人肿瘤坏死因子—α基因真核表达载体的构建

目的：构建可在真核细胞内表达人肿瘤坏死因子alpha(hTNF—α)基因的真核表达载体。方法：应用RT—PCR的方法从足月妊高征患者的胎盘组织中，扩增出hTNF—αcDNA，连接至载体pMD l8—T vec-tor中，经酶切鉴定与序列测定证实后，以亚克隆法构建于真核表达载体pcDNA3．1-mvc-hjs(—)A，B，C的相应酶切位点，通过RT—PCR方法检测其在体外转导绒癌耐药细胞后hTNF—α基因的表达。结果：自胎盘中克隆的hTNF—α cDNA经序列测定证实，与Genbank的序列完全一致；用EcoR I和Ⅱind Ⅲ双酶切鉴定证实，克隆基因正确插入载体pcDNA3．1-myc-hjs(—)A，B，C。经脂质体介导转导绒癌耐药细胞后，检测到其在转导的细胞中稳定表达。结论：通过DNA重组技术成功地构建了可在体外稳定表达hTNF—αcDNA全长的真核表达载体。     

人肿瘤坏死因子-α基因真核表达载体的构建

目的 :构建可在真核细胞内表达人肿瘤坏死因子alpha(hTNF α)基因的真核表达载体。方法 :应用RT PCR的方法从足月妊高征患者的胎盘组织中 ,扩增出hTNF αcDNA ,连接至载体pMD 18 Tvec tor中 ,经酶切鉴定与序列测定证实后 ,以亚克隆法构建于真核表达载体pcDNA3.1 myc his(- )A ,B ,C的相应酶切位点 ,通过RT PCR方法检测其在体外转导绒癌耐药细胞后hTNF α基因的表达。结果 :自胎盘中克隆的hTNF αcDNA经序列测定证实 ,与Genbank的序列完全一致 ;用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定证实 ,克隆基因正确插入载体pcDNA3 1 myc his(- )A ,B ,C。经脂质体介导转导绒癌耐药细胞后 ,检测到其在转导的细胞中稳定表达。结论 :通过DNA重组技术成功地构建了可在体外稳定表达hTNF αcDNA全长的真核表达载体     

分泌人肿瘤坏死因子α的基因工程细胞系的建立

目的:建立稳定的基因工程细胞系.方法:将含有人肿瘤坏死因子α(hTNFα)全长cDNA插入表达载体pSNAV2.0,产生重组质粒pSNAV2.0-TNFα,利用阳离子脂质体介导将其转染到人HEK-293细胞中,G418筛选阳性克隆hTNF/293,采用Western blot检测转染细胞上清中hTNF蛋白的表达.结果:通过Sal I和EcoR I双酶切、PCR及测序鉴定证明:在质粒pSNAV2.0中插入片段正确.采用RT-PCR和Western blot法检测表明HEK-293细胞培养上清中有hTNFct蛋白表达,分子量为17KDa.结论:成功构建重组质粒pSNAV2.0-TNFα,真核表达载体构建正确,转染HEK-293细胞后可有效分泌hTNFα蛋白,并能分泌到细胞外.     

人微管不稳定蛋白基因真核表达载体的构建与表达及对食管癌细胞的作用

目的 构建人微管不稳定蛋白基因(stathmin)真核表达载体,研究其对食管癌细胞EC9706的作用.方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增stathmin cDNA,克隆至pMDl8-T载体并酶切鉴定后,亚克隆至pEGFP-C2真核表达载体.将测序鉴定正确的重组载体和空载体经脂质体转染EC9706细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞株.通过荧光显微镜观察转染细胞荧光蛋白的表达,采用Western blot检测转染细胞中增强型荧光蛋白(EGFP)和stathmin融合蛋白的表达.选取稳定转染的细胞株,采用细胞计数法绘制细胞生长曲线,采用流式细胞仪分析细胞的增殖状态,平板克隆形成实验、裸鼠移植瘤实验分析转染细胞成瘤性.结果 RT-PCR扩增获得450 bp的cDNA编码序列;克隆至pMD18-T载体,经酶切鉴定后获反向插入质粒;亚克隆至pEGFP-C2载体后,经酶切与测序鉴定,重组载体pEGFP-stathmin构建成功.重组载体和空载体转染EC9706细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞株.通过荧光显微镜观察到,转染细胞中呈现绿色荧光;经Western blot证实,重组载体表达46 000的融合蛋白.与空载体转染细胞相比,转染重组载体的EC9706细胞形态变大,增殖速度减慢,细胞分裂阻滞于G2/M期,细胞克隆形成数减少,裸鼠体内成瘤性降低(P＜0.05).结论 构建的真核表达载体pEGFP-stathmin在食管癌EC9706细胞中能够稳定表达,并抑制肿瘤细胞的增殖和成瘤性.     

分泌人肿瘤坏死因子α的基因工程细胞系的建立

目的：建立稳定的基因工程细胞系。方法：将含有人肿瘤坏死因子α（hTNFα）全长cDNA插入表达载体pSNAV2．0，产生重组质粒pSNAV2．0-TNFα，利用阳离子脂质体介导将其转染到人HEK-293细胞中，G418筛选阳性克隆hTNF／293，采用Western blot检测转染细胞上清中hTNF蛋白的表达。结果：通过Sal Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切、PCR及测序鉴定证明：在质粒pSNAV2．0中插入片段正确。采用RT—PCR和Western blot法检测表明HEK-293细胞培养上清中有hTNFα蛋白表达，分子量为17KDa。结论：成功构建重组质粒pSNAV2．0-TNFα，真核表达载体构建正确，转染HEK-293细胞后可有效分泌hTNFα蛋白，并能分泌到细胞外。     

分泌型核心蛋白聚糖真核表达载体的构建及在HepG2细胞中的表达

目的构建分泌型核心蛋白聚糖(decorin)真核表达载体,并在肝癌细胞HepG2中表达,为研究核心蛋白聚糖的抗肿瘤作用奠定基础。方法利用特异性引物,应用PCR技术扩增核心蛋白聚糖全长基因cDNA片段,与pcDNA3.1载体进行连接,并转化到大肠杆菌JM109中扩增以获得重组载体,应用双酶切、PCR以及测序鉴定此重组载体;脂质体介导重组载体转染HepG2,经G418筛选建立稳定转染细胞株,分别采用RT-PCR、免疫组化法和westernblot检测其表达。结果获得了约1080bp大小的特异性DNA片段;PCR产物与真核表达载体进行连接,经过双酶切、PCR以及测序鉴定证实分泌型核心蛋白聚糖cDNA片段正确插入真核表达载体pcDNA3.1中。RT-PCR方法可见转染组mRNA表达明显增多,免疫组化和westernblot方法可见转染组细胞decorin蛋白表达明显增高。结论成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-decorin,建立了稳定转染decorin的HepG2细胞株。     

真核表达载体pEGFP-N1-Ubc9的构建及表达

目的：克隆人类Ubc9基因cDNA全长,构建Ubc9的真核表达载体并表达。方法：采用RT-PCR技术从人小细胞肺癌NCI-H446细胞总RNA中扩增Ubc9 cDNA基因片段,经过酶切鉴定后,克隆至pUCM-T载体,测序证实碱基序列无误后,再克隆至真核绿色荧光蛋白表达载体（pEGFP-N1）上,并转染到真核细胞,观察其在真核细胞中的表达。结果：测序证实克隆的Ubc9全长cDNA阅读框正确完整,酶切和序列测定证实Ubc9正确插入pEGFP-N1载体中,该重组载体能够在真核细胞中表达。结论：成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-Ubc9。     

真核表达载体pEGFP-N1-Ubc9的构建及表达

目的:克隆人类Ubc9基因cDNA全长,构建Ubc9的真核表达载体并表达。方法:采用RT-PCR技术从人小细胞肺癌NCI-H446细胞总RNA中扩增Ubc9 cDNA基因片段,经过酶切鉴定后,克隆至pUCM-T载体,测序证实碱基序列无误后,再克隆至真核绿色荧光蛋白表达载体(pEGFP-N1)上,并转染到真核细胞,观察其在真核细胞中的表达。结果:测序证实克隆的Ubc9全长cDNA阅读框正确完整,酶切和序列测定证实Ubc9正确插入pEGFP-N1载体中,该重组载体能够在真核细胞中表达。结论:成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-Ubc9。     

人PTEN基因表达载体的构建及其在U251细胞中的表达

背景与目的:克隆人野生型和突变型PTEN的cDNA并构建其表达载体,探讨该表达质粒在人星形胶质瘤细胞U251中的表达情况.材料与方法:分别从新鲜胎盘组织和结肠癌组织中提取总RNA,采用RT-PCR的方法扩增人野生型和突变型PTEN基因全长cDNA,分别克隆入pMD 18-T载体上,经PCR、酶切鉴定均为阳性的克隆,进行核苷酸序列分析.再分别将两段基因定向克隆入pcDNA3.1( )载体中构建表达载体,转染入U251细胞.结果:成功克隆了人野生型及突变型PTEN cDNA并成功构建其表达载体,发现突变型PTEN蛋白对细胞生长无明显抑制作用,而野生型PTEN蛋白对细胞生长有明显抑制作用.结论:PTEN可能能抑制肿瘤细胞生长,为后进一步开展PTEN对肿瘤相关功能的研究奠定基础.     

前列腺特异膜抗原基因的克隆和真核表达

目的克隆前列腺特异膜抗原(PSMA)基因的编码区序列,并进行真核表达.方法用RT-PCR方法扩增前列腺癌组织标本中的PSMA cDNA序列,并将其克隆至真核表达载体pcDNA3.0.用脂质体转染法,把pcDNA3.0-PSMA转染哺乳动物细胞,鉴定PSMA蛋白的表达.结果序列测定结果表明,两条引物之间的片断长度为2279 bp,与预期长度一致.将克隆的编码区序列与Genebank的PSMA序列进行Blast对比分析,同源性为99.7%;间接免疫荧光法显示表达的蛋白质为膜蛋白,免疫印迹表明表达蛋白质的分子量为100 000.结论利用RT-PCR技术成功扩增了PSMA编码区序列,经序列分析显示扩增片断的序列正确.构建了PSMA真核表达载体,建立了PSMA稳定表达的细胞株.经免疫分析,证实了真核细胞内表达的PSMA为分子量正确的膜蛋白,且具有良好的抗原性.所获得的PSMA真核表达系统为进一步研究PSMA基因修饰的DCs疫苗对前列腺癌的治疗提供了物质基础.     

表达Tie2的单核细胞在肿瘤研究中的进展

表达Tie2的单核细胞(TEM)仅存在于外周血及肿瘤组织中,在肿瘤血管生成中发挥重要作用.TEM能够被血管生成素2(Ang2)及缺氧化学信号募集进入肿瘤组织,分化成表达Tie2的巨噬细胞,通过旁分泌作用参与肿瘤血管生成.肝癌、结肠癌、乳腺癌、恶性胶质瘤等肿瘤中检测到TEM水平升高,这对于肿瘤的诊断及预后判断有一定的提示作用.近年研究发现,TEM可用于抗肿瘤药物的靶向递送,能有效抑制肿瘤的生长和转移,同时TEM也是抗肿瘤治疗的潜在靶点.然而TEM在肿瘤微血管密度、临床分级及预后判断中的作用并不明确,目前针对TEM具体功能的探究引起了学者的广泛关注.     

Reversible lymphomagenesis in conditionally c-MYC expressing mice

It is well documented that deregulation of MYC leads to tumor development, yet many aspects of this process are only partially understood. We have established a transgenic mouse model in which c-MYC is conditionally expressed in lymphoid cells using the tetracycline-regulated system of gene regulation. Mice with continuously expressed transgenic c-MYC died of invasive T- or B-cell lymphomas within 4 months. Lymphomas developing in transgenic mice were c-MYC dependent since doxycycline treatment led to tumor regression. Using transplantation of established tumor cell lines labeled with GFP, we followed the fate of neoplastic cells in recipients upon MYC inactivation. This approach allowed us to elucidate both apoptosis and differentiation as mechanisms of tumor elimination. Comparative genomic hybridization (CGH) and FISH analyses were performed in order to analyze possible chromosomal aberrations induced by c-MYC. We observed that overexpression of c-MYC is sufficient to induce recurrent patterns of genomic instability. The main observation was a gain of genomic material that corresponded to chromosome 15 in several T-cell tumors, which could be identified as trisomy.     

Anti-tumor efficacy of gene vaccine expressing PSMA

Objective  

To observe anti-tumor eff ects of PVAX-PSMA gene vaccine.     

Murine spontaneous T-cell leukemia constitutively expressing IL-2 receptor--a model for human T-cell malignancies expressing IL-2 receptor

We describe a new, spontaneously occurring BALB/c-derived murine T-cell leukemia. The leukemic cells, designated LB, grow rapidly and progressively in the syngeneic host with no signs of effective immunological resistance. LB cells expressed the Thy-1+, Lyt-2+, L3T4-, CD3- class-I+, CD25+ (IL-2 receptor, IL-2R), class-II-, gp70- phenotype. As LB cells express IL-2, as indicated by staining with 2 distinct anti-CD25 IL-2R monoclonal antibodies (MAbs), the therapeutic efficacy of IL-2-diphtheria toxin-related protein was tested on this leukemic model. IL-2-diphtheria toxin, but not diphtheria toxin, efficiently inhibited the proliferation of LB cells. The proliferation of a murine myeloma cell line, which does not express IL-2R, was not inhibited by IL-2-diphtheria toxin. The possible implantation of this animal model in fundamental and practical studies is discussed.     

MDR1 RNAi表达克隆的质粒构建

目的:构建针对多药耐药基因(MDR1)的RNA干扰(RNAi)表达克隆质粒。方法:采用Invitrogen公司的Block-i TTMU6RNAi Entry Vector Kit和BLOCK-i T Lentiviral RNAi Expres-sion System生产表达克隆质粒。针对MDR1人工设计合成一段寡核苷酸,依照试剂盒说明书分别构建MDR1entryclone质粒和表达克隆质粒。以MDR1entry clone质粒瞬时转染MCF-7/ADM细胞株,MTT法测细胞对ADM的耐药性及流式细胞仪测试P-gp表达情况。抗生素筛选表达克隆、抽提质粒电泳鉴定。结果:测序证实MDR1entry clone质粒构建正确,无任何突变.转对照质粒组和转MDR1entry clone质粒组,P-gp表达水平分别为(31.97±1.2)%和(7.88±0.5)%,IC50分别为1.27和0.4μg/mL。两组比较,P-gp表达和IC50差异均有统计学意义,P均<0.05。抗生素筛选显示转化克隆对氯霉素敏感、对氨苄青霉素具抗性,抽提质粒琼脂糖凝胶电泳显示重组质粒大小符合设计要求。结论:MDR1entry clone质粒和表达克隆质粒构建正确,为进一步阻断MDR1基因表达逆转肿瘤多药耐药奠定了基础。     

Genetically engineered T cells to target EGFRvIII expressing glioblastoma

Glioblastoma remains a significant therapeutic challenge, warranting further investigation of novel therapies. We describe an immunotherapeutic strategy to treat glioblastoma based on adoptive transfer of genetically modified T-lymphocytes (T cells) redirected to kill EGFRvIII expressing gliomas. We constructed a chimeric immune receptor (CIR) specific to EGFRvIII, (MR1-ζ). After in vitro selection and expansion, MR1-ζ genetically modified primary human T-cells specifically recognized EGFRvIII-positive tumor cells as demonstrated by IFN-γ secretion and efficient tumor lysis compared to control CIRs defective in EGFRvIII binding (MRB-ζ) or signaling (MR1-delζ). MR1-ζ expressing T cells also inhibited EGFRvIII-positive tumor growth in vivo in a xenografted mouse model. Successful targeting of EGFRvIII-positive tumors via adoptive transfer of genetically modified T cells may represent a new immunotherapy strategy with great potential for clinical applications. Szofia S. Bullain, Ayguen Sahin and Oszkar Szentirmai contributed equally.     

表达小干扰RNA的条件增殖腺病毒与肿瘤

RNA干扰（RNAi）是一种由双链RNA介导的基因沉默现象。RNAi作为强有力的研究工具正在基因功能组学领域掀起一场真正的革命，也成为当今肿瘤基因治疗研究的热点。条件增殖腺病毒（CRAd）是一类仅在肿瘤细胞内特异增殖新型腺病毒载体，通过CRAd介导的小干扰RNA（siRNA）可以靶向肿瘤细胞，且随着病毒增殖反复表达siRNA，进一步加强siRNA介导的癌基因沉默效果。因此，siRNA-CRAd模式开辟了肿瘤基因治疗的新途径。