内质网应激在氧化三甲胺促人脐静脉内皮细胞氧化应激中的作用

目的:探讨内质网应激是否参与氧化三甲胺(TMAO)促人脐静脉内皮细胞(HUVECs)氧化应激的过程。方法:体外培养HUVECs;CCK-8法测定细胞活力;DCFH-DA染色、倒置相差荧光显微镜观察及流式细胞术检测内皮细胞内活性氧簇(ROS)水平;Western blot法检测内皮细胞中phospho-IRE-1α、IRE-1α和GRP78/BiP的蛋白水平。结果:TMAO未表现出对HUVECs活力有显著影响;作用较长时间(>24 h),较低浓度(10μmol/L)的TMAO即可引起原代HUVECs氧化应激增加(P<0.05);TMAO可引起HUVECs IRE-1α磷酸化水平和GRP78/BiP蛋白水平显著升高(P<0.01);IRE1α特异性抑制剂STF-083010预处理1 h可缓解TMAO促HUVECs氧化应激作用(P<0.05)。结论:内质网应激参与了TMAO致HUVECs氧化应激的过程。     

同型半胱氨酸硫内酯-内质网应激途径促进HUVECs黏附

目的探讨同型半胱氨酸硫内酯(HTL)通过内质网应激途径促人脐静脉内皮细胞(HUVECs)黏附的可能机制。方法取HTL处理的大鼠胸主动脉,检测NF-κB p65的表达;用Western blot检测HUVECs中HTL,分别对其进行时效与量效处理后,所谓检测内质网应激蛋白Bip和Chop及黏附蛋白VCAM-1和ICAM-1的表达,以及内质网应激激动剂与抑制剂对HTL诱导的HUVECs黏附因子表达的影响;用"STRING"预测Bip(HSPA5)和Chop(DDIT3)与黏附因子VCAM-1和ICAM-1的相互作用。结果 HTL诱导大鼠胸主动脉血管的内皮细胞NF-κB p65表达,促HUVECs的内质网应激蛋白Bip和Chop及黏附因子VCAM-1和ICAM-1的表达(P0.05),内质网激动剂上调HTL对黏附因子的表达,内质网抑制剂抑制HTL对黏附因子的表达(P0.05);"STRING"软件预测内质网应激蛋白Bip和Chop与黏附因子VCAM-1和ICAM-1具有相互作用。结论 HTL可能通过内质网应激途径促进HUVECs黏附。     

Vaspin对HUVECs中TNF-α介导的NF-κB和PI3K/Akt信号通路的影响

目的探讨Vaspin对TNF-α介导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)NF-κB和PI3K/Akt信号通路的影响。方法体外分离并培养HUVECs。NF-κB荧光酶报告质粒瞬时转染HUVECs,用不同浓度(0~320μg/L)Vaspin预培养,随后用10μg/L的TNF-α作用于HUVECs,荧光酶报告分析法测定NF-κB的转录活性。Western blot测定磷酸化的Akt水平。ELISA测定细胞上清液中IL-1及IL-6的浓度。Real-time PCR、Western blot检测细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)及单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的mRNA和蛋白表达水平。结果在HUVECs中,Vaspin抑制TNF-α介导的NF-κB转录活性(P0.05),并且NF-κB下游因子IL-1、IL-6、ICAM-1、VCAM-1和MCP-1的表达降低(P0.05)。Vaspin增加了炎性因子TNF-α介导的磷酸化的Akt水平(P0.05)。结论 Vaspin抑制HUVECs中TNF-α介导的NF-κB信号通路,增强TNF-α介导的PI3K/Akt信号通路的传导。     

P38MAPK在脂多糖引起的腹膜间皮细胞损伤中的作用

目的探讨脂多糖(LPS)引起人腹膜间皮细胞(HPMC)损伤中分泌MCP-1以及LPS、P38MAPK、MCP-1三者之间可能存在的关系。方法体外培养永生化人腹膜间皮细胞(HPMC),随机分为正常对照组、LPS作用24 h组、LPS作用48 h组、特异性P38MAPK阻断剂SB203580+LPS作用24 h组、SB203580+LPS作用48 h组;Western blot法检测各组MCP-1和磷酸化P38MAPK蛋白表达水平;Real-time PCR法检测各组MCP-1 mRNA表达水平。结果 1.10 mg/L LPS刺激使HPMC的MCP-1 mRNA和蛋白质表达均较正常对照组增加(P0.05)。10 mg/L LPS作用48 h后MCP-1 mRNA和蛋白质表达水平均高于24 h组(P0.05);Western blot结果显示,与正常组对比,10 mg/L LPS作用使磷酸化P38MAPK蛋白水平明显升高(P0.05)。10 mg/L LPS作用48 h与作用24 h对比升高不明显(P0.05);经5μmol/L SB203580预处理30 min后再予以LPS刺激与单纯LPS刺激相比较,MCP-1蛋白质和mRNA均明显降低(P0.05);SB203580预处理后再予以LPS分别刺激24 h和48 h 2组相比较,MCP-1蛋白及mRNA水平差异不明显(P0.05)。结论 LPS通过磷酸化P38MAPK,导致MCP-1表达水平升高,诱发腹膜间皮细胞的损伤。     

FABP4沉默通过调节PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路对妊娠糖尿病大鼠内质网应激和胰岛素抵抗的影响

目的：探讨脂肪酸结合蛋白4(FABP4)沉默通过调节蛋白激酶R样内质网激酶（PERK）/真核细胞启动因子2α(eIF2α)/转录因子4(ATF4)/C/EBP同源蛋白（CHOP）信号通路对妊娠糖尿病（GDM）大鼠内质网应激（ERS）和胰岛素抵抗（IR）的影响。方法：腹腔注射链脲佐菌素（STZ）建立GDM大鼠模型。通过尾静脉注射FABP4 siRNA质粒（si-FABP4）、阴性对照质粒（NC）和PERK激活剂（CCT020312）,将大鼠随机分为Normal组、GDM组、GDM+NC组、GDM+si-FABP4组、GDM+si-FABP4+CCT020312组。检测胰腺组织中FABP4含量、血脂水平、炎症标志物水平和氧化应激标志物水平,检测胰腺组织中PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路相关蛋白表达。HTR-8/SVneo细胞分为5组：对照（Control）组、高糖（HG）组、HG+NC组、HG+siFABP4组、HG+si-FABP4+CCT020312组,24 h后检测细胞中FABP4及PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路相关蛋白表达。结果：与Normal组相...     

曲格列汀改善高糖条件下人脐静脉内皮细胞氧化应激水平

目的:观察曲格列汀在高糖条件下对人脐静脉内皮细胞氧化应激水平的影响,并初步探讨其分子机制。方法:在正常葡萄糖浓度(5 mmol/L)及高糖(25 mmol/L)条件下培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),并在此期间分别加入1、5、10μmol/L曲格列汀作用24 h。随后CCK-8实验测定细胞增殖情况,荧光探针检测细胞内活性氧(ROS)变化,RT-qPCR以及Western blot分别检测NAD(P) H氧化酶和Nrf2及相关基因HMOX和NQO1的mRNA或蛋白表达水平以及内质网应激相关分子Bip1/Grp78、PDI、Ero1-Lα、Calnexin、IRE-1α和p-eIF2α表达的变化。结果:1、5和10μmol/L曲格列汀作用细胞24 h并不能降低其活性,但可有效降低高糖调剂下细胞内的ROS水平。曲格列汀处理也能明显抑制NAD(P) H氧化酶p22phox亚基mRNA的表达,并能抑制细胞核内核转录因子Nrf2的水平以及上调氧化应激相关基因HMOX和NQO1的表达。此外,高糖条件下内质网应激相关分子Bip1/Grp78、PDI、Ero1-Lα、Calnexin、IRE-1α和p-eIF2α表达水平明显增高,给予曲格列汀处理后,这些分子表达水平明显减少。结论:曲格列汀能增加高糖条件下人脐静脉内皮细胞Nrf2相关基因的表达并减轻内质网应激水平。     

心肌梗死后心力衰竭小鼠心肌组织内质网应激相关凋亡途径的研究

目的:探讨心肌梗死后心力衰竭小鼠心肌组织内质网应激介导的凋亡途径。方法:结扎小鼠左冠状动脉前降支建立心肌梗死后心力衰竭(心衰)模型,32只小鼠利用随机数字法分4组:假手术组、心肌梗死后2周组、4周组和6周组,采用超声心动图检查观察心室扩张及心功能变化情况,Western blotting检测内质网分子伴侣GRP78蛋白以及内质网应激相关凋亡蛋白CCAAT/增强子结合蛋白ε(CCAAT/enhancer-binding proteinε,CHOP)、c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)及其磷酸化水平、caspase-12及其活性剪切片段的表达。采用TUNEL法观察心肌细胞的凋亡情况。结果:与假手术组相比较,心肌梗死后心力衰竭的小鼠左心室扩大,心功能下降。小鼠心肌组织GRP78、CHOP蛋白表达增高(P0.05)。JNK、caspase-12蛋白表达没有明显变化,但其活化形式磷酸化JNK及剪切后的caspase-12表达增高(P0.05)。TUNEL染色显示心肌梗死后心力衰竭的小鼠心肌组织凋亡明显增多(P0.05)。结论:心肌梗死后心力衰竭诱导内质网应激反应,并伴随着其相关的CHOP、JNK、caspase-12三条通路的激活,提示内质网应激可能参与了心梗后心衰中心肌细胞的凋亡。     

乔松素对内质网应激所致内皮细胞凋亡的抑制作用及机制

目的:探讨乔松素对内质网应激(ERS)诱导剂衣霉素(TM)所致人脐静脉内皮细胞(HUVECs)凋亡的抑制作用及其机制。方法:体外培养HUVECs,分别给予6. 25、12. 5和25 mg/L乔松素预处理1 h,再加入TM(10mg/L)继续培养24 h。分别采用MTT法和Annexin V-FITC/碘化丙啶(PI)双染法检测细胞活力和细胞凋亡情况;采用试剂盒测定培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性,并采用Hoechst 33342/PI双染法检测细胞膜损伤情况;采用Western blot法检测ERS标志分子葡萄糖调节蛋白78(GRP78)和ERS凋亡途径关键蛋白C/EBP同源蛋白(CHOP)的表达情况,以及蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)和真核翻译起始因子2α(eIF2α)的磷酸化水平;免疫荧光细胞化学法检测活化转录因子6(ATF6)的核转位情况。结果:乔松素(12. 5和25 mg/L)预处理显著抑制TM所诱导的细胞活力降低、LDH漏出、PI阳性细胞率和凋亡率增加(P0. 05或P0. 01)。TM显著上调GRP78和CHOP的蛋白表达水平,且促进其上游调控蛋白PERK和e IF2α磷酸化及ATF6核转位,而乔松素显著拮抗TM所致的上述变化,并呈剂量依赖性(P0. 05或P0. 01)。结论:乔松素可减轻ERS诱导的HUVECs凋亡,其机制可能与抑制ATF6/PERK-CHOP信号通路的活化有关。     

CHOP在索拉菲尼联合辛二酰苯胺异羟肟酸诱导人肝癌细胞MHCC97L凋亡中的作用

目的:探讨CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)在索拉菲尼联合辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)诱导人肝癌细胞MHCC97L凋亡中的作用。方法:采用CCK-8法检测索拉菲尼联合SAHA对MHCC97L细胞活力的影响;采用流式细胞术检测索拉菲尼联合SAHA对细胞周期及细胞凋亡的影响;应用Western blot法检测索拉菲尼联合SAHA对MHCC97L细胞中内质网应激相关分子葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)、p-PERK、活化转录因子4(ATF4)及CHOP蛋白表达的影响。此外,应用CHOP siRNA沉默CHOP后,采用流式细胞术观察索拉菲尼联合SAHA对MHCC97L细胞凋亡的影响。结果:索拉菲尼联合SAHA可使MHCC97L细胞活力明显下降(P<0.05),细胞周期结果显示细胞生长被阻滞在G 1期;Western blot结果显示索拉菲尼联合SAHA可显著上调上述内质网应激凋亡通路中相关蛋白的表达,同时流式细胞术检测发现索拉菲尼联合SAHA可显著促进MHCC97L细胞凋亡(P<0.01);CHOP siRNA能显著抑制索拉菲尼联合SAHA诱导的细胞凋亡。结论:索拉菲尼联合SAHA可显著抑制MHCC97L细胞生长并诱导其凋亡,机制可能与上调内质网应激凋亡通路中CHOP的表达有关。     

靶向GRP78增强小鼠抗TfR单克隆抗体抑制神经胶质瘤细胞增殖

目的研究抗转铁蛋白受体(TfR)抗体作用于胶质瘤细胞是否会诱导内质网(ER)应激,以及靶向应激分子葡萄糖调节蛋白78(GRP78)能否促进抗TfR抗体的抗瘤效应。方法 Western blot检测抗TfR抗体作用胶质瘤细胞后GRP78和CHOP的表达。构建针对GRP78的小干扰RNA,小干扰RNA转染胶质瘤细胞后与抗TfR抗体共孵育,流式细胞计量术(FCM)检测肿瘤细胞的增殖和凋亡。结果抗TfR抗体能够诱导ER应激反应,提高胶质瘤细胞GRP78和CHOP的表达水平。与对照组相比,转染针对GRP78的小干扰RNA的胶质瘤细胞与抗TfR抗体作用后,增殖显著减少,凋亡显著增加(P0.05)。结论抗TfR抗体的抗肿瘤作用触发了内质网应激反应,沉默应激分子GRP78的表达,可增强抗TfR抗体的抗瘤效应。     

抗衰老Klotho蛋白减轻大鼠乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤

目的:观察抗衰老Klotho蛋白对大鼠乳鼠原代心肌细胞缺氧/复氧(H/R)损伤的作用并探讨其作用机制。方法:建立大鼠乳鼠心肌细胞H/R模型,并将心肌细胞分为正常对照组、H/R模型组和不同浓度(0.1μmol/L、1μmol/L和10μmol/L)Klotho作用H/R组。观察各组心肌细胞H/R前后搏动频率变化,利用MTT方法检测细胞存活率;测定各组心肌细胞H/R后LDH、CK、AST的漏出量及MDA含量、SOD活性;流式细胞术检测各组心肌细胞的凋亡率;real-time PCR检测各组心肌细胞中内质网应激标记及凋亡相关分子GRP78、CRT和CHOP和caspase-12 mRNA的表达情况;Western blot法检测心肌细胞内内质网应激凋亡蛋白CHOP和caspase-12蛋白表达及Akt磷酸化水平。结果:与正常对照组相比,H/R模型组中心肌细胞搏动频率和细胞存活率显著下降,细胞凋亡率显著升高(P0.05);LDH、CK、AST和MDA含量升高而SOD活性显著降低(P0.05);GRP78、CRT、CHOP和caspase-12 mRNA表达显著增高(P0.05);CHOP和caspase-12蛋白表达随之增高而Akt的磷酸化水平显著降低(P0.05)。与H/R模型组相比,抗衰老Klotho蛋白作用H/R心肌细胞后,心肌细胞搏动频率和细胞存活率显著升高,细胞凋亡率逐渐降低(P0.05),LDH、CK、AST和MDA含量下降而SOD活性显著增高(P0.05),GRP78、CRT、CHOP和caspase-12 mRNA的表达逐渐降低(P0.05),CHOP和caspase-12蛋白表达也随之降低,而Akt磷酸化水平显著增加(P0.05)。结论:抗衰老Klotho蛋白能够提升H/R损伤后心肌细胞的存活率,抑制细胞凋亡,通过抵抗氧化应激和过度内质网应激反应发挥作用,并与激活Akt磷酸化有关。     

沉默CHOP基因降低衣霉素诱导的小鼠肝癌Hepa 1-6细胞凋亡

目的构建有效针对小鼠C/EBP同源蛋白(CHOP)的shRNA真核表达载体,基因沉默后对Hepa 1-6细胞凋亡的影响。方法设计合成针对CHOP的shRNA靶序列及无同源性的shRNA序列作为阴性对照,退火后重组入p LKO.1-TRC载体,转化扩增后进行快速双酶切鉴定;慢病毒包装法转染293T细胞获得的病毒上清转染Hepa 1-6细胞,用含嘌呤霉素的培养基连续筛选10获得稳定株,Western blot检测Caspase9和c-PARP蛋白表达,流式细胞术检测细胞周期。结果各shRNA载体构建成功;与阴性对照组相比,sh CHOP组能显著抑制CHOP蛋白的表达(P0.05);且CHOP基因沉默后明显降低了衣霉素诱导的细胞凋亡(P0.05)。结论 CHOP基因沉默能减缓衣霉素诱导内质网应激产生的Hepa 1-6细胞凋亡。     

内质网应激在慢性间歇低氧幼鼠脑损害中的作用

目的:探讨内质网应激在慢性间歇低氧幼鼠脑损害中的作用机制及salubrinal的干预作用。方法:取SPF级健康雄性SD幼鼠64只,随机分为8组:间歇低氧(intermittent hypoxia,IH)2、4周组(2IH、4IH),对照(control,C)2、4周组(2C、4C),Salubrinal(SAL)干预2、4周组(2SAL、4SAL),二甲基亚砜(DMSO)溶剂对照2、4周组(2DMSO、4DMSO),每组8只。八臂迷宫测试各组幼鼠参考记忆错误(RME)、工作记忆错误(WME)及总错误(TE)次数,观察海马神经元凋亡变化,测定超氧化物歧化酶(SOD)活性,及内质网应激标志物C/EBP同源蛋白(CHOP)、磷酸化真核翻译起始因子2α(p-e IF2α)和磷酸化蛋白激酶R样内质网激酶(p-PERK)的蛋白水平。结果:与相应对照2C、4C组比较,间歇低氧2IH、4IH组幼鼠的RME、WME和TE升高(P0.01),海马神经元凋亡指数(AI)升高(P0.01),SOD活性下降(P0.01),p-PERK和CHOP蛋白水平升高(P0.01),p-e IF2α蛋白水平下降(P0.05),4周组最明显;与对应间歇性低氧2IH、4IH组比较,药物干预组2SAL、4SAL组RME、WME和TE次数下降(P0.05),AI下降(P0.01),SOD活性升高(P0.01),p-e IF2α的蛋白水平升高(P0.01),CHOP表达下降(P0.01)。结论:慢性间歇低氧可上调记忆相关脑区p-PERK表达,启动内质网应激,从而诱导CHOP所介导的细胞凋亡,可能在慢性间歇低氧所致脑损伤中起重要作用。Salubrinal选择性抑制e IF2α去磷酸化,下调CHOP蛋白的水平,提高SOD活性,从而缓解内质网应激,减轻氧化应激,减少细胞凋亡。     

尖吻蝮蛇毒抑瘤组分I通过PERK/eIF2α通路诱导Tca8113细胞凋亡的机制研究

目的:探讨内质网应激(ERS)相关的蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)/真核翻译起始因子2α(eIF2α)通路在尖吻蝮蛇毒抑瘤组分I(AAVC-I)诱导人舌鳞癌Tca8113细胞凋亡中的作用及机制。方法:不同实验浓度(4. 0、8. 0和16. 0 mg/L)的AAVC-I处理Tca8113细胞24 h后采用苏木素-伊红(HE)染色观察细胞形态;流式细胞术(annexin V-FITC/PI双荧光染色法)检测细胞凋亡;Western blot检测ERS相关蛋白葡萄糖调节蛋白78(GRP78),PERK/eIF2α通路中的磷酸化PERK(p-PERK)、磷酸化eIF2α(p-eIF2α)及下游的活化转录因子4(ATF4)和CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP),以及细胞凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的蛋白表达水平。结果:AAVCI各浓度组分别与正常对照组相比以及各浓度组之间相互比较的结果显示,随着AAVC-I浓度的增加,Tca8113细胞活力逐渐降低,细胞逐渐皱缩变小,间隙增大,胞核浓缩、碎裂,出现凋亡小体,细胞凋亡率增高(P0. 05);GRP78、p-PERK、p-eIF2α、ATF4、CHOP及Bax蛋白水平上调,Bcl-2表达下调(P0. 05)。结论:AAVC-I抑制Tca8113细胞活力的同时引发细胞发生ERS并诱导细胞凋亡,其诱导细胞凋亡的机制与PERK/eIF2α通路密切相关。     

氯沙坦通过激活AMPK抑制LPS诱导的小鼠海马GFAP表达

目的:探讨氯沙坦对脂多糖(LPS)诱导的星形胶质细胞活化标志物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达的影响,以及其机制是否与激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)有关。方法:将成年雄性昆明小鼠分为正常对照组、LPS模型组、氯沙坦给药组及氯沙坦与compound C合用组。侧脑室注射相同剂量LPS(24μg/d,每天1次,共2次),以建立中枢神经炎症损伤模型;氯沙坦(0.5、1或5 mg·kg~(-1)·d~(-1))于LPS注射前14 d开始连续每日腹腔注射给药;AMPK抑制剂Compound C(10 mg·kg~(-1)·d~(-1))于LPS注射前2 d开始连续每日腹腔注射给药。在LPS末次注射后的第3天取各组小鼠的海马脑区组织,利用Western blot法检测GFAP、AMPK、p-AMPK、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和p-mTOR的蛋白水平。结果:2次LPS注射后可显著诱导GFAP在海马脑区的表达(P0.01),而氯沙坦可浓度依赖地抑制LPS诱导的GFAP表达,当氯沙坦剂量为5 mg·kg~(-1)·d~(-1)时可显著抑制GFAP表达(P0.05),同时,在该剂量下,氯沙坦显著提高了AMPK的磷酸化水平(P0.01),但对mTOR的磷酸化水平无明显调节作用;而AMPK抑制剂Compound C可显著逆转氯沙坦对GFAP表达及AMPK磷酸化的调节作用(P0.05)。结论:氯沙坦可抑制LPS诱导的海马GFAP表达,该作用可能与其激活AMPK有关,但并不依赖于mTOR信号通路。     

氧化损伤对内皮细胞内质网应激相关蛋白表达的影响

目的:通过第三丁基过氧化氢(t-BHP)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs),建立体外氧化应激的细胞凋亡模型,观察氧化损伤对内皮细胞内质网应激(ER stress)相关蛋白表达的影响。方法:不同浓度t-BHP(25、50、100、200、400μmol/L)诱导HUVECs 1-24 h,MTT法观察t-BHP作用后细胞的存活率;Hoechst/PI染色荧光显微镜观测细胞凋亡形态;Western blotting检测ER应激标志物肌醇需求激酶1α(IRE1α)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)及凋亡蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)的表达情况。结果:不同浓度t-BHP(25、50、100、200、400μmol/L)诱导HUVECs 1-24 h后,发现随着t-BHP作用浓度的增加和时间的延长,细胞活力逐渐下降;不同浓度t-BHP处理8 h后,t-BHP大于25μmol/L时,细胞凋亡率明显增加(6.3%±0.6%、16.1%±0.9%、24.7%±1.5%、23.8%±1.3%,P0.05);ER应激相关信号蛋白IRE1α、磷酸化c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)及凋亡蛋白caspase-3表达增加。结论:氧化应激可导致内皮细胞发生凋亡,可能与引起内质网应激相关信号蛋白的表达有关。     

Nox1/4抑制剂减轻脂多糖致人脐静脉融合细胞的损伤

目的研究Nox1/4抑制剂对脂多糖致人脐静脉融合细胞EA.hy926损伤的保护作用及相关机制。方法将EA.hy926细胞分为对照组、LPS(脂多糖)组、Nox1/4抑制剂(GKT137831)+LPS组。CCK8法检测细胞活力;试剂盒检测培养液中乳酸脱氢酶(LDH)与一氧化氮(NO)的含量;免疫荧光法检测细胞内活性氧(ROS)的水平;ELISA检测细胞IL-1β、IL-6的分泌情况;Western blot检测细胞内内质网应激标志性蛋白表达水平。结果 LPS组较对照组比较,NO的释放量、ROS生成量以及炎性因子IL-1β和IL-6释放量明显增加(P0.05);使用Nox1/4抑制剂干预后,ROS产生以及NO、IL-1β和IL-6的释放量明显降低(P0.05)。与对照组相比,LPS组细胞内GRP78、p-PERK、ATF6和IREα蛋白表达上调,提示内质网应激被激活;Nox1/4抑制剂干预后,内质网应激标志性蛋白表达下降。结论 Nox1/4抑制剂减轻了LPS诱导的EA.hy926细胞内质网应激损伤。其作用机制可能是通过减少细胞内Nox1/4来源的ROS的生成,抑制内质网应激,进而减轻炎性反应,改善内皮功能。     

小窝蛋白1 对气道上皮细胞黏液高分泌的影响

目的:探讨小窝蛋白1(Cav-1)对脂多糖(LPS)诱导的气道黏液高分泌的影响。方法:体外培养人气道上皮细胞(16HBE),用LPS刺激细胞构建黏液高分泌模型,以Toll样受体4(TLR4)抑制剂E5564、核转录因子-κB(NF-κB)抑制剂PDTC、转染Cav-1质粒和siRNA为干预因素,将细胞随机分为对照组、LPS刺激组、LPS+Cav-1质粒组、LPS+Cav-1 siRNA组、LPS+阴性siRNA组、LPS+空质粒组、LPS+E5564组及LPS+PDTC组。四甲基偶氮唑盐法(MTT)检测各组细胞的活力;RT-PCR检测黏蛋白(MUC)5AC的转录水平;Western blot检测Cav-1、TLR4、磷酸化IκBα(p-IκBα)蛋白的相对含量;ELISA检测MUC5AC的分泌水平;激光共聚焦技术检测细胞内MUC5AC蛋白的分布和含量。结果:LPS刺激组细胞内TLR4、p-IκBα、NF-κB、MUC5AC转录及蛋白水平显著高于对照组(P值均0.05),过表达Cav-1可进一步增加上述指标的表达量,而下调Cav-1及给予E5564、PDTC可以抑制LPS引起的上述效应(P0.05)。结论:Cav-1可通过上调TLR4/NF-κB信号通路而加重LPS诱导的MUC5AC的表达量。     

SIRT1激活ERK1/2通路抑制大鼠心肌缺血再灌注时内质网应激相关蛋白的表达

目的 研究大鼠心肌缺血再灌注时沉默信息调节因子1(SIRT1)对心肌内质网应激相关凋亡的影响及其与ERK1/2信号通路的关系.方法 将大鼠随机分为6组:假手术组、缺血再灌注组、白藜芦醇+缺血再灌注组、白藜芦醇+ EX527+缺血再灌注组、白藜芦醇+PD98059+缺血再灌注组、PD98059+缺血再灌注组,每组12只.结扎大鼠冠状动脉左前降支建立大鼠心肌I/R损伤模型.TUNEL法检测心肌细胞凋亡;比色法检测LDH、CK-MB活性.实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测心肌GRP78、caspase-12和CHOP mRNA的表达;Western印迹检测SIRT1、caspase-12、CHOP、磷酸化ERK1/2和总ERK1/2蛋白的表达.结果 Res+ I/R组与I/R组相比,心肌凋亡指数降低(P＜0.05),血清LDH及CK-MB活性降低,内质网应激相关凋亡的指标GRP78、caspase-12及CHOP的蛋白表达量和mRNA均降低(P＜0.05);给予SIRT1抑制剂后与Res+ I/R组相比,以上指标升高;Res+ I/R组与I/R组相比,SIRT1及磷酸化ERK1/2蛋白的表达量均增加(P＜0.05);而Res+ EX+ I/R组与Res+ I/R组相比,SIRT1、磷酸化ERK1/2蛋白的表达量又降低(P＜0.05).结论 SIRT1能够抑制大鼠在体缺血再灌注心肌的内质网应激凋亡相关蛋白表达,发挥保护心肌的作用,其机制可能与ERK1/2通路激活有关.     

切应力通过Pim1/eNOS途径调节人脐静脉内皮细胞NO分泌

目的:探讨层流切应力是否可通过Pim1调节内皮型一氧化氮合酶(eNOS)活性,从而调节血管内皮细胞一氧化氮(NO)分泌。方法:体外原代培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),运用平行平板流动腔系统给HUVECs加载层流切应力(15 dyn/cm^2)。采用Western blot法检测Pim1蛋白表达及eNOS-Ser1177磷酸化水平;硝酸还原酶法检测NO分泌量;利用特异性小干扰RNA(siRNA)转染技术沉默Pim1基因后再检测上述指标的变化。结果:切应力作用HUVECs 15 min,可以显著上调Pim1蛋白表达(P<0.05),同时显著增强eNOS-Ser1177磷酸化水平(P<0.05),伴随HUVECs NO分泌显著增多(P<0.05)。转染siPim1可以抑制切应力诱导的Pim1表达(P<0.05),同时抑制eNOS-Ser1177磷酸化(P<0.05),NO分泌随之显著降低(P<0.05)。结论:流体切应力可能通过Pim1/eNOS途径调节血管内皮细胞NO分泌。