一种简单分离、传代培养成年小鼠肝细胞的方法

目的寻找肝细胞分离、传代培养更简单方便的方法。方法应用不同胰酶浓度、不同消化时间消化成年小鼠肝组织后进行组织块培养,观察细胞的贴壁率、产量及活力。结果胰蛋白酶分离成年小鼠肝细胞,于MEM(含20%小牛血清)培养液中,37℃密闭培养,生长情况良好,12小时左右即可完全贴壁,并已传至第二代。胰酶浓度为0.15%,消化时间15min,细胞产量及活率较高,每10g体重细胞产量为0.84±0.08×107,细胞活力为(90.66±5.71)%,贴壁生长48小时细胞倍增PD值为0.86±0.05。结论胰蛋白酶消化、组织块贴壁法是成年小鼠肝细胞分离、培养传代的简便方法,不需要特殊装置,酶耗费少,细胞采集可满足一般实验要求。     

一种培养幼小鼠肝细胞的方法

我国目前动物实验主要用小鼠进行。然而经典的Ｓｅｇｌｅｎ灌流肝细胞分离需采用门静脉插管灌流较难用于幼鼠 ,特别是幼小鼠。我们对Ｓｅｇｌｅｎ灌流法做了改进 ,将生后 2ｄ的 6 15幼小鼠肝细胞培养成功 ,现报告如下。1　材料和方法动物 :出生 2ｄ 6 15幼鼠。试剂 :Ｄ -Ｈａｎｋ’ｓ液 ,Ｈａｎｋ’ｓ液 ,ｐＨ 7.2 ,0 .0 5 %Ⅳ型胶原酶 (购自美国Ｓｉｇｍａ公司 ) ,含 10 %小牛血清完全培养基。肝细胞分离与培养 :取出生 2ｄ的 6 15幼鼠 ,2 5 %氨基甲酸乙酯 (4ｍｌ/ｋｇ体重 )腹腔注射麻醉 ,常规皮肤消毒 ,剖开胸腹腔 ,暴露心脏与肝脏 ,用 1…     

小鼠肝细胞的分离培养

采用０．１％的胰蛋白酶消化乳化乳小鼠肝组织块，用ＤＭＥＭ２培养基进行肝细胞的培养，１周后可见细胞生长，３０ｄ左右细胞铺满培养瓶，培养的肝细胞能分泌白蛋白，培养第２０天白蛋白分泌量达高峰。     

一种小鼠原代肝细胞培养方法

目的寻求一种简易、廉价的原代小鼠肝细胞培养方法。方法采用Ⅳ型胶原酶消化法制备游离肝细胞悬液，以低血清进行肝细胞单层培养。结果通过多次探索、观察，比较成功地进行了原代肝细胞培养。结论此方法适合一般实验室开展肝细胞培养。     

高活力原代小鼠肝细胞的分离与纯化

目的建立一种稳定的能获得高活力和高纯度原代小鼠肝细胞的分离和纯化方法。方法对传统的两步原位胶原酶灌注法进行4个方面的优化,主要包括选择逆向灌流、将持续灌注法改为间断灌注后夹闭门静脉法、严格控制胶原酶消化时间和将分离的肝细胞悬液进行低速Percoll单密度离心纯化。分离后的肝细胞进行体外培养。肝细胞活力和得率用台盼蓝染色法检测。结果新鲜分离的小鼠原代肝细胞活力能稳定达到87%±3%,平均活细胞总数为8×105每克小鼠体重,绝大部分细胞在体外培养2h后贴壁生长。结论优化后的肝细胞分离方法更为稳定、有效,分离到的肝细胞具有高活力的优点。     

小鼠肝细胞的分离培养

采用０．１％的胰蛋白酶消化乳小鼠肝组织块，用ＤＭＥＭ培养基进行肝细胞的培养，１周后可见细胞生长，３０ｄ左右细胞铺满培养瓶，培养的肝细胞能分泌白蛋白，培养第２０天白蛋白分泌量达高峰。     

介绍一种大鼠肝细胞的分离和培养方法

介绍分离、纯化大鼠肝细胞(用胶元酶二步灌流和PercoⅡ不连续密度离心)及分离后的培养。此方法可靠易行，可制备出质量合格的肝细胞(实质细胞)。讨论了保证分离和纯化成功的一些关键步骤、条件和原理．提出分离肝细胞应首选胶元酶Ⅳ，PereoⅡ的渗透压和pH也是影响肝细胞的漂浮密度和存活能力的因素。     

一种简化的分离与培养小鼠原代肝细胞的方法

目的 建立一种简单的能获得高纯度小鼠原代肝细胞的分离与培养方法。方法 将经典的两步灌流法简化为经下腔静脉逆向脉冲式灌注,利用低速离心法对肝细胞分离液进行纯化;利用锥虫蓝染色法鉴定细胞活率;培养瓶预先用鼠尾胶原铺备,利用倒置显微镜观察细胞形态。结果 此法得到了足够数量的肝细胞,细胞活率大于90%;细胞可稳定贴壁1周。结论 成功建立了一种简单的分离与培养小鼠原代肝细胞的方法。     

一种分离纯化东方田鼠肝细胞的方法改进

目的 建立体外培养东方田鼠鼠肝细胞的实验体系.方法 采用下腔静脉插管原位灌注结合胶原酶灌注法分离纯化出肝细胞,在改良Eagle培养基(Dulbecco's Modified Earle Media,DMEM)中培养,显微镜下观察细胞形态,AO-EB染色观察测定其活率来评价细胞质量.结果 一只东方田鼠肝脏一般可获得1.5×108～3.0×108个细胞,活率达95%,完全符合实验要求.刚分离的东方田鼠肝细胞呈圆球形,大小均匀,培养3 h后,大部分肝细胞出现贴壁,形态呈扁平状.培养24 h后,伸展良好,并成片生长.结论 下腔静脉插管原位灌注结合胶原酶灌注法可以分离出高纯度和活率高的东方田鼠肝细胞.     

大鼠成体肝卵圆细胞分离培养及诱导分化的初步研究

目的 通过成体大鼠肝卵圆细胞分离培养获取纯净的干细胞并观察诱导分化前后从肝卵圆细胞到肝细胞的形态变化.方法 采用AAF/PH肝干细胞刺激模型,胶原酶Ⅳ消化分离和Percoll梯度离心纯化肝卵圆细胞的方法,用地塞米松、DMSO和EGF、HGF、SCF、LIF等生长因子联合应用诱导肝卵圆细胞增殖和分化为肝实质细胞.观察肝卵圆细胞到肝细胞形态变化过程,用免疫荧光技术,Western blotting分析检测了干细胞标志c-kit和RT-PCR分析法检测肝干细胞白蛋白和CK19 mRNA表达鉴定卵圆细胞.结果 分离得到的肝卵圆细胞活度达到90%,细胞形态包括大小和颜色呈不均质,卵圆细胞直径是肝细胞直径的1/4～1/6.诱导后出现大而圆的肝细胞,可见卵圆细胞到肝细胞的中间变化过程,新分离的肝卵圆细胞在生长因子诱导下有向肝细胞分化的特性.经c-kit免疫荧光染色显黄绿色荧光,Western blotting检测肝卵圆细胞有c-kit蛋白条带,而大鼠肝细胞及胆管细胞则未出现条带.PCR分析显示卵圆细胞有CK19和白蛋白mRNA表达.结论 新分离的肝卵圆细胞同时表达c-kit,CK19和白蛋白3种抗原,诱导分化出现一系列从卵圆细胞到肝细胞的形态学变化,这种现象证明分离的肝卵圆细胞就是肝干细胞,经诱导分化可以产生成熟的肝细胞,成为进一步研究肝干细胞生物学特性的基础.     

小鼠胚胎成纤维细胞的分离与培养

目的 探讨影响小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）分离和培养的一些因素，以建立稳定的MEF培养体系。方法 取BALB／c小鼠胚胎分离成纤维细胞，利用体外培养体系，对MEF的生长形态，生长曲线及细胞周期进行观察，并对不同胚胎日龄以及不同胰酶作用时间对MEF分离及培养的影响进行研究。结果 13.5d胎龄鼠胚的MEF分离效果优于10.5d,18.5d胎龄鼠胚；MEF在体外为贴壁生长型细胞，第三代细胞增殖旺盛;在室温条件下，0.25%胰酶消化MEF时间以3－5min为宜。结论 MEF在第3代增殖旺盛，最适宜作胚胎干细胞的饲养层。     

简便快捷的小鼠胰岛分离纯化方法研究

目的 探讨小鼠胰岛分离与纯化的方法.方法 采用多点注射灌注胶原酶法消化胰腺,不连续密度梯度离心联合人工挑取的方法分离、纯化胰岛.双硫腙特异性染色后计算胰岛产量及纯度.葡萄糖刺激后测定培养上清液胰岛素水平检测胰岛功能.结果 (1)每只小鼠采用上述分离、纯化法平均得到(114±15)个胰岛,平均纯度为(77.12±3.23)％,胰岛细胞存活率＞90％; (2)分离、纯化的胰岛培养上清液中胰岛素水平在无糖、低糖(2.8 mmol/L)和高糖(22.2 mmol/L)刺激下分别为(23.80±3.52) mIU/L、 (67.57 ±4.04) mIU/L和(164.32±10.75) mIU/L,各组间比较,差异有统计学意义(P＜0.05).两两比较,低糖组的胰岛素水平为无糖组的2.84倍(P＜ 0.05),高糖组的胰岛素水平为低糖组的2.43倍(P＜0.05),高糖组的胰岛素水平为无糖组的6.90倍(P＜0.05).结论 采用多点注射灌注胶原酶法消化胰腺,不连续密度梯度离心联合人工挑取的方法分离、纯化的小鼠胰岛产量及纯度较高,形态完整,不同浓度葡萄糖刺激后胰岛素分泌反应良好,是一种简便、快捷的小鼠胰岛分离方法.     

成人静脉内皮细胞单次传代大规模体外培养

用胶原酶消化成人静脉，总数：２５．９±６．７２×１０￣３个细胞。获取９．１２±４．３×１０￣３个细胞／ｃｍ￣２，活细胞率为９９％。以２．３９±０．４３×１０￣３个细胞／ｃｍ￣２的接种密度将其接种到一次性塑料培养皿中进行原代培养。待细胞进入增殖平台期后（生长时间为：７．２５±０．５ｄ），以１：２６比例将原代细胞进行传代培养。经８±０．８２ｄ培养后，细胞接触仰制形成。整个体外培养扩增时间为：１５±１．４ｄ，血管内皮细胞数增加了３３３±４０倍。经荧光标记第Ⅷ因子相关抗原单克隆抗体和透射电镜观察证实：１９９％以上的原代及传代细胞为血管内皮细胞。扩增后的血管内皮细胞染色体２ｎ＝４６条，未发现异倍体细胞。在原代和传代细胞的条件培养液内ｔ－ＰＡ和ＶＷＦ含量相差无统计学意义。     

小鼠子宫内膜干细胞的研究进展

子宫内膜干细胞是一种成体干细胞,可通过不对称分裂对子宫内膜进行修复。现有许多学者致力于子宫内膜干细胞的研究,标记滞留细胞技术和Hoechst 33342-SP法是常用的子宫内膜干细胞研究的方法,这些方法在用于人和小鼠子宫内膜干细胞的研究中各有其局限性。人子宫内膜干细胞研究受多种因素的限制,而小鼠成为一个重要的替代模型。现就小鼠子宫内膜干细胞的研究现状进行论述,并对其今后的研究前景进行展望。     

乳鼠成骨细胞体外培养

目的建立乳鼠成骨细胞体外培养方法,探讨该方法的可行性和应用价值。方法用出生1~3 d乳鼠颅骨,采用多次胶原酶消化法进行细胞体外培养。倒置显微镜观察细胞形态,对其碱性磷酸酶(ALP)活性及矿化能力进行鉴定,并测定细胞生长曲线。结果原代培养24 h后,大量细胞贴壁生长,细胞呈圆形,48 h后,贴壁细胞呈长梭形、三角形或不规则多边形,并且贴壁细胞伸出2~3个突起,胞质透亮、饱满,7 d后细胞铺满整个平皿底面。经鉴定,培养细胞具有体内成骨细胞的生物学特性。细胞接种后第1与第2个24 h为细胞的潜伏适应期,第3与第7个24 h生长曲线基本为线性曲线,是细胞的对数生长期。结论采用胶原酶消化法分离培养成骨细胞的方法切实可行。     

分割小鼠胚胎的简易方法和分割后二分胚的发育能力

本研究改进和简化了小鼠胚胎分割方法,在普通立体显微镜下用玻璃针手工切割,每切割一枚胚胎只需1min。共切割4日龄鼠胚701枚,得1346枚可用半胚,分割成功率为96.01%。半胚培养发育率达73.70%。冷冻裸半胚,装透明带半胚和装透明带后再用琼脂包埋半胚的解冻后培养发育率分别为26.67%、56.67%和64.29%。     

乳猪肝细胞的分离、培养及功能检测

目的 为构建生物人工肝进行肝细胞的准备。方法 采用胶原酶半原位灌流法分离单个乳猪肝细胞,并对其活力及单层和聚集培养后的白蛋白、尿素合成功能进行检测。结果 采用本方法从每头乳猪中分离到的单个肝细胞数为(3.1±1.5)×10~(10),活性超过95％。在加入激素和生长因子的培养基中单层培养时,肝细胞功能良好,可维持2周左右。而在未加入激素和生长因子的培养中肝细胞虽能存活1周,但功能于24h后即丧失。球形聚集培养可实现肝细胞的大量培养,且生物学活性较单层培养显著提高。结论 采用胶原酶半原位灌注法所得单个乳猪肝细胞基本能满足构建生物人工肝对肝细胞数量的要求。聚集培养接种密度大,细胞生物学活性高,可用于构建生物人工肝。