家养水牛催乳素基因外显子2多态性及其群体遗传特征

催乳素基因(prolactin gene,PRL)被视为与水牛产奶性状相关的重要候选基因,目前还未见有水牛PRL基因外显子2遗传特征的报道。本研究采用PCR-SSCP及PCR产物直接测序技术,检测了12个沼泽型水牛群体和3个河流型水牛群体共581个样本PRL基因外显子2的遗传变异。结果:水牛PRL基因外显子2由182个核苷酸组成,编码61个氨基酸,在进化上高度保守,测序结果显示沼泽型水牛群体中PRL基因外显子2有c.G192A替换,为同义替换,与泌乳性状之间没有显著相关性。在12个沼泽型水牛群体中均检测到该多态位点,PG基因频率在0.719～0.897之间,群体平均值为0.785±0.015,该基因为优势等位基因。Hardy-Weinberg平衡检测显示,10个沼泽型水牛群体处于平衡状态,而德宏水牛群体和福安水牛群体处于不平衡状态。在3个河流型水牛群体中,第192位碱基均为G,未检测到G>A替换。     

水牛κ-酪蛋白基因（CSN3）外显子4序列多态性研究

 分别设计位于CSN3 5个外显子旁侧引物,采用DNA测序法对沼泽型和河流型水牛CSN3编码区结构进行了分析,并对10个水牛群体共106个样本CSN3第4外显子序列进行了变异检测。结果表明,两类水牛CSN3编码区由848个核苷酸组成,包括ORF序列573 bp、5′-UTR序列69 bp和3′-UTR序列206 bp。在水牛CSN3第4外显子中共检测到4个SNP,其中c.445G>A,c.467C>T和c.516A>C为异义替换,导致相应的κ-CN成熟肽中氨基酸发生p.Val128Ile、p.Thr135Ile和p.Glu151Asp改变,c.467C>T和c.516A>C替换可能对κ-CN功能产生了影响。群体遗传分析表明,在河流型水牛中,等位基因c.445G、c.467C、c.471C和c.516A均为优势等位基因,而在沼泽型水牛中,仅c.445G、c.467C和c.471C为优势等位基因,河流型和沼泽型水牛的遗传差异主要体现在SNP516位点的群体遗传组成上。     

水牛前脑锌指蛋白（FEZL）基因外显子1多态性研究

试验根据已有的哺乳动物FEZL基因序列设计引物,采用PCR产物直接测序技术对河流型与沼泽型水牛共144头水牛（属于10个群体）的FEZL基因第1外显子进行了序列测定和比较分析。结果表明,水牛FEZL基因第1外显子长度为907bp,水牛群体中FEZL基因第1外显子存在1个SNP（c．165G〉A）,属于同义替换,其buffalo。等位基因在群体中已接近固定;河流型和沼泽型两类水牛群体中FEZL基因第1外显子多个连续的甘氨酸残基编码区都为13G类型;水牛与普通牛、人、小鼠、马、猪和狗的FEZL基因第1外显子序列差异较大,推测水牛的FEZL在功能上可能与普通牛等其他物种存在差异;尽管两类水牛连续的甘氨酸残基编码区都为13G类型,但其可能与水牛乳腺炎易感性无直接关联。研究结果可为水牛乳腺炎的抗病育种提供遗传背景资料。     

河流型与沼泽型水牛FSHR基因密码子偏好性分析

为了确定河流型与沼泽型水牛促卵泡素受体(FSHR)基因密码子的使用模式,试验采用PCR产物直接测序法对9头河流型水牛、15头沼泽型水牛、6头大额牛和6头中甸牦牛的FSHR基因编码区序列进行了群体变异检测和单倍型划分,并结合已发表的普通牛、野牛、山羊、绵羊、人和黑猩猩的同源序列,对河流型与沼泽型水牛FSHR基因密码子使用的偏好性及与其他物种的差异进行了探讨。结果表明:两类水牛FSHR基因的密码子使用特征较为相似,河流型与沼泽型水牛分别有28个和27个偏好使用的密码子,对于编码Pro的4个密码子CCC、CCA、CCU和CCG而言,河流型水牛偏好使用CCC和CCA,而沼泽型水牛偏好使用CCC。水牛与其他物种共同偏好使用的密码子有20种,均偏好使用以G/C结尾的密码子。基于密码子的同义密码子相对使用度(RSCU)构建的聚类树显示河流型水牛与沼泽型水牛先聚为一类,再与大额牛、牦牛聚为一类,普通牛与山羊、绵羊和野牛聚为一类,人和黑猩猩聚为一类,揭示聚为一类的物种间在密码子使用上的偏好性较相似。     

河流型与沼泽型水牛LEP基因同义密码子使用特征分析

为了了解影响泌乳性状的重要编码基因LEP基因的密码子使用特征,试验以27头河流型水牛和41头沼泽型水牛为研究对象,并以从NCBI数据库中下载的普通牛、野牦牛、野牛、绵羊、山羊、小鼠和人的序列作对照,对两类水牛LEP基因的同义密码子使用偏好性及水牛与其他物种间LEP基因密码子使用的差异和进化关系进行深入分析。结果表明:两种类型水牛LEP基因密码子使用特征相似,河流型和沼泽型水牛LEP基因均有25个偏好使用的密码子;其中两类水牛LEP基因偏好性较强的密码子均为UUC、CUG、AUC、GUC、UCC、ACC、GCC、CAC、CGG、AGG和GGG(RSCU≥2.00)。河流型水牛CCA和CCG密码子的RSCU值分别为0.09和0.35,而沼泽型水牛分别为0.34和0.10。此外,所有物种LEP基因均偏好使用以G/C结尾的密码子,但不同物种之间偏好使用密码子种类和数目均有差异。密码子使用偏好聚类分析表明,河流型与沼泽型水牛亲缘关系最近,聚为一类,然后依次与其他牛、绵羊、山羊、小鼠和人等物种相聚。在密码子使用频率上,LEP基因与小鼠密码子偏好性差异小于与大肠杆菌和酵母密码子偏好性的差异,说明小鼠更适合作为水牛LEP基因的外源表达系统。     

中国牛亚科家畜GH基因编码区序列的遗传变异研究

采用PCR产物直接双向测序法,分段扩增普通牛、瘤牛、牦牛、大额牛和亚洲水牛共5个牛种的GH基因,并拼接成编码区全序列,分析中国牛亚科家畜不同牛种GH基因编码区序列变异及其分子进化特征。结果表明,牛GH基因编码区序列全长654bp,种间核苷酸突变率在0．1％～1．84％。5个牛种编码区序列定义了10种单倍型,瘤牛的单倍型多样性最高,大额牛和水牛均无单倍型多样性。GH基因编码区序列的密码子使用存在偏倚性,共发现了25个偏好性密码子。核苷酸的替代以转换为主,转换明显高于颠换,转换／颠换比为3．0。非同义突变位点远远少于同义突变位点,同义与非同义替代发生的速率比都小于或等于1,表明GH基因编码区序列不受达尔文正选择的影响。以GH基因单倍型序列为基础的分子进化树表明,水牛与普通牛、瘤牛、牦牛、大额牛间分化很明显;普通牛、瘤牛、牦牛、大额牛间序列分化并不明显,并且它们共同拥有一条相同的祖先核苷酸序列。说明中国牛亚科家畜GH基因编码区序列的变异相当贫乏,并且由于功能的约束表现得相当保守,进化速率相当缓慢。     

水牛FASN基因外显子37多态性及其生物信息学分析

[目的]脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase,FASN)是影响哺乳动物脂肪酸合成的关键酶,但有关水牛FASN基因的群体遗传组成特征还不清楚。[方法]本研究采用PCR产物直接测序法和PCR-SSCP方法对88头河流型和122头沼泽型水牛、54头牦牛和40头大额牛FASN基因外显子37进行群体变异检测,并结合已发表的牛科物种序列进行生物信息学分析。[结果]结果表明,仅在水牛中发现2个SNP位点,为c.6363CT和c.6372CT,均为同义替换。河流型和沼泽型水牛共享这2个SNP位点,但它们在两类水牛中的群体遗传组成不同。确定水牛特有的核苷酸位点3个,即c.6183A,c.6255T和c.6394A,其中c.6394A导致水牛FASN蛋白第2132位氨基酸与其它牛科物种不同,在水牛中为M而其它牛科物种中为V;山羊特有的位点2个,为c.6189A和c.6267T。普通牛、山羊和绵羊中具有异义替换SNP位点,分别为1个、3个和7个。普通牛的异义替换SNP位点c.6365GA对蛋白质功能影响不显著(subPSEC-3);山羊的这些异义替换SNP位点c.6296TC、c.6301CT和c.6341TC对其蛋白质功能影响均有显著影响(subPSEC-3);绵羊7个异义替换SNP位点中的2个,即c.6286AC和c.6406AG对FASN功能有显著影响(subPSEC-3)。[结论]这些核苷酸差异引起的氨基酸差异可能引起不同牛科物种间FASN功能的差异。     

水牛瘦素受体基因密码子使用偏好性分析

试验选取27头河流型水牛和41头沼泽型水牛,以从NCBI数据库中下载的家牛、野牦牛、野牛、绵羊、山羊、小鼠和人的序列作对照,对编码瘦素受体（leptin receptor,LEPR）基因的密码子偏好性及水牛与其他物种间密码子使用的差异和进化关系进行了深入分析。结果发现,所有的密码子在河流型水牛和沼泽型水牛LEPR基因中均有使用,两种类型水牛偏好使用的密码子有28个,其中使用偏好性较强的密码子为AGA（RSCU≥2）,表明河流型水牛和沼泽型水牛LEPR基因密码子使用特征相似。水牛及参考物种LEPR基因均偏好使用以A/U结尾的密码子,但水牛与其他参考物种间偏好使用密码子的种类和数目有差异。密码子使用偏好聚类分析表明,河流型水牛与沼泽型水牛亲缘关系最近,先聚为一类,然后与家牛、野牦牛和野牛聚为一类,再与绵羊、山羊、小鼠和人等物种聚为一类。在密码子使用频率上,河流型水牛LEPR基因与酵母密码子偏好性差异小于与大肠杆菌和小鼠密码子偏好性差异,从而揭示酵母更适合作为水牛LEPR基因的外源表达系统。     

吐鲁番黑羊MC1R基因序列分析研究

为研究黑皮质素受体1（MC1R）基因对吐鲁番黑山羊毛色的影响,试验采用PCR扩增和测序技术,对吐鲁番黑羊MC1R基因编码区核苷酸序列及其与毛色的相关性进行了研究。结果表明：MC1R基因编码区核苷酸序列954 bp,编码317个氨基酸,编码区存在2个错义突变（c.218 T〉A,p.73 Met〉Lys;c.361 G〉A,p.121 Asp〉Asn）和3个同义突变（c.429 C〉T,p.143 Tyr〉Tyr;c.600 T〉G,p.200 Leu〉Leu;c.735 C〉T,p.245 Ile〉Ile）。SNPs分析表明,单倍型AATGT数量占62%。初步认为MC1R基因可以作为吐鲁番黑羊黑色被毛调控的候选基因。     

摩拉水牛和尼里-拉菲水牛PRKAA2基因SNPs检测及遗传多样性分析

为研究水牛蛋白激酶AMP活化的催化亚基α2（protein kinase AMP-activated catalytic subunit alpha 2,PRKAA2）基因多态性,本试验以摩拉水牛和尼里-拉菲水牛基因组DNA为模板,扩增PRKAA2基因外显子4及内含子3部分序列,通过常规测序法检测其SNP并进行遗传多样性分析。结果发现,PRKAA2基因外显子4内存在1个SNP位点（c.462 G>A）,PRKAA2基因内含子3部分序列存在3个SNPs位点（IVS3.557 T>C、IVS3.560 C>T和IVS3.565 G>A）。经遗传多样性分析表明,在c.462 G>A位点的野生纯合型和杂合型比突变纯合型更有优势,IVS3.557 T>C和IVS3.560 C>T位点的突变纯合型为非优势基因型,IVS3.565 G>A位点杂合型为优势基因型。IVS3.565 G>A位点在摩拉水牛群体中处于Hardy-Weinberg非平衡状态;c.462 G>A位点在尼里-拉菲水牛群体中处于Hardy-Weinberg非平衡状态。4个SNPs位点在摩拉水牛群体中均为中度多态;c.462 G>A、IVS3.557 T>C位点在尼里-拉菲水牛群体中为低度多态,IVS3.560 C>T、IVS3.565 G>A位点为中度多态。IVS3.557 T>C位点在两个水牛群体中杂合度较低。说明摩拉水牛IVS3.565 G>A位点和尼里-拉菲水牛c.462 G>A位点的基因型频率和基因频率遗传状态不平衡,尼里-拉菲水牛群体中IVS3.557 T>C位点遗传变异小,选择潜力不高。4个多态位点可以构建5种单倍型,其中T-C-G-G是摩拉水牛群体和尼里-拉菲水牛群体的优势单倍型。综上,本研究检测的摩拉水牛和尼里-拉菲水牛PRKAA2基因上4个SNPs位点可为水牛标记辅助选择育种提供参考。     

Analysis of Codon Usage Bias of Leptin Receptor Gene in Buffalo

The experiment was aimed to study the synonymous codon usage features of leptin receptor (LEPR) gene in buffalos, the codon usage differences and evolutionary relationships between buffalo and other reference species. The coding region of LEPR gene from 27 river buffalo and 41 swamp buffalo were sequencing,and Bos taurus,Bos mutus,Bos bison,Ovis aries,Capra hircus,Mus musculus and Homo sapiens were chosen as reference species from NCBI database. The results showed that all synonymous codons were used in the LEPR gene of river buffalo and swamp buffalo. Two kinds of buffalo had 28 biased usage codons. Among them,strongly biased codon was AGA (RSCU≥2),which indicated that codon usage features were similar in LEPR gene of two types of buffalo. Furthermore,buffalo and the species compared in this study were bias toward the synonymous codons with A/U at the third codon position in LEPR gene.However,the types and numbers of bias usage codons were different between buffalo and the species compared. Clustering analysis showed that the relationship between river buffalo and swamp buffalo was the closest,and they gathered into one group firstly,then they gathered with Bos taurus,Bos mutus and Bos bison,and further gathered in turn with Ovis aries,Capra hircus,Mus musculus and Homo sapiens.The frequency differences of synonymous codon usage between buffalo LEPR gene and yeast genome were less than that between buffalo and E.coli,Mus musculus genome,suggesting that yeast might be more suitable as an external expression system for buffalo LEPR gene.     

水牛黑色素皮质素1受体基因克隆、生物信息学分析及表达模式研究

本试验旨在对水牛黑色素皮质素1受体(MC1R)基因进行克隆、生物信息学分析及表达模式研究。参考牛MC1R基因(GenBank登录号:JN123363.1)序列设计引物,以本地沼泽水牛、白沼泽水牛、摩拉水牛和黄牛基因组DNA为模板,应用PCR方法扩增克隆MC1R基因片段并进行测序分析。运用QRT-PCR方法检测摩拉水牛、沼泽水牛、白沼泽水牛和黄牛皮肤组织中MC1R基因的表达模式,并通过Western blotting方法检测沼泽水牛和白沼泽水牛MC1R基因的蛋白表达差异。结果表明,应用PCR方法成功克隆了水牛MC1R基因,其编码区全长954 bp,共编码317个氨基酸。测序分析后发现沼泽水牛、白沼泽水牛、摩拉水牛和黄牛MC1R基因的核苷酸序列和氨基酸序列相似性很高。沼泽水牛与白沼泽水牛在476、618、881、930和931 bp位点上分别发生T→C、G→C、G→A、G→A和A→G突变,导致了沼泽水牛和白沼泽水牛第159位氨基酸由丝氨酸变成苯丙氨酸,第310位氨基酸由谷氨酸变成丙氨酸,第294位氨基酸由天冬氨酸变成丙氨酸,发生了非同义突变。QRT-PCR结果发现,MC1R基因在摩拉水牛、沼泽水牛和黄牛皮肤组织中的相对表达量均显著高于白沼泽水牛(P<0.05);Western blotting分析结果显示,沼泽水牛皮肤组织中MC1R蛋白的表达量高于白沼泽水牛。综上所述,白沼泽水牛MC1R基因的编码区发生氨基酸位点突变,且相对表达量和蛋白表达量均低于沼泽水牛,推测此为白沼泽水牛体内合成的黑色素缺失而导致毛色白化的主因。     

我国首例本土河流型水牛——槟榔江水牛的种质特征

槟榔江水牛在云南西部槟榔江上游的腾冲县饲养已有500年以上的历史。该水牛经过长期闭锁繁育和风土驯化，已适应当地亚热带气候环境，是我国发掘的首例本土河流型水牛类群。具有典型的河流型水牛体型外貌特征，但体型相对较小。遗传学分析表明：槟榔江水牛体细胞核型染色体数多为2n=50；其群体内遗传变异水平较高，遗传多样性丰富；该水牛与河流型水牛表现出较近的遗传关系，与沼泽型水牛遗传关系较远；确认在群体遗传组成和血统来源上，该水牛由差异十分明显的河流型和沼泽型两个世系所构成，但河流型水牛世系在该水牛群体中占主体，揭示该水牛存在一定的沼泽型水牛基因渗入。生产性能测定结果显示：该水牛一个泌乳期泌乳量为（2452．2±553．8）kg，比河流型摩拉和尼里一拉菲水牛高8．4％～15．0％，比沼泽型本地乳用水牛高124．4％～140．3％；且其乳质佳，乳蛋白率和乳脂率分别为4．60％和6．82％。该水牛在2008年经国家畜禽遗传资源委员会颁布为我国遗传资源的牛种之一，发展前景看好，将有望培育成中国首个河流型乳用水牛新品种。     

Cloning,Bioinformatics and Expression Pattern Analysis of Buffalo MC1R Gene

The aim of this study was to clone and analyze the expression pattern of buffalo MC1R gene.A pair of specific primers was designed according bovine MC1R sequence (GenBank accession No.:JN123363.1),with genome DNA of swamp buffalo,White swamp buffalo,Murrah buffalo and Yellow cattle as template,MC1R was amplified by PCR.Then relative expression level of MC1R gene of swamp buffalo,White swamp buffalo,Murrah buffalo and Yellow cattle was analyzed using QRT-PCR,and protein expression was detected by Western blotting method.The results showed that the 954 bp coding region of buffalo MC1R gene was successfully cloned and sequenced,which code for 317 amino acids.The MC1R gene nucleotide sequences and amino acid sequences of swamp buffalo,White swamp buffalo,Murrah buffalo and Yellow cattle were highly conserved.Five polymorphic sites were found between White swamp buffalo and swamp buffalo of MC1R gene,including 476 T→C,618 G→C,881 G→A,930 G→A and 931 A→G,which caused three nonsynonymous mutation sites of Phe159Ser,Glu310Ala and Asp294Ala.The QRT-PCR result showed that relative expressions of MC1R gene of Murrah buffalo,swamp buffalo and Yellow cattle were significant higher than that of White swamp buffalo (P<0.05).The Western blotting results revealed that MC1R protein expression level in swamp buffalo was higher than that of White swamp buffalo.In conclusion,there were amino acids mutation in White swamp buffalo MC1R gene,and MC1R gene relative expression of White swamp buffalo was lower than that of other buffalo,which was the main reason of lacking of melanin production in White swamp buffalo.     

利用微卫星DNA标记分析槟榔江水牛群体遗传特征

槟榔江水牛是近年在我国云南西部发现的第一个本土河流型水牛.为了揭示其群体遗传多样性、群体遗传组成、其与河流型和沼泽型水牛的遗传关系及沼泽型水牛对该水牛的基因渗入等重要遗传背景信息,本研究采用30个微卫星DNA标记对141份槟榔江水牛样品和对照群体24份河流型水牛(摩拉水牛)样品、41份沼泽型水牛(滇东南水牛)样品进行了检测分析.结果,在槟榔江水牛群体中共检测到253个等位基因,其中,54个为3个群体所共享的等位基因,58个为只在槟榔江水牛与摩拉水牛间共享的等位基因,73个为只在槟榔江水牛与滇东南水牛间共享的等位基因,其余68个等位基因为该群体所独有.槟榔江水牛平均等位基因数、平均表观杂合度、平均期望杂合度和多态信息含量等参数均显著高于对照组群体,分别为8.433 3、0.640 5、0.600 9和0.594 7.该水牛群体近交系数FIS值为0.061 9.槟榔江水牛与摩拉水牛间的DA遗传距离为最小(0.114 4),在NJ树上聚为一支;而滇东南水牛与槟榔江水牛和摩拉水牛间的遗传距离较大(分别为0.382 9和0.555 3),其在NJ树上单独聚为一支.群体遗传结构分析显示,槟榔江水牛遗传组分为河流型与沼泽型2种类型水牛混合的模式(当K=2时),整个群体中有相当数量的个体存在沼泽型水牛的遗传渗入(群体中沼泽型水牛遗传组分为0.067 2).结果揭示,槟榔江水牛遗传资源独特,群体遗传多样性丰富,但该群体杂合子缺乏,且存在一定沼泽型水牛的基因渗入.