人源化抗体研制策略分析及应用研究

鼠源性单克隆抗体由于可引起免疫反应而逐渐被人源化抗体所替代，人源化抗体开辟了抗体治疗临床应用的新时代。本文介绍并比较分析了几种制备人源化抗体的策略和抗体表达系统，并对其临床应用进行了展望。     

新一代治疗用抗体——改型抗体

改型抗体是在嵌合抗体基础上构建的新一代人源化抗体,因其免疫原性进一步降低而适用于临床治疗。本文较为详细地介绍了改型抗体有关研究进展,包括改型抗体的产生与发展、设计和构建、优点及应用等。     

抗Aβ鼠源单克隆抗体的人源化改造及其表达鉴定

目的 将前期构建的抗Aβ人-鼠嵌合抗体进行可变区人源化改造,为抗Aβ抗体在临床人体中应用奠定基础。方法 采用模板替换法对已构建的人-鼠嵌合抗体基因中的重、轻链可变区框架区进行人源化改造,构建抗Aβ人源化抗体的真核表达载体。用脂质体法将重、轻链共转染CHO细胞进行表达,采用ELISA法检测表达产物效价、表达量;同时用SDS-PAGE及Western Blot检测表达产物分子量;免疫组化法鉴定其生物活性。结果 重组改造后的抗Aβ人源化抗体基因重链约为1500bp,轻链约为750bp,与预期一致。转染CHO细胞后获得表达,表达量为1.11mg/L,抗体重链相对分子量约为51ku,轻链约为25 ku。ELISA结果显示能与Aβ特异性结合（细胞培养上清A值：2.24）,与改造前的嵌合抗体比较效价基本相同。抗体人源化检测显示,只能被羊抗人抗体识别,不能被羊抗鼠抗体识别。免疫组化显示表达产物有结合Aβ抗原的活性。结论 将抗Aβ人-鼠嵌合抗体进行可变区人源化改造后,基本保持了原嵌合抗体的生物学特性,为其今后应用于临床提供了可能性。     

产生人抗体的转基因和转染色体动物研究进展

鼠单克隆抗体应用于临床的弊端是它具有免疫原性 ,可行的办法是将鼠单克隆抗体人源化。抗体人源化的过程已由鼠嵌合抗体发展到了转基因动物表达完全人抗体阶段 ,表达完全人抗体的转基因动物有鼠、牛等。文中介绍了这些转基因动物的构建特点及这两种动物表达的人单克隆抗体和人多隆抗体的应用意义     

人源性抗地高辛单链抗体(scFv)及diabody的获取

目的:从大容量噬菌体抗体库中筛选人源性抗地高辛单链抗体(scFv),并构建双价抗体(diabody)。方法:以固相化的Dig对构建的大容量噬菌体抗体库进行筛选,4轮后挑取集落,用ELISA法鉴定其特异性,并对抗Dig阳性抗体基因进行DNA指纹分析及测序分析。选取活性好的抗体基因进行改造,构建diabody。结果:在抗体库的筛选过程中可见到明显的富集现象,获得4株可与Dig特异性结合的人源单链抗体,经DNA指纹分析及测序分析证明为不同抗体基因,分泌抗Dig抗体的阳性克隆的可变区基因轻链均属于λ第1亚群,重链基因分别属于第3和第4亚群。选取4号克隆进行基因改造,构建diabody的表达载体,获得活性较好的diabody。结论:利用噬菌体抗体技术获得了人源性抗Dig的抗体,并改造成应用前景较好的diabody,为临床诊断及治疗洋地黄类药物的中毒提供了具有实用价值的人源抗体。     

人源化抗体用于病毒性疾病治疗的研究进展

抗体对于病毒感染的被动免疫治疗具有重要作用，目前人源化抗体研究技术的发展已使抗体的临床应用成为可能，针对很多强致病力病毒，已有很多治疗性人源单抗研究的报道，并显示出良好的应用前景。     

人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体的体外成熟

目的 提高人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体的亲和力和特异性，方法 以人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体为基础，通过合成部分随机化的突变引物和PCR等方法构建HCDR3和LCDR3的混合突库，然后利用噬菌体表面呈现技术对抗体库进行筛选，并利用本实验室建立的单链抗体－碱性磷酸酶系统进行单克隆的鉴定。结果 得到4株亲和力和特异性有明显改善的人源化抗体。结论 构建CDR3突变库是抗体体外成熟的一个有效方法，该研究为研制低免疫原性的导向溶栓制剂奠定了基础。     

大容量人源天然噬菌体抗体文库的建立

随着噬菌体展示技术的发展,抗体库的构建方案日趋成熟,使人们可以从人源噬菌体抗体库中淘选到全人源化的基因工程抗体１。为抗病毒、抗肿瘤以及自身免疫性疾病等的治疗,开辟了新的途径２。为了获得供临床治疗应用的低抗原性、高亲和性抗体,必须构建库容量大、具有多样性的人源抗体库３,对于未经免疫的天然抗体库,则要求更高４。但在这方面,尤其是优化抗体库的多样性问题上,还存在一些难点。为此,我们从取材开始,对抗体库构建过程中的每个环节进行了严格的控制,从而极大地提高了抗体库的多样性,获得了具有较高代…     

构建预设CDR3基因噬菌体抗体库筛选抗人整合素ανβ3 mAb的人源化Fab

目的:构建预设CDR3基因的噬菌体抗体库,通过抗原表位导向选择方法筛选抗人整合素ανβ3单克隆抗体(mAb)人源化Fab。方法:将鼠mAbLCDR3重组到人轻链可变区文库中并与人/鼠嵌合重链Fd基因配对构建杂合噬菌体抗体库,用固相人整合素ανβ3抗原筛选人源化轻链基因。再用所获人轻链基因与移植有鼠mAbHCDR3的人重链Fd基因配对构建人源噬菌体抗体库,筛选人源化Fab。结果:分别构建了库容为2.1×106和2×107的杂合噬菌体抗体库和人源噬菌体抗体库,筛选到3株人源Fab克隆。经间接ELISA及竞争抑制ELISA证实,能特异结合整合素ανβ3抗原,其中人源D5株Fab克隆的基因序列表明,人轻链可变区基因属VKIII亚群,人重链可变区基因属VH1亚群。结论:利用噬菌体抗体库技术,成功地进行了鼠抗人整合素ανβ3mAbE10人源化的改造,为进一步临床应用奠定了基础。     

抗甲肝病毒人源基因工程全抗体分子在杆状病毒中的表达

目的 探讨人源抗甲型肝炎病毒全抗体分子在杆状病毒中的表达。方法 将获得的人源抗甲肝病毒中和性抗体Fab段基因克隆入含信号肽及Fc的杆状病毒表达载体中并在杆状病毒细胞中表达。结果 获得了中和性人源抗甲肝病毒全抗体分子的表达产物并进行了纯化，轻重链表达产物位置大小正确，HAFc16抗体能与具有中和活性的鼠抗甲肝病毒单克隆抗体产生竞争抑制反应，并能在体外中和甲肝病毒，另一株HAFc78抗体同样具有体外中和甲肝病毒的活性，但系抗不同位点的抗体。结论 获得的人源抗甲肝病毒全抗体分子表达产物具有很好的体外中和甲肝病毒的活性，且为抗不同位点的抗体，为这些抗体的进一步开发及应用打下了基础，为防止甲型肝炎暴发流行提供应急措施。     

人源化抗炭疽芽胞杆菌保护性抗原单链抗体的设计和表达

目的:应用抗体"框架区重塑"技术,对鼠单克隆抗体(mAb)框架区进行人源化,制备人源化单链抗体(scFv)并检测其活性。方法:在获得抗炭疽芽胞杆菌保护性抗原鼠mAb(5E1)可变区基因的基础上,保持鼠mAb互补决定区(CDR)不变,选择与框架区同源性最高的人源序列替换鼠mAb的框架区,保留个别关键的鼠源残基。通过融合PCR技术构建人源化的scFv,并在大肠杆菌中进行了表达。表达产物以包涵体形式存在,通过变性、镍柱亲和层析和复性,获得复性后的可溶蛋白。对纯化产物进行了SDS-PAGE、ELISA和抑制炭疽毒素中和活性的检测。结果:人源化后的序列具有与鼠源scFv一致的抗原结合活性和细胞水平的中和炭疽毒素活性。结论:获得了具有功能的人源化的抗体基因序列,为表达具有中和炭疽毒素活性的全分子人源化抗体奠定了基础。     

中和抗肾小球基底膜抗体的单链抗体的筛选与鉴定

目的 制备人抗肾小球基底膜(GBM)抗体的特异性人源化单链可变区抗体.方法 采用噬菌体表面展示技术,获得一个与人抗GBM抗体结合活性较强的单链可变区抗体片段的阳性克隆,并对该克隆进行DNA序列测定分析.结果 对噬菌体单链可变区抗体库经过3轮筛选后,与第1轮相比富集了137倍.噬菌体抗体与人抗GBM抗体的结合活性其中有35株克隆ELISA的吸光度较高.对这些噬菌体抗体进行交叉反应后,确定其中有10株交叉反应较弱.确定1株(C31)阳性克隆提取质粒,进行DNA序列测定,大小为750 bp,并符合人源化单链可变区抗体的序列结构.结论 应用噬菌体展示技术成功获得人-抗GBM抗体的单链可变区抗体基因,为临床上治疗Goodpasture综合征奠定实验基础.     

噬菌体抗体库技术应用研究进展

随着分子生物学技术的飞速发展,20世纪90年代出现的噬菌体抗体库技术在各个领域都得到了广泛的应用。 本文就噬菌体抗体库技术在制备人源化单克隆抗体、改良抗体性能以及面临的挑战和应用前景等方面进行简要综述。     

抗地高辛人源小分子抗体的构建

目的:将从大容量噬菌体抗体库中筛选得到的人源抗地高辛单链抗体进行分泌表达,并构建Diabody(双体抗体).方法:将抗地高辛的噬菌体抗体转染HB2151菌(无琥珀抑制基因的宿主菌),IPTG诱导,制备抗地高辛的可溶性单链抗体.选取活性较好的克隆进行基因改造,构建Diabody表达载体,并分泌表达,表达Diabody进行Western blot鉴定.结果:经ELISA结合活性测定,得到了结合活性较高的抗地高辛的可溶性单链抗体;基因改造后,经ELISA及Western blot测定证实获得了结合活性较好的抗地高辛Diabody.结论:实验获得了分泌表达活性可靠的人源性抗地高辛抗体,并改造成应用前景较好的Diabody,为临床诊断及治疗洋地黄类药物中毒提供具有实用价值的人源小分子抗体.     

人抗动物抗体及其对免疫分析的干扰

人抗动物抗体可引起临床不良反应，干扰动物源性抗体制剂治疗或成像，干扰免疫分析而引起假性结果。临床上可通过应用免疫抑制剂治疗和人源性抗体、聚乙二醇处理的抗体或体Ｆａｂ段制剂等方法防止人抗动物抗体应答形成；样品预处理或分析技术的改进可消除人抗动物抗体对免疫分析的干扰。目前已设计出了多种分析技术检测人抗动物抗体，并形成了检测试剂盒，甚至床边检验试剂。     

真核表达系统的抗体库技术研究进展

单克隆抗体(mAb)药物研制经历了鼠源性、人鼠嵌合、人源化改造以及全人源这4个阶段,其中全人源抗体因其免疫原性最低而得到相对广泛的应用。全人源抗体的制备主要包括转基因鼠技术和抗体库技术,在抗体库技术中主要包括基于原核表达系统的噬菌体技术和基于真核表达系统的核糖体技术、酵母技术以及哺乳动物细胞技术。本文主要综述了近些年来基于真核表达系统的抗体库技术的研究发展。     

噬菌体展示抗体库技术的研究进展及临床应用

治疗性抗体的发展,主要经历了异源性抗体、人源化抗体和人源性抗体几个阶段。目前,人源性抗体是治疗性抗体发展的主要方向,而噬菌体抗体库构建技术为人源性抗体的制备提供了良好的技术平台。噬菌体展示抗体库构建技术,是一种将抗体组合文库与噬菌体表面展示技术相结合所形成的新技术,是20世纪90年代初期抗体工程领域的一项重大进展,目前广泛应用于生物医学的多个方面。将就此技术的原理、分类、筛选方法及主要应用领域等方面进行综述。     

人源化Fab段噬菌体抗体库的构建及初步鉴定

目的:构建人天然Fab段噬菌体抗体库,为人源抗体的制备建立技术平台。方法:从正常健康人的外周血淋巴细胞中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增人抗体轻链和重链Fd段基因,构建噬菌体抗体库,酶切鉴定有无插入片段并测序分析,用IL-2和地高辛进行富集筛选。结果:最终构建的抗体库库容约为8.4×107,酶切鉴定显示有插入片段,抗体库重组率是70%,DNA测序分析证实抗体重链属IgG亚类,轻链为λ链。用IL-2和地高辛进行三轮筛选,抗体库均得到了不同程度的富集。结论:成功构建了一个天然的人源化噬菌体抗体库,可用于下一步胰淀素人源化抗体的筛选、纯化和表达。     

从半合成噬菌体抗体库中克隆抗地高辛人单链抗体1

目的从半合成噬菌体抗体库中克隆抗地高辛(Dig)人单链抗体(ADAScFv),为Dig中毒的诊断和治疗提供人源性抗体.方法1以改良法制备Dig-BSA偶联物;2以固相化的Dig-BSA偶联物对人噬菌体ScFv抗体库进行了4轮筛选,通过ELISA筛选出能结合Dig的抗体克隆并鉴定其活性,通过ELISA竞争抑制实验分析其特异性,对阳性克隆的DNA进行测序分析.结果1在对抗体库的筛选过程中可见有明显的富集;2获得一株可结合Dig及其类似物的阳性克隆;3阳性克隆的可变区分别属于VH5和Vλ1亚群.结论利用噬菌体抗体库技术获得了能与Dig及其它洋地黄类药物结合的人ADAScFv,经进一步分析及抗体工程改造后,有可能为临床上诊断及治疗洋地黄类药物中毒提供具有实用价值的人源性抗体.     

单克隆抗体治疗的过去、现在和未来

单克隆抗体不仅在基础研究和临床诊断中发挥着重要作用，单克隆抗体药物也在经历了鼠抗体的异源性和全抗体的大分子蛋白进入人体后引起免疫排斥和难于渗透组织的困顿之后，目前正以其“高度特异性”在临床显示出无可替代的优势。对抗体异源性的改造经历了人——鼠嵌合抗体、人源化抗体和基因库技术使人型抗体的生产走向可能。Fab片段有效解决了全抗体的大分子问题。单纯抗体和“生物导弹“已进入临床，分别通过中和或封闭靶分子与通过抗体的靶向作用使其携带的药物，细胞毒素，凋亡诱导剂或放射性核素等“生物导弹”定向于靶，发挥低毒高效的杀伤作用。