美国进口大豆中菜豆荚斑驳病毒和玉米褪绿斑驳病毒的检疫鉴定

菜豆荚斑驳病毒(Bean pod mottle virus,BPMV)和玉米褪绿斑驳病毒(Maize chlorotic mottle virus,MCMV)是我国进境植物检疫性有害生物。2018年6月秦皇岛海关通过反转录PCR(RT-PCR)和双抗体夹心酶联免疫吸附(DAS-ELISA)方法,从一批美国进口大豆以及杂质中检出BPMV和MCMV;同时利用实时荧光PCR(Real time RT-PCR)和序列比对分析方法进行验证。这是河北口岸首次在进境大豆中截获BPMV和MCMV。     

RT-PCR和实时荧光RT-PCR一步法检测大豆中菜豆荚斑驳病毒

针对进口大豆的菜豆荚斑驳病毒(Bean pod mottle virus,BPMV)检测,建立了一步法RT-PCR和一步法实时荧光RT-PCR检测方法.依据BPMV的外壳蛋白编码基因设计了特异引物和特异Taqman探针,特异引物的扩增片段约为500bp,阳性质粒的实时荧光PCR方法的检测下限为20fg/μL,是一步法RT-PCR方法的100倍,检测时间由约8 h缩短至4 h.种脐灰色斑驳的大豆种子BPMV检测呈阳性,种脐黑色斑驳的大豆种子BPMV检测呈阴性.     

大豆种传菜豆荚斑驳病毒的研究进展

近年来随着我国大豆进口量激增,国内检疫机构多次从美国进口大豆中检出大豆种传病毒菜豆荚斑驳病毒(Bean pod mottle virus,BPMV)。该病毒是我国植物检疫对象,我国为非疫区,了解和掌握该病毒的生物学特性、为害及其检测技术等方面研究进展和口岸检疫措施与防治办法非常重要。对此,做了综述。     

新沙口岸多次从进口美国大豆中检出菜豆荚斑驳病毒

2008年12月初至2009年3月底间,广州局新沙办和广东局植检实验室密切合作连续11次从美国进口的的大豆中检出国家禁止进境的植物危险性病害--菜豆荚斑驳病毒(Bean pod mottle virus, BPMV).     

半巢式RT-PCR检测进口大豆中菜豆荚斑驳病毒的研究

 菜豆荚斑驳病毒(Bean pod mottle virus,BPMV)在美国东部和南部的大豆产区广泛分布。该病毒能够造成3%~52%的产量损失并使大豆品质降低,目前我国未见其分布。针对进口大豆种子的植物病毒检测,本文建立了半巢式RT-PCR技术检测BPMV的方法。该方法采用Trizol快速提取大豆种子病毒总RNA,并根据BPMV的外壳蛋白编码基因设计特异性引物,经第一轮RT-PCR和第二轮半巢式PCR扩增,分别得到275 bp和196 bp大小的特异性基因片段。半巢式RT-PCR扩增产物的测序表明,该产物序列与BPMV的外壳蛋白编码基因存在91%~95%的高度同源性。检测灵敏度比较研究显示,DAS-ELISA与RT-PCR的检测灵敏度相近,半巢式RT-PCR的检测灵敏度比这2种方法高出103倍以上。     

张家港局从进境美国大豆中截获菜豆荚斑驳病毒和大豆花叶病毒

2006年1—4月份经江苏局植检实验室检测确认张家港送检的美国大豆样品中3批含有检疫性有害生物——菜豆荚斑驳病毒（Bean pod mottle virus），1批含有大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus）。值得一提的是这2种有害生物皆为美国大豆中截获，也是张家港局首次在大豆中截获的病毒。     

双重DPO-RT-PCR检测南芥菜花叶病毒及菜豆荚斑驳病毒

针对南芥菜花叶病毒(Arabis mosaic virus, Ar MV)及菜豆荚斑驳病毒(Bean pod mottle virus, BPMV)基因组中特异性较高的序列,分别设计了特异性DPO(dual priming oligonucleotide)引物,建立了一种快速检测这两种植物病毒的多重DPO-RT-PCR方法,并评价其特异性、灵敏度及退火温度敏感性。设计的DPO引物特异性较强,Ar MV和BPMV可分别扩增出217 bp与800 bp的特异性条带,检测灵敏度均达0.02 ng/μL。该检测方法对退火温度不敏感。实际样本及模拟样本的检测结果均与国家标准方法一致。本研究建立的检测方法可应用于Ar MV、BPMV的快速筛查,为口岸检疫监管提供技术支撑。     

单管实时荧光RT PCR方法同时检测大豆种子中的菜豆荚斑驳病毒和烟草环斑病毒

 本研究建立了大豆种子中菜豆荚斑驳病毒（BPMV）和烟草环斑病毒（TRSV）单管双重实时荧光PCR检测方法。将含有相同浓度的分别带有BPMV和TRSV CP基因的质粒溶液作为阳性对照,以受两种病毒侵染的大豆种子作为待测样品进行实时荧光PCR检测,结果表明能从同一管中同时检测出这两种病毒而不发生交叉反应。尽管在阳性对照中,二者的检测限相当,均可达到35 pg/mL,但在实际应用中,两种病毒由于在大豆种子中的浓度不一致而存在一定的差别。该方法快速、灵敏、简便,同时特异性更强,在出入境检验检疫中具有广泛的应用前景。     

大麦条纹花叶病毒荧光定量PCR检测方法的建立及应用

大麦条纹花叶病毒Barley stripe mosaic virus（BSMV）是我国进境植物检疫性有害生物。为提高大麦条纹花叶病毒检测的灵敏度和特异性,缩短检测周期,根据该病毒不同分离株外壳蛋白（coat protein, CP）基因的保守序列设计特异性的引物和探针,建立了BSMV的实时荧光RT-PCR检测方法。结果表明,本检测方法特异性强,对南方菜豆花叶病毒Southern bean mosaic virus（SBMV）、小麦线条花叶病毒Wheat streak mosaic virus（WSMV）、玉米褪绿斑驳病毒Maize chlorotic mottle virus（MCMV）、烟草环斑病毒Tobacco ringspot virus（TRSV）、菜豆荚斑驳病毒Bean pod mottle virus（BPMV）和番茄环斑病毒Tomato ringspot virus（ToRSV）6种病毒均无交叉扩增;且检测方法灵敏度高,对RNA模板的最低检测限达到5×10-4 ng/μL,与双抗体夹心酶联免疫吸附法（DAS-ELISA）和普通RT-PCR相比,本方法的灵敏度分别提高了10倍和100倍。此外,我们利用该方法对12批进口大麦进行检测,发现6批大麦中检出大麦条纹花叶病毒,占比约50%。总之,本研究建立的荧光定量PCR方法具有灵敏度高、特异性强等优点,适合于BSMV的快速检测。     

单管多重RT-PCR同时检测大豆种子中三种检疫性植物病毒

我国大豆年进口量持续增长,快速、准确地检测进境大豆种子中可能携带的病原物是防止检疫性有害生物入境传播和扩散的有效手段。菜豆荚斑驳病毒(BPMV)、烟草环斑病毒(TRSV)和番茄环斑病毒(ToRSV)均是被大豆种子携带的检疫性有害生物。本研究建立了在单一PCR管中同时检测这3种检疫性植物病毒及大豆内源基因Bd-30K的多重RT-PCR方法。研究结果表明,所建立的多重RT-PCR方法具有较好的特异性和灵敏度,检测含BPMV、TRSV和ToRSV RNA的最低浓度分别为0.45、0.0093和0.004ng/μL,从大豆种子中同时检测3种病毒的最低RNA浓度为0.58ng/μL。     

进口大豆上菜豆荚斑驳病毒的免疫捕获巢式RT-PCR检测

利用DAS-ELISA对进口大豆上BPMV进行检测发现,从美国进口的部分大豆样品对BPMV的多抗血清呈阳性反应;利用免疫吸附电镜观察发现,ELISA检测阳性的大豆种皮病汁液中存在直径约30nm的球状病毒粒子.根据BPMV外壳蛋白（CP）基因的保守序列设计了2对嵌合引物,建立了BPMV的高灵敏的免疫捕获巢式RT-PCR（IC-nested RT-PCR）检测方法.该方法经免疫捕获、反转录和2轮PCR扩增,能从带毒大豆种子中扩增到预期大小的DNA条带.序列测定与分析表明此条带的序列为BPMV部分CP基因,在系统关系树上与BPMV的其它分离物形成一簇亲缘关系很近.实验表明从进境大豆上检测到了BPMV.     

从印度进口的洋葱中检出洋葱黄矮病毒

本文报道了从印度进口的洋葱中检出洋葱黄矮病毒。从印度进口的洋葱种球经过隔离试种,有1株洋葱幼苗发生整株矮化,叶片出现无规则的黄色条纹、皱缩等症状,经DAS—ELISA、RT-PCR检测和序列分析验证,确认该批从印度进口的洋葱鳞球茎中携带有洋葱黄矮病毒(Onion yellow dwarfvirus)。     

应用IC-RT-PCR方法检测番茄环斑病毒

以番茄环斑病毒阳性样品为研究材料,根据GeneBank(核酸序列数据库)中的序列设计特异性引物进行IC-RTP-CR(免疫反转录聚合酶链式反应,下同)扩增,获得产物克隆到pMD18-T载体中,经测序后与目标序列(ToRSVL19655)比较,核苷酸同源性为87.3%。通过实验建立了检测该病毒的IC-RT-PCR方法。该方法对其他样品核酸提取困难而抗体较容易制备的病毒检测同样具有借鉴意义。     

大豆干种子中大豆花叶病毒的RT-PCR检测

 应用改进的SDS-酚氯仿法,在沉淀RNA前先加入1/4体积无水乙醇、1/10体积5mol/L乙酸钾沉淀多糖,然后再用异丙醇沉淀RNA,成功地从大豆干种子中提取了大豆花叶病毒(SMV)总RNA;应用RT-PCR技术对大豆种子中携带的SMV进行了检测,同时以DAS-ELISA方法作比较,建立了能直接以大豆干种子为检测对象的SMV快速、灵敏、特异的RT-PCR检测技术。     

齿兰环斑病毒与建兰花叶病毒分子检测研究

齿兰环斑病毒（Odontoglossum ringspot virus,ORSV）与建兰花叶病毒（Cymbidium mosaic virus, CyMV）是严重危害兰科植物的两种主要病毒。本研究根据病毒外壳蛋白基因设计特异性引物,应用ELISA、普通RT-PCR、巢式RT-PCR和免疫捕获RT-PCR4种方法进行了检测研究与比较。结果表明：普通RT-PCR与ELISA方法检测灵敏度相当;巢式RT-PCR检测灵敏度要比普通RT-PCR与ELISA方法高出104倍以上;免疫捕获RT-PCR检测灵敏度介于普通RT-PCR和巢式RT-PCR之间。采用巢式RT-PCR方法对我国台湾进境的蝴蝶兰植株样本检测,1号样本出现与阳性对照一致的特异条带。双向测序分析,扩增产物序列与ORSV外壳蛋白基因具有100％的同源性,表明1号蝴蝶兰样本携带ORSV。     

进境玫瑰鲜切花李属坏死环斑病毒的检测鉴定

近期上海口岸连续多次从进境的玫瑰鲜切花中检出我国检疫性有害生物李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ringspot virus,PNRSV),通过DAS-ELISA、RT-PCR、SYBR Green I实时荧光RT-PCR和序列分析等4种方法分别检测和复验该病毒,结果均为阳性,由此确定从进境玫瑰鲜切花中检出了PNRSV。同时本文分别检测玫瑰叶片、花瓣、茎干和花萼,结果均带有PNRSV,确定该病毒系统侵染玫瑰。     

番茄黑环病毒分子生物学检测方法及分离物序列分析

根据TBRV运动蛋白基因的保守序列设计引物，RT-PCR和IC-RT-PCR能从6个TBRV的分离物中分别扩增到与预期大小相同的DNA条带，序列测定和分析表明所测定的序列为TBRV运动蛋白基因的部分序列，在系统关系树上与TBRV的其它分离物形成一簇，表明所建立的RT-PCR和IC-RT-PCR检测方法是可靠的。     

从进境印度尼西亚辣椒种子中截获番茄环斑病毒

本文利用DAS-ELISA方法从印度尼西亚进境的辣椒种子中初步筛选出疑似感染有番茄环斑病毒(ToRSV)的样品,利用IC-RT-PCR(immune capture RT-PCR)扩增特异性片段,进而对扩增的PCR产物进行了测序和序列比对,确认我们在进境的辣椒种子中检出了我国关注的检疫性有害生物——番茄环斑病毒。此前该病毒未有在印度尼西亚辣椒上危害的报道,是系统内首次在蔬菜种子上截获该病毒。     

豌豆种传花叶病毒检测鉴定

豌豆种传花叶病毒(pea seed-borne mosaic virus,PSbMV)世界广泛分布,在国外已造成豌豆大量减产,国内有仅小范围低密度分布的报道。加拿大豌豆种子中挑拣皱缩、黑斑等症状的豌豆,先采用双抗体夹心酶联免疫吸附(DAS-ELISA)方法检出PSbMV阳性,再利用反转录PCR(RT-PCR)、序列比对分析和构建系统进化树对阳性样本进行验证鉴定,结果显示与PSbMV序列相似度为99.25%,综上确定从进境豌豆种子中检出豌豆种传花叶病毒。