融合蛋白,可作为包被抗原用于口蹄疫诊断试剂盒的研制。     

O型口蹄疫病毒VP1基因的克隆与表达

以O型口蹄疫病毒(FMDV)流行毒株为研究对象,通过RT-PCR扩增出VP1基因,克隆至表达载体pET-32a中,分析比较不同地区O型口蹄疫病毒VP1基因序列,为构建VP1重组基因工程苗奠定基础．经测序表明,目的基因VP1已以正确的阅读框架整合至表达质粒中,应用大肠杆菌BL21(DE3)为宿主菌,通过IPTG诱导方法,表达包含VP1基因产物的融合蛋白,经SDS-PAGE和Western—blotting分析,表明表达蛋白表达量高,反应原性良好．     

口蹄疫病毒VP1蛋白可溶性表达标签筛选

为了提高口蹄疫病毒VP1蛋白的可溶性表达,根据A型口蹄疫病毒核酸序列设计并合成了口蹄疫病毒VP1片段,将其克隆到p ET21b(+)载体上,设计1对通用引物扩增10个融合标签Grifin、GST、Nus A、SUMO、Thioredoxin、Protein G、γ-crystallin、Ars C、Ppi B、MBP,并分别将扩增的融合标签与VP1连接构建重组质粒,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),0.5 mmol/L IPTG诱导其表达。SDS-PAGE结果表明,MBP、Grifin和GST能够促进口蹄疫病毒VP1蛋白的可溶性表达,其中MBP与VP1融合表达蛋白可溶部分占60%;Western blot鉴定分析结果显示,小鼠抗His标签单克隆抗体能识别表达的重组蛋白。表明成功表达了具有免疫学活性的融合蛋白MBP-VP1。     

猪轮状病毒DN30209株VP4全长蛋白表达及多抗制备和鉴定

为开展猪轮状病毒（PRV）及其VP4蛋白相关特性研究,参照GenBank所收录的猪轮状病毒JL94、OSU等株序列设计一对特异性引物,从实验室分离鉴定的猪轮状病毒DN30209株扩增约2330 bp VP4全长基因,并成功构建重组质粒VP4-pMD18-T。重组质粒经测序、序列比对及分析。结果表明,DN30209株VP4全基因长2331 bp,与参考株JL94的核苷酸同源性为99.7%,氨基酸同源性为99.5%。将VP4基因连接到pGEX-6P-1原核表达载体中,构建并筛选出阳性原核表达载体重组质粒VP4-pGEX-6P-1。阳性重组质粒转化Rosetta宿主菌感受态细胞中,经IPTG诱导,获得以包涵体形式表达的重组蛋白,融合蛋白大小约为112 ku,与预期大小相符。回收、纯化并复性该蛋白,将其作为免疫原免疫大白兔,制备兔抗PRV VP4全长蛋白多克隆抗体,间接ELISA测定多抗效价到1??105,间接免疫荧光（IFA）和免疫印迹（Western blot）检测表明该多抗均可与PRV具有很好的抗原抗体反应性,为猪轮状病毒研究提供有效实验材料。     

A型口蹄疫病毒VP3基因的克隆及原核表达

从实验室冻存的含A型口蹄疫病毒的细胞中提取FMDV总RNA,通过RT- PCR获得cDNA.并根据FM-DV全基因组序列设计了1对针对VP3基因的引物,通过PCR扩增得到目的基因VP3并亚克隆入pMD 18-T载体.将鉴定出的阳性质粒和表达载体PET32a用BamH Ⅰ、HindⅢ双酶切回收后连接,获得阳性重组质粒PET32-VP3.用IPTG诱导重组质粒表达目的蛋白VP3,并用SDS - PAGE进行检测,表达产物用镍亲和树脂进行纯化.结果证明口蹄疫病毒VP3蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达且表达产物得到了纯化,为实验室进一步研究提供了重要的材料.     

口蹄疫病毒VP1基因重组慢病毒载体的构建及VP1基因稳定表达细胞系的建立

【目的】构建口蹄疫病毒VP1基因重组慢病毒载体FG9-VP1,并建立稳定表达VP1基因的BHK-21细胞系。【方法】采用RT-PCR技术从口蹄疫病毒材料中扩增出VP1基因,并将其连入慢病毒载体FG9中,经PCR、酶切和测序鉴定正确后,转染BHK-21细胞,96h后经流式细胞分选筛选GFP阳性细胞,细胞增殖后经WB检测VP1基因的表达。【结果】VP1基因重组慢病毒载体FG9-VP1测序正确,转染BHK-21细胞经流式细胞仪筛选的GFP阳性细胞后可稳定表达VP1基因。【结论】VP1基因重组慢病毒载体构建成功并获得了稳定表达VP1基因的BHK-21细胞系。     

兔出血症病毒衣壳蛋白重组腺病毒的构建、表达及其免疫原性

通过RT-PCR方法扩增上海地区兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白基因(VP60).将其克隆入腺病毒表达载体系统中,构建成重组腺病毒质粒,用脂质体法转染HEK293细胞,得到重组病毒pAd-VP60,经RT-PCR、IFA、HA、SDS-PAGE和Western-blotting鉴定,结果表明重组VP60蛋白在HEK293细胞中获得表达.表达产物与铝胶佐剂混合后注射3月龄非免疫健康家兔,结果表明,免疫后21 d兔体内产生抗RHDV抗体,其HI效价可达2~6～2~7,能抵御HA≥2~(10)致死剂量RHDV强毒的攻击,保护率为100%.     

口蹄疫病毒YN株VPI-2A基因的克隆及遗传变异分析

以口蹄疫病毒YN株RNA为模板,用设计的特异引物RT-PCR扩增出大小为1 055 bp的基因片段,并对PCR产物克隆测序进行序列分析。结果表明:供试病毒的VP1-2A基因的核苷酸序列与参考毒株的同源性为77.65%~93.00%,对应的氨基酸序列同源性为87%~97%。     

猪流行性腹泻病毒S1蛋白截短表达及多抗制备

文章旨在表达猪流行性腹泻病毒PEDV截短S1基因(rS1636-789),并制备特异性多克隆抗体。扩增PEDV rS1636-789基因克隆到原核表达载体PGEX-6P-1上,构建重组表达质粒PGEX-6P-1-rS1636-789,经IPTG诱导,获得以包含体形式表达重组蛋白。将重组蛋白作为免疫原制备兔抗rS1636-789抗体并进行效价测定及生物活性检测。结果表明,多抗效价达1:65 536,间接ELISA和Western blot说明此多抗可与rS1636-789重组蛋白发生很好抗原抗体反应。研究进一步定位PEDV S蛋白免疫优势区,为PEDV基因工程疫苗研究奠定基础。     

猪口蹄疫病毒受体整合素β8亚基配体结合域的原核表达和多克隆抗体制备

病毒受体是决定病毒宿主特异性和组织嗜性的重要因素.利用原核细胞表达了猪口蹄疫病毒受体整合素β8亚基的配体结合域(LBD)片段,分离纯化目的蛋白后免疫兔,制备兔多克隆抗体.以含有猪β8亚基全长cD-NA的质粒为模板,经PCR扩增得到位于β8成熟肽氨基端的LBD基因片段,与带有GST标签的原核表达载体pGEX 4T-1相连,构建原核表达质粒pGEX/β8LBD,测序确认读码框正确后,将其转化感受态细胞BL21(DE3),以IPTG诱导表达重组β8LBD融合蛋白.通过SDS-PAGE和Western blot鉴定后提取包涵体,以电泳分离纯化的重组融合蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,鉴定血清效价和特异性.结果显示,实现了重组猪β8LBD融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达,SDS-PAGE显示分子量约为46 000,主要以包涵体形式存在于菌体中.制备的兔多克隆抗体效价达1∶12 800以上,该血清可与目的蛋白发生特异性反应.这将为进一步研究猪整合素β8亚基在宿主体内的分布及其在口蹄疫病毒致病过程中的作用奠定基础.     

C型口蹄疫病毒VPI基因的克隆及真核表达载体的构建

应用PT-PCR扩增C型口蹄疫病毒（FMDV）VP1基因,将其克隆到pMD18-T载体中,并对克隆载体和VP1基因进行序列分析。将VP1基因和选择标记基因——二氢叶酸还原酶（dhfr）基因插入真核表达载体pCI-neo中,对所构建的重组真核表达载体进行PCR扩增、酶切鉴定和序列分析。结果表明,VP1基因与GenBank中标准毒株（登录号EU553893）VP1的序列同源性为92.8%,VP1基因的真核表达载体pCI-VP1-D构建成功。     

番鸭细小病毒VP3基因的原核表达及多克隆抗体的制备

为获得针对番鸭细小病毒VP3蛋白的多克隆抗体,根据已发表的该病毒基因序列设计一对引物,利用PCR扩增出VP3基因,将其克隆到原核表达载体p ET-32a,转化感受态细胞BL21(DE3)。经IPTG诱导后,SDS-PAGE检测重组蛋白。将重组蛋白切胶免疫BALB/c小鼠,制备抗番鸭细小病毒部分结构蛋白的多克隆抗体。结果显示成功获得VP3基因,构建的原核表达重组质粒成功表达预期的重组蛋白,免疫小鼠获得的多克隆抗体能与番鸭细小病毒及VP3蛋白反应。表明制备的多克隆抗体可用于MDPV的检测,并为进一步研究MDPV奠定了基础。     

兔出血症病毒衣壳蛋白VP60的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】构建兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因的原核表达载体,进行原核表达并制备其蛋白抗体。【方法】以保存的VP60基因的质粒(pTeasy-VP60)为模版,用PCR方法获得VP60基因,并将其克隆到pET28a(+)载体上,构建重组表达载体pET28a(+)-VP60,酶切鉴定和测序验证后转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,优化诱导表达时间和IPTG浓度;利用镍离子螯合层析纯化重组蛋白,并制备了高效价的抗VP60多克隆抗体。【结果】成功构建了兔出血症病毒衣壳蛋白VP60的原核表达质粒pET28a(+)-VP60,其在大肠杆菌中以包涵体形式高效表达,重组蛋白分子质量为60 ku,制备的多克隆抗体具有较强的免疫结合活性。【结论】成功实现了VP60基因的原核表达,制备了重组蛋白VP60的多克隆抗体,为进一步的VP60转基因研究奠定了基础。     

法氏囊炎病毒VP2基因高变区片段的克隆与鉴定

[目的]研究法氏囊病毒VP2蛋白的抗原表位在机体免疫应答中的作用和特点。[方法]以接种传染性法氏囊病毒(IBDV)的鸡胚尿囊液为模板,根据Genbank中登录的IBDV的VP2蛋白基因的全序列设计引物,通过RT-PCR扩增获得VP2高变区部分片段,将其克隆到原核表达质粒PGEX-4T-1中,经酶切鉴定后,转化大肠杆菌Rosetta(DE3)BL21,筛选阳性克隆并对其进行测序鉴定。[结果]通过PCR扩增获得一个504bp的扩增片段,序列分析结果表明它与GenBank中登录的IBDV的VP2蛋白基因的核苷酸序列同源性达99.8%,其氨基酸序列的同源性为99.4%,说明各毒株间高变区基因序列保守性很高。[结论]法氏囊炎病毒毒株在两个大小亲水区内的氨基酸都非常保守。     

C型口蹄疫病毒型特异性抗原的表达与鉴定

[目的]为C型FMDV型特异性多克隆抗体、单克隆抗体的制备及FMDV定型提供理论依据。[方法]以含有C型口蹄疫病毒（FMDV）结构蛋白基因VP1的重组质粒pGEM—CP1为模板,设计特异性表达引物,扩增VP1及其C端编码区。对C型口蹄疫病毒VP1及其C端进行原核表达,并测定反应原性。利用纯化的C型VP1及其C端融合蛋白建立间接ELISA,分别对O、A、C、Asia14型豚鼠阳性血清进行检测,确定C型VP1及其C端与其他3型FMDV抗体的型间交叉反应性。[结果]构建了pPRO-CVP1、pPRBO-CVP1c重组原核表达质粒,实现了C型口蹄疫病毒VP1及其C端的高效表达,目的蛋白的分子量大小分别为33和20kD。Westernblot显示。VPl及其C端融合蛋白均可与对应血清型的豚鼠阳性血清反应。C型VP1及其C端与其他血清型的FMDv阳性血清均未发生交叉反应。且以VP1c端的型特异性最好。[结论]获得了C型FMDV特异性抗原。     

MDV CVI988/Rispens弱毒株VP22基因克隆和序列分析

血清I型马立克氏病病毒(MDV-1)的UL49h基因编码病毒被膜蛋白VP22在病毒的复制和传播过程中具有非常重要的作用.根据已发表的MDV-1 GA株的序列,从CVI988/Rispens弱毒株感染的鸭胚成纤维细胞中扩增VP22基因片段,结果获得大小为732 bp的PCR产物.将PCR产物克隆T载体并测序分析,结果发现,与经典强毒GA株相比,弱毒株CVI988的VP22存在3个定点突变和一个缺失性突变.缺失的位点亲水性强,并位于VP22主要的抗原决定簇区.结果证明强毒株与弱毒株的VP22存在明显差异,为利用CVI988 VP22的蛋白传导域传导目的蛋白奠定了理论基础.     

口蹄疫病毒非结构蛋白3D原核表达、纯化和反应原性分析

采用RT-PCR技术扩增获得口蹄疫病毒(FMDV)细胞毒O/Akesu/58的非结构蛋白3D(NSP 3D)基因编码区,并定向克隆到pProexHTb原核表达载体上,再将重组pProex-3D转化至大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,表达产物用亲和层析法纯化,经SDS-PAGE鉴定和Western-blot分析抗原性;以纯化的表达蛋白免疫豚鼠制备其多克隆抗体,ELISA测定抗体效价,间接免疫荧光法检测制备的豚鼠抗NSP 3D多克隆抗体与细胞毒天然抗原的反应原性.结果表明:表达的目的蛋白大小为53ku左右;ELISA结果表明,制备的多克隆抗体效价达1∶1 024以上;Western-blot分析表明,纯化后的蛋白能与FMDV感染动物血清发生特异性反应;间接免疫荧光检测发现,豚鼠抗3D蛋白多克隆抗体可与细胞毒天然抗原反应,与阴性对照未见反应.