小西葫芦花叶病毒(ZYMV)抗血清制备及检测技术研究

从小西葫芦黄化花叶病毒(ZYMV)免疫的母鸡蛋卵黄和兔抗血清中分别提取免疫球蛋白IgY和IgG,用多种血清学方法进行检测。结果表明,免疫鸡和兔25d后,鸡蛋卵黄IgY和兔抗血清的效价分别达到1/64和1/512。在琼脂扩散试验中,当抗体稀释28倍时,与抗原反应无明显沉淀线。在胶乳凝集试验中,抗体稀释210倍时,与抗原反应无明显凝集物。ELISA法以辣根过氧化酶标记抗体IgY和IgG,用双抗夹心法成功地检测出了ZYMV,当抗体稀释106倍时,与抗原反应仍呈阳性。免疫电镜方法检测ZYMV,较一般血清学方法可多捕捉50倍的病毒颗粒。     

抗大肠杆菌O157鸡卵黄抗体的酶联免疫吸附试验

以灭活大肠杆菌(E.coli)O157为抗原免疫产蛋鸡获得抗E.coliO157卵黄抗体(IgY),建立了该抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法。并研究了包被温度和时间及不同卵黄前处理方法对ELISA检测的影响,所获得的最佳检测条件为:以浓度为108~109/mL的灭活E.coliO157为抗原进行包被,4℃包被19h,水稀释法对卵黄进行前处理,然后检测其中的IgY效价。该方法简便可靠,适于对大肠杆菌特异性抗体IgY的动态检测和批量检测。     

间接ELISA法检测贝氏隐孢子虫特异性IgY抗体的研究

应用蔗糖密度梯度离心法纯化贝氏隐孢子虫卵囊,冰浴超声波破碎、反复冻融卵囊,低温离心获得贝氏隐孢子虫卵囊蛋白质抗原.免疫产蛋鸡,6次免疫后获得高免特异性卵黄抗体IgY.制备辣根过氧化物酶(HRP)标记免抗鸡IgG,其最佳工作浓度为1:4 000～1:6 000,贝氏隐孢子虫卵囊抗原包被浓度8.15 mg·L-1,4℃包被过夜(≥10 h);1×106mg·L-1 BSA-PBST稀释卵黄,建立了检测抗贝氏隐孢子虫特异性卵黄抗体的间接ELISA方法.     

猪产肠毒素大肠杆菌987P菌毛卵黄抗体的研究

【目的】探索产肠毒素大肠杆菌（ETEC）987P菌株培养的最佳条件及987P菌毛诱发蛋鸡制备卵黄抗体（IgY）的最佳免疫程序,为IgY的工业化、规模化生产提供参考。【方法】扩大培养987P菌株,抽提层析纯化987P菌毛蛋白,然后以其为抗原免疫20周龄开产海兰蛋鸡,采用间接ELISA检测987P菌毛蛋白免疫IgY效价。【结果】987P菌株的最佳培养条件为37℃下Slanctz固体培养基培养24 h;以纯化987P菌毛蛋白为抗原免疫20周龄开产蛋鸡,发现987P菌毛蛋白二免、三免IgY效价总体趋势基本一致,均在第3周达到峰值并维持1周,二免抗体峰值为213,三免抗体峰值是二免峰值的2倍（214）,但第4周过后三免IgY效价仍保持在213,且持续时间长,一般维持2～3周。【结论】以纯化987P菌毛蛋白为抗原免疫蛋鸡,能获得较高效价的IgY,且适当增加免疫次数能有效提高抗体水平和延长持续时间。     

猪产肠毒素大肠杆菌_（987）P菌毛卵黄抗体的研究

【目的】探索产肠毒素大肠杆菌（ETEC）987P菌株培养的最佳条件及987P菌毛诱发蛋鸡制备卵黄抗体（IgY）的最佳免疫程序,为IgY的工业化、规模化生产提供参考。【方法】扩大培养987P菌株,抽提层析纯化987P菌毛蛋白,然后以其为抗原免疫20周龄开产海兰蛋鸡,采用间接ELISA检测987P菌毛蛋白免疫IgY效价。【结果】987P菌株的最佳培养条件为37℃下Slanctz固体培养基培养24h;以纯化987P菌毛蛋白为抗原免疫20周龄开产蛋鸡,发现987P菌毛蛋白二免、三免IgY效价总体趋势基本一致,均在第3周达到峰值并维持1周,二免抗体峰值为213,三免抗体峰值是二免峰值的2倍（214）,但第4周过后三免IgY效价仍保持在213,且持续时间长,一般维持2～3周。【结论】以纯化987P菌毛蛋白为抗原免疫蛋鸡,能获得较高效价的IgY,且适当增加免疫次数能有效提高抗体水平和延长持续时间。     

猪产肠毒素大肠杆菌987P菌毛卵黄抗体的研究

【目的】探索产肠毒素大肠杆菌(ETEC)987P菌株培养的最佳条件及987P菌毛诱发蛋鸡制备卵黄抗体(IgY)的最佳免疫程序,为IgY的工业化、规模化生产提供参考。【方法】扩大培养987P菌株,抽提层析纯化987P菌毛蛋白,然后以其为抗原免疫20周龄开产海兰蛋鸡,采用间接ELISA检测987P菌毛蛋白免疫IgY效价。【结果】987P菌株的最佳培养条件为37℃下Slanctz固体培养基培养24h;以纯化987P菌毛蛋白为抗原免疫20周龄开产蛋鸡,发现987P菌毛蛋白二免、三免IgY效价总体趋势基本一致,均在第3周达到峰值并维持1周,二免抗体峰值为213,三免抗体峰值是二免峰值的2倍(214),但第4周过后三免IgY效价仍保持在213,且持续时间长,一般维持2～3周。【结论】以纯化987P菌毛蛋白为抗原免疫蛋鸡,能获得较高效价的IgY,且适当增加免疫次数能有效提高抗体水平和延长持续时间。     

高免卵黄抗体粗提条件优化及稳定性检测

对高免卵黄抗体(IgY)粗提过程中的水稀释倍数、pH值和4℃下温浴时间等环节进行优化试验,检测纯化后IgY的稳定性.结果表明:IgY的最适粗提条件为卵黄稀释倍数7倍,卵黄稀释液pH值5.0,4℃下温浴5 h,纯化后的IgY活性在低于70℃下处理15 min,3次以内的反复冻融及pH值4~7范围等条件下几乎不受影响.     

K88-K99-987P和K88-K99-F41佐剂苗对鸡免疫效果的比较

将猪致病性大肠杆菌K88-K999-87P和K88-K99-F412种混合菌液分别与不同的佐剂(弗氏佐剂、白油佐剂、氢氧化铝和磷酸缓冲盐溶液)混合制成8种灭活疫苗免疫产蛋鸡4次,经水稀释、絮凝澄清、盐析及亲和层析制备特异性卵黄免疫球蛋白(IgY),用SDS-PAGE检测抗体纯度和分子量、酶联免疫吸附实验(ELISA)测定抗体滴度。结果表明,与氢氧化铝乳胶苗和水苗相比,弗氏佐剂苗和白油苗均能诱导并产生稳定、高活性卵黄抗体,免疫蛋鸡所制得抗体的滴度比未免疫蛋鸡分别提高32和16倍。IgY在温度低于60℃和pH值4~8时比较稳定,胃蛋白酶在不同pH下对IgY的活性影响显著。抑菌实验表明IgY能有效抑制大肠杆菌的生长。     

抗犊牛支原体肺炎卵黄抗体的制备

以灭活的支原体免疫高产母鸡,用分离、匀浆的方法制备高效价卵黄抗体,并应用间接血凝检测鸡卵黄中免疫球蛋白(Immunoglobulin of egg yolk,IgY)的活性。结果显示灭活的支原体能诱导鸡产生高效价的抗体,且效价高达4.096×103,经上述简单、实用的路线,制备出了高纯度的IgY。卵黄是一种含量高、经济的特异性抗体源,可为犊牛支原体肺炎的防治提供新的途径。     

抗小鼠H-Y抗原IgY抗体的纯化

用Ni—NTA柱纯化SMCY重组蛋白,将该蛋白作为配基偶联至CNBr活化的Sepharose 4B制成亲和层析柱,分离纯化抗H—Y抗原的特异性IgY抗体。结果表明：Ni—NTA柱纯化后,SMCY重组蛋白纯度可达到80％左右;亲和层析柱纯化可以使IgY抗体的纯度达到97％,经免疫组化检测,该抗体能够结合与雄性小鼠肝脏细胞表面,而不与雌性小鼠肝脏细胞发生结合。证实了经过纯化得到的高纯度IgY抗体具有很好的抗H—Y抗原特异性。通过该方法可纯化分离得到高纯度抗H—Y抗原IgY抗体。     

Preparation and physicochemical property of chicken yolk immunoglobulin (IgY) against porcine transmissible gastroenteritis virus (TGEV)

Oral administration of immunoglobulin prepared from the egg yolk of hens immunized with porcine transmissible gastroenteritis virus (TGEV) has been demonstrated to reduce piglets mortality significantly in our previous studies. In the present study, we investigated the stability of chicken yolk immunoglobulin (IgY) specific to TGEV by measuring the remaining activity by ELISA. The results showed that the IgY was stable between pH 4 and pH 11. In the incubation with pepsin at pH 4 and pH 6, about 90% and 100% of the IgY activity remained, respectively. IgY activity could remain approximately 80% at 60°C for 30 min, suggesting that pasteurization can be applied to sterilizing the product. The stability of IgY at 25°C and freezing-thawing treatment indicated that the IgY was easy to be conserved. These results highlight the attractive potential application of IgY as the antibodies of oral administration for treatment of TGEV infections.     

抗鹅IgY抗血清制备及在ELISA中的应用

为制备鹅免疫球蛋白特异性抗体,通过主动免疫兔子制备了抗鹅ＩｇＹ抗血清,并在ＥＬＩＳＡ中比较分析了该抗血清的应用效果．结果显示,将制备的抗鹅ＩｇＹ抗血清作为二抗,当抗原包被浓度（１６μｇ／ｍＬ）和血清（１∶１６００）、抗鹅ＩｇＹ抗血清（１∶５１２００）与酶标抗体（１∶２０００）稀释到合适浓度时,在ＥＬＩＳＡ检测鹅抗体水平中呈现出良好效果,其特异性和灵敏度明显好于以兔抗鸡ＩｇＹ作为替代二抗．结果表明所制备的抗鹅ＩｇＹ抗血清在鹅相关的酶联免疫研究方法中是合格和有效的．     

卵黄免疫球蛋白的提取及其体外抑菌作用的研究

对卵黄免疫球蛋白(IgY)的提取工艺及其抑菌作用进行研究。采用水稀释法脱除卵黄中的脂类,确定最佳除脂条件为:水稀释倍数6倍;采用硫酸钠盐析法与凝胶层析法对卵黄进一步纯化,得到纯度为97%的IgY。用不同质量浓度的IgY对大肠杆菌进行抑菌试验,发现高质量浓度IgY的抑菌效果要优于低质量浓度的抑菌效果,以10g/L的抑菌率最高,为74.3%。     

嗜水气单胞菌Aer毒素和胞外蛋白酶卵黄抗体的制备

为克服嗜水气单胞菌不同血清型对卵黄抗体免疫保护效果的影响,从嗜水气单胞菌中提取其主要致病因子Aer毒素和胞外蛋白酶(ECPase),验证其生物学活性,分别免疫蛋鸡。用辛酸-硫酸铵法粗提卵黄抗体,用间接ELISA法测其效价、鉴定抗体与不同来源嗜水气单胞菌主要致病因子的交叉反应。结果表明,抗Aer毒素和抗ECPase卵黄抗体效价最高分别可达1∶213和1∶212,与其他来源嗜水气单胞菌交叉反应性强。     

五龙鹅IgY、IgM分子特性研究

为丰富和完善鹅Ig分子特性的研究,以层析、离子交换等方法分离纯化五龙鹅的免疫球蛋白及重链、轻链、Fab段、Fc段,进行鹅Ig的多态性、分子质量、氨基酸组成、稳定性等分子特性研究。结果表明:五龙鹅IgY存在几个亚类,总分子质量为166ku,重链约为60ku,轻链约为23.5ku;鹅IgM的重链分子质量分别为51.72、48.30和44.09ku,轻链20.30ku,所以,总分子质量约为660~740ku;五龙鹅Ig重链的分子质量均小于鸡、鸭;IgY的Fab段分子质量为48.67ku,Fc段为68.62ku。IgY的重链和轻链中碱性氨基酸摩尔分数小于酸性氨基酸,为酸性蛋白质,而IgM则为碱性蛋白质;IgY中Cys摩尔分数为2.25%,IgM为3.26%;鹅IgY的重链和轻链中Pro的摩尔分数相差较大,分别为7.69%和0.10%;鹅IgY在pH3.5~11.5的范围内十分稳定,IgM在pH4.0~10.5的范围内稳定,IgM的酸碱稳定性小于IgY,但在pH3.5~4.5时活性增加5%~8%;研究表明五龙鹅IgY热稳定性较差,热变性反应级数为1.2。     

鸡抗小鹅瘟病毒IgY提取方法的比较试验

为了建立一套规范的鸡抗小鹅瘟病毒IgY的提取方法,试验采用水化法和辛酸法分别提取IgY,研究各种因素对IgY提取效果的影响,对2种方法提取的鸡抗小鹅瘟病毒IgY进行指标检测。结果表明：水化法提取的IgY的蛋白含量为18.611mg/mL,效价为1∶16,辛酸法提取的蛋白含量为18.630mg/mL,效价为1∶16,且2种IgY的纯度基本相同,判定2种方法的提取效果基本相同。     

海藻酸钙微胶囊包埋IgY及其释放特性研究

卵黄免疫球蛋白(IgY)是一种高活性的口服抗体,与人体健康密切相关。为最大限度保留IgY的生物活性,提高其稳定性,以海藻酸钠为主要壁材,使用锐孔-凝固浴法包埋IgY制备凝胶珠。以包埋率和载药量为主要指标,利用响应面法探究IgY-海藻酸钙凝胶珠的最佳制备工艺,并利用体外胃肠道消化模型评估凝胶珠释放效果。结果显示:当海藻酸钠为28.30 g·L^-1,氯化钙为10.80 g·L^-1,芯壁比(质量比)为0.46∶1时,新鲜制备得到的IgY-海藻酸钙凝胶珠成型效果较好,包埋率为(53.30±1.55)%,载药量为(10.90±0.26)%。通过宏观形态观察,凝胶珠颗粒具有较好的圆整性和均一性,粒径约为(2.10±0.05) mm,硬度为(4 396.87±331.62) g。干燥后的凝胶珠在模拟胃液中2 h后溶胀度为0.94±0.39,IgY累积释放率约在(11.10±3.20)%,在模拟肠液中2 h后,溶胀度持续增加至4.81±0.32,IgY累积释放率达(97.10±2.40)%以上。因此,IgY-海藻酸钙凝胶珠在胃液中具有缓慢释放芯材的作用,IgY在肠液中能基本全部释放。     

Prophylactic and therapeutic effects of egg yolk immunoglobulin against porcine transmissible gastroenteritis virus in piglets

Porcine transmissible gastroenteritis virus (TGEV) is the causative agent of acute diarrhea of newborn piglets that provokes high mortality rates in affected farms. In this study, specific immunoglobulin from egg yolk against TGEV was produced by immunization of White leghorn hens. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and virus neutralization (VN) test revealed that the specific antibody titer started to increase on the tenth day post-immunization, reached its peak on the eighth week, and remained at a high level until the last week that we tested. The prophylactic and therapeutic effects of egg yolk immunoglobulin (IgY) was investigated in piglets. IgY was found effective to increase piglets survival rate significantly after challenge exposures in prophylactic efficacy analysis. The therapeutic effects test revealed that the mortality was dramatically reduced by orally administered IgY. All these results in our study indicated that IgY specific to TGEV could be an alternative prophylactic method like colostral antibodies against TGEV in piglets.