短小芽孢杆菌C-9葡聚糖内切酶基因的克隆及其在酿酒酵母中的表达

从短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)C-9中克隆得到葡聚糖内切酶基因,该基因包含1980 bp核苷酸,编码559个氨基酸,其N端有一个预测的29个氨基酸的信号肽序列;以YIp5质粒为骨架,构建rDNA介导的多拷贝整合载体,实现葡聚糖内切酶在酿酒酵母中的高效、稳定表达。与对照菌株相比,含有葡聚糖内切酶基因的重组酿酒酵母可以在以羧甲基纤维素为唯一碳源的培养基上生长。     

PML-RARα和hGM-CSF双基因表达载体的构建

目的:构建急性早幼粒细胞白血病(APL)PML-RARα基因与人粒巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)基因真核双表达载体,为利用DNA疫苗治疗APL奠定基础。方法:利用RT-PCR技术从NB4细胞的RNA中扩增出PML-RARα融合点附近的部分基因片段,通过PCR从pORF-hGM-CSF质粒中扩增出hGM-CSF基因,并分别将两基因片段连接到pIRES质粒的多克隆位点(MCS)A和B中,构建真核双表达载体。利用酶切和序列分析方法验证所构建载体的正确性。结果:NheI/M luI和XbaI/SalI双酶切证明重组质粒中含有相应大小的PML-RARα基因片段及hGM-CSF基因,且序列分析证明重组质粒中插入片段的碱基序列均完全正确。结论:成功构建了含有PML-RARα基因及hGM-CSF基因的真核双表达载体。     

史氏鲟（Acipenser schrenckii）两种促性腺激素β亚基的原核表达

 采用遗传工程方法,重组表达史氏鲟两种促性腺激素β亚基蛋白。选用原核表达载体pET－22b(+),分别插入史氏鲟GtHⅠ&;Ⅱβ亚基成熟肽cDNA序列,构建成C端含有6个组氨酸(6-His)融合蛋白标签的表达质粒;分别转化大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）并诱导表达2个基因。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示重组融合蛋白相对分子质量分别为：GtHⅠβ亚基大约14 000,GtHⅡβ亚基15 000左右。分别用抗6个组氨酸融合标签的单克隆抗体及兔抗鲟鱼GTH多克隆抗体对2个表达蛋白进行Western Blot分析,结果显示重组蛋白表达正确且有较高的免疫活性。GTHⅠβ重组蛋白在2 h就有明显的表达,6 h后随着时间增加表达量不再增加;25 ℃诱导重组蛋白产量比37 ℃诱导产量低。获得的重组蛋白质将可用于建立鲟鱼GtH的放射免疫测定方法。     

人类PIF1蛋白质N-末端多肽的表达纯化和

解螺旋酶参与几乎体内所有的DNA代谢,具有重要的生理功能.为了从分子水平阐述人类PIF1解螺旋酶的生理功能,我们以HeLa细胞的cDNA文库为模版,PCR扩增得到PIF1基因5′端含有1～534核苷酸的cDNA序列-PIFΔC.在PIFΔC的 5′端引入六组氨酸标签后插入pET15b表达载体,得到重组质粒pET15-PIFΔC.以此重组质粒转化RosettaTM 2(DE3)感受态细胞,使PIFΔC蛋白质在大肠杆菌中得到表达.在4℃通过快速液相色谱纯化系统,通过一系列色谱层析柱纯化了PIFΔC蛋白质.以纯化的PIFΔC蛋白质免疫家兔制备了抗血清,并检测了纯化的PIFΔC的生物化学活性.结果显示不含解旋酶模序的人类PIF1蛋白质的N-末端,具有使单链DNA复性的特性.PIF1解螺旋酶具有解开DNA双链和使双链DNA复性这一矛盾的特性,暗示了人类PIF1解螺旋酶可能参与损伤DNA的修复,包括断裂的双链DNA的修复.     

利用分离型内含肽DnaE表达抗菌肽

拟验证天然断裂内含肽Npu Dna E、Ssp Dna E的反式剪接反应对嵌合蛋白形成的影响,探讨依据此方法表达抗菌肽的可行性,规避抗菌生物表达中对宿主的毒害作用.将花蝉属抗菌肽ADP-1(Amblyomma defensin peptide 1)拆分为N端和C端两部分,其N端与断裂型内含肽Npu Dna E的N端融合,C端与Ssp Dna E的C端融合,并分别构建到原核表达载体p ET-23a(Amp+)和p ET-30a(Kan+)上,获得重组表达质粒p ET-23a-ADP-1-N-Npu和p ET-30a-Ssp-ADP-1-C,然后单独或共转化大肠杆菌感受态细胞BL21.实验结果表明,两个重组质粒分别单独或组合转化至Bl21(DE3),经IPTG诱导后,SDS-PAGE检测转化的菌株中都表达了目的蛋白,共转化的菌株诱导表达破菌后其上清液有抑菌活性.该实验验证以两种天然断裂型内含肽Ssp Dna E和Npu Dna E及搭载的ADP-1 N端和C端可在大肠杆菌中获得表达,且共转化的两段内含肽可在离体上清中发生反式剪接,促进融合在内含肽上的ADP-1两部分形成完整具有抑菌活性产物.     

类弹性蛋白多肽-红色荧光蛋白融合蛋白的表达纯化及细胞相容性

目的 构建携带红色荧光蛋白(mCherry)标签的类弹性蛋白(ELP)原核表达载体,并表达纯化ELP-mCherry融合蛋白,探讨ELP-mCherry融合蛋白与细胞的相容性.方法 对利用限制性内切酶Xba I和Xho I对mCherry质粒和pET28a-ELP载体同时进行双酶切,将酶切产物回收、连接并转化DH5α大...     

新疆绵羊β-乳球蛋白(BLG)5′端调控区的克隆与序列测定

用聚合酶链式反应(PCR)技术,从新疆绵羊全血中扩增了β-乳球蛋白5′端调控区890bp的片段.通过T4 DNA连接酶将其连接于质粒载体pGEM-T上,转化至受体菌DH5α中.提取质粒经PCR扩增、酶切鉴定,证明重组质粒pT-BLG中含有β-乳球蛋白5′端调控区基因片段.经核苷酸序列测定,克隆的片段与发表的基因序列高度一致.     

构建重组质粒的二步PCR方法

建立一种简单的重组质粒构建方法——二步PCR,不需要限制性内切酶对基因和载体进行酶切.第一步常规PCR中,用正向引物(IF)和反向杂合引物(IR)扩增黑曲霉木聚糖酶Xyn基因,IF与基因特异性匹配,IR引物3’端与基因序列匹配、5’端含有19 bp p ET20b一端正链序列;第二步反向PCR中,以扩增的Xyn基因作为正向引物,其3’端含有19 bp与环状p ET20b模板退火、并在高保真Q5 DNA聚合酶作用下延伸,与模板另一端互补的反向引物VR协同作用,重组质粒通过PCR扩增出来.反向PCR产物经T4 DNA连接酶环化,并经Dpn I限制性内切酶消解处理,可以直接转化BL21(DE3)感受态细胞.用这种方法将622、639、1125、1209 bp大小的基因重组p ET20b中,显示出有较广泛的普适性.     

苜蓿花叶病毒复制酶基因的克隆、序列分析及其植物表达载体的构建

以侵染苜蓿的苜蓿花叶病毒中国分离株(Alfalfa mosaic virus Chinese isolate，A1MV—Ch)RNA2为模板，利用人工合成的特异性引物，进行反转录及PCR扩增，分两段分别扩增了复制酶基因的5′端1．32kb和3′端及其非编码区的1．23kb cDNA序列．用限制性内切酶切割PCR产物后，与pUCl9重组，转化大肠杆菌DH5α，筛选重组质粒，用限制性内切酶分析及PCR鉴定，得到分别含有5′端序列和3′端序列的重组质粒。已由上述两种重组质粒构建了含有完整复制酶基因的重组质粒．进行了全序列测定，并与国外报道的A1MV-425株系的相应序列相比较，其复制酶基因编码区核苷酸序列同源性达97．8％，推测的氨基酸序列的同源性达97．6％，3′端非编码区核苷酸序列同源性为98．2％．并将全长复制酶基因与植物表达载体pROKⅡ重组，得植物转化载体pAlMV—FL．     

AK078438基因原核表达载体构建、多克隆抗体制备

AK078438基因是一个功能未知的新基因.通过RT-PCR方法扩增出AK078438基因的全长开放阅读框,构建了AK078438基因的原核表达载体.经诱导表达,亲和层析纯化该基因的融合蛋白并制备多克隆抗体.ELISA和Western blot结果表明我们成功的制备了AK078438基因的抗体,为后续该基因功能的研究做好了准备.     

乙型肝炎病毒x基因蛋白转导载体的构建

乙型肝炎病毒X蛋白在细胞转化和肝癌的发生发展中具有重要作用.为了深入研究X蛋白的致癌机理构建了pTAT-GFP-X载体.该研究以克隆在真核表达载体pCMV-X质粒中的x基因为模板,设计了x基因的PCR引物,采用PCR方法扩增x基因,回收PCR产物,以XhoI和EcoRI酶切位点将PCR产物连接到蛋白转导系统pTAT-GFP载体中,再用XhoI和EcoRI酶对筛选的重组子进行酶切鉴定,获得了510bp的目的片段,表明已成功地将目的片段克隆在pTAT-GFP载体中.经DNA序列分析检测,显示克隆的x基因无突变.经SDS-PAGE和Westernblot检测证实,将重组质料pTAT-GFP-X转化致大肠杆菌BL21中,可表达pTAT-GFP-X融合蛋白.该pTAT-GFP-X载体蛋白转导系统的构建,为进行X蛋白的蛋白转导实验奠定了基础.pTAT-GFP-X融合蛋白具有穿透细胞膜进入细胞的能力,进而在细胞内发挥作用,与转基因不同,无需细胞内基因表达的过程,使得X蛋白的定量实验成为可能,X蛋白的蛋白转导实验更有助于探讨x基因的致癌机理.     

IL18-IL2融合基因的克隆及其在大肠埃氏菌(E.coli)中的表达

构建IL-18和IL-2成熟区的融合基因IL18-IL2,并实现其在大肠埃氏菌中的大量表达.抽提经PHA刺激增殖的人淋巴细胞总RNA,RT-PCR法获得IL-18和IL-2基因的成熟区序列,并通过一段Linker相连得到融合基因IL18-IL2;将IL18-IL2克隆至原核表达载体pBV220,并转化至大肠埃氏菌BL21(DE3);阳性克隆经42℃温度诱导表达后用SDS-PAGE和Western blot分析重组蛋白的表达情况及正确性.经SDS-PAGE分析,融合基因IL18-IL2在宿主菌中能够表达,其相对表观分子质量约为34.5 kD;Western blot进一步证明重组蛋白正确.实验结果表明,已成功构建了表达人IL18-IL2的菌株,为进一步研究融合蛋白IL18-IL2体内外抗肿瘤活性提供了基础.     

高频等位基因HLA-A*1101重链胞外域-BSP融合蛋白原核表达载体的构建及表达鉴定

目的:构建HLA-A*1101重链胞外域羧基端融合生物素化酶B irA底物肽(BSP)的融合蛋白(HLA-A11-BSP)原核表达载体,并在大肠杆菌中表达该融合蛋白。方法:以RT-PCR法扩增并克隆HLA-A*1101重链基因的cDNA,以PCR方法构建HLA-A11-BSP的表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并以免疫印迹法进行鉴定。结果:从HLA-A2阴性的供者外周血单个核细胞中克隆到HLA-A*1101重链基因的cDNA,以此cDNA为模板,将编码HLA-A*1101重链胞外域1~276序列与编码BSP的序列融合,构建HLA-A11-BSP融合蛋白表达载体,重组质粒经测序验证。融合蛋白在BL21(DE3)中诱导后获得高效表达,约占菌体总蛋白的20%;其相对分子质量约为35 000,与理论值一致。免疫印迹分析显示表达产物主要存在于包涵体中,上清液中几乎无任何产物存在。结论:成功构建表达HLA-A11-BSP融合蛋白的原核表达载体,该融合蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式获得高水平表达。     

GST-hBLyS融合蛋白基因的构建及其在大肠杆菌中的表达

根据hBLyS (humanBlymphocytestimulator)基因序列设计合成特异性引物 ,用RT_PCR从人外周血淋巴细胞扩增出 85 8bp的hBLyS基因 ,并将其插入到融合蛋白原核表达载体 pGEX_4T_1中 ,得到重组表达质粒pGEX_4T_1/hBLyS。把此重组质粒转化大肠杆菌BL2 1,经用IPTG诱导 ,表达出了GST_hBLyS融合蛋白。     

丙型肝炎病毒NS3基因真核质粒的构建及其在人肝细胞中的诱导表达

目的：进行丙型肝炎病毒非结构蛋白3基因真核表达载体的构建,并分析其在体外培养的人肝细胞中的表达。方法：从含有丙肝病毒全长基因的重组质粒pBRTM／HCV1-3011表达载体中PCR扩增出HCVNS3基因片段,将其与表达载体pcDNA3．1（-）重组,得到重组的真核表达载体pcDNA3．1（-）／NS3。然后采用阳离子多聚体将其转染人肝细胞QSG7701,以免疫组织化学SP法及Western Blotting检测HCVNS3蛋白的表达。结果：所得到的NS3片段正确,序列正确,所构建的真核质粒成功转染QSG7701细胞并表达蛋白,表达的NS3蛋白相对分子质量为70000。结论：成功构建了丙型肝炎病毒非结构蛋白3基因的真核表达载体pcDNA3．1（-）／NS3,并且该载体在体外培养的人肝细胞中能有效表达特异性HCVNS3蛋白。     

HLA-A*0207重链胞外区原核表达载体的构建及表达

目的：克隆HLA-A*0207(A2)重链基因，构建在羧基端融合生物索化酶BirA底物肽(BirA substrate peptide，BSP)的A2重链胞外区原核表达载体，在大肠杆菌中进行表达。方法：以RT-PCR方法从HLA-A2^ 供白细胞中克隆A2基因并进行DNA测序，并以PCR方法构建在羧基端融合BSP的A2重链胞外区表达载体，在大肠杆菌B121(ED3)中进行表达。结果：从31名HLA-A2^ 供白细胞中克隆到的基因经DNA测序显示，只有从供2得到的基因是HLA-A*0207。将编码该基因编码重链胞外区1-275的序列和编码BSP的序列融合，构建融合蛋白表达载体，并以测序验证。融合蛋白在B121(ED3)中获得高效表达，产物相对分子质量为35000，约占菌体总蛋白的30％，主要存在于包涵体中，对包涵体进行洗涤后得到纯度为80％的重组蛋白。结论：成功克隆HLA-A*0207基因，构建了其胞外区和BSP融合蛋白表达载体并在大肠杆菌中获得高效表达。     

水稻磷酸酯酶2A基因蛋白的原核表达载体构建、表达和纯化

利用PCR技术,从水稻品种日本晴幼穗cDNA中扩增磷酸酯酶2A的基因ORF片段,并将其克隆入原核表达载体pGEX-6p-1中构建重组质粒pGEX-6p-1-PP-2A,经限制性内切酶酶切鉴定以及测序结果表明成功构建了原核表达载体pGEX-6p-1-PP2A。转化E.coli JM109并通过终浓度为0．4mmol／L的IPTG诱导,表达出39kD的CST-PP2A融合蛋白,并用蛋白亲和层析柱GSTrap FF对表达产物进行纯化,为下一步的研究打下了实验基础。     

Kluyveromyces lactis killer toxin inhibits adenylate cyclase of sensitive yeast cells

K1 killer toxin secreted by the K1 strain of Saccharomyces cerevisiae, has been well characterized. It is a simple protein of molecular weight (MW) 11,470 (ref. 3), encoded by a double-stranded, linear RNA plasmid, called M RNA, of MW 1.1-1.7 x 10(6) (refs 4-6). It is lethal to sensitive Saccharomyces cerevisiae which does not carry M RNA. Leakage of K+ and ATP is the first distinct response in sensitive cells, and the toxic action is thought to be due to its action as a protonophore or K+ ionophore. Recently, a further killer toxin has been found in Kluyveromyces lactis IFO 1267, and it is associated with the presence of the double-stranded linear DNA plasmids, pGK1-1 (MW 5.4 x 10(6)) and pGK1-2 (MW 8.4 x 10(6)). It has been shown, by curing pGK1-1 or deletion mapping, that the structural gene for the killer toxin and immunity-determining gene reside on the smaller plasmid. Moreover, the plasmids could be transferred from K. lactis to S. cerevisiae by protoplast fusion and protoplast transformation. As the K. lactis toxin is encoded by a DNA plasmid and has a relatively wider action spectrum than K1 killer toxin, the mode of action of the toxin is highly interesting. Here we report that K. lactis toxin inhibits adenylate cyclase in sensitive yeast cells and brings about arrest of the cells at the G1 stage.